龙眼成花逆转花芽α-tublin基因的克隆与原核表达

运用蛋白质组学方法比较龙眼(Dimocarpus longan Lour.)正常成花和成花逆转花芽的差异蛋白质组,并应用RACE方法克隆其中上调表达的α-微管蛋白基因α-tubulin,获得一段长度为1641 bp的cDNA,其中包括1个1350 bp的开放阅读框[GenBank登录号: FJ479617(GI：218202929)]。将α-tubulin全长cDNA在大肠杆菌中表达,获得1个约49.6 kD的外源蛋白,经Western blotting验证为α-微管蛋白。RT-PCR和Western blotting分别检测了α-tubulin在转录和翻译水平上的表达, 结果表明,α-微管蛋白在成花逆转的龙眼花芽中上调表达,可能是逆转花芽形态差异表现的原因之一。     

水蕨中心体蛋白基因的克隆与原核表达

蕨类植物的精子形成是一个运动细胞器重新发生的过程,但对其精子发生的分子机制仍不甚了解。中心体蛋白(centrin)是定位于细胞中心体上的一种高度保守的钙结合蛋白,被认为可能是最早参与运动细胞器发生的蛋白质。克隆鉴定centrin蛋白为进一步分析蕨类精子发生的分子机制奠定基础。该研究从蕨类模式植物水蕨(Ceratopteris thalictroides)中克隆到了水蕨centrin基因(CtCEN),其cDNA序列全长为1 077bp,结构分析表明CtCEN基因属于EF-hand超家族的centrin基因。Centrin的系统树分析发现,藻类、蕨类以及动物等具鞭毛游动精子的生物聚为一支,而被子植物聚为另一分支,表明centrin的功能可能与运动细胞器鞭毛发生有关。原核表达和Western blot分析表明,CtCEN基因表达的蛋白能与人源centrin抗体发生结合,这一结果证实克隆到了centrin基因。     

停乳链球菌isp基因的克隆与原核表达

根据GenBank报道的停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)isp基因(GenBank:CP002215.1)序列设计引物,PCR扩增得到isp基因。片段大小为1 500 bp,与从GenBank下载的序列进行同源性比对结果为98.57%。将isp基因克隆于表达载体pET-25b,成功构建了重组质粒pET-25b-isp,将重组质粒分别转化BL21(DE3),将BL21(pET-25b-isp)阳性重组菌株经IPTG诱导后,SDS-PAGE结果显示均有蛋白表达,大小分别为53 ku与目的蛋白大小相符;Western blot检测显示,表达的蛋白为目的蛋白。对成功构建的菌株BL21(pET-25b-isp)表达条件经优化后,在温度37℃,诱导时间12 h,IPTG浓度为1 mmol/L时,蛋白有较高的表达量。     

野生马铃薯ANS同源基因的克隆与表达分析

采用PCR和RT-PCR方法从野生马铃薯（Solanum cardiphyllum）分离得到了一个花色素合成酶（anthocyanidin synthase）同源基因ScANS的cDNA（GenBank登录号HQ701726）和DNA序列（GenBank登录号HQ701727）。序列分析表明,ScA册基因全长为1583bp,由一个内含子和两个外显子组成,开放阅读框长度为1365bp,编码一个由454个氨基酸残基组成的蛋白。该蛋白分子量为51．10kDa,理论等电点为5．24。ScANS含有典型的20G—FeII-Oxy保守功能域,属于2-OOD酶家族,其氨基酸序列与茄子的同源蛋白序列一致性最高,达82．86％。组织表达分析表明,SScANS在马铃薯植株的茎、叶和顶芽中有较高水平的转录表达,在根中有微量表达,在匍匐茎和块茎中检测不到。     

仙台病毒F基因的克隆及原核表达

目的利用原核表达系统表达仙台病毒(Sendai Virus)F蛋白主要抗原片段FP(S),并对表达产物进行免疫学初步研究。方法根据GenBank公布的仙台病毒F蛋白(gi:9627219)的基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR扩增出F基因的主要抗原片段FP(S),插入pMD-18-T载体中,鉴定正确后克隆入pQE31原核表达载体中,将鉴定正确的pQE31-FP(S)转化大肠埃希菌M15,IPTG诱导表达,对大肠埃希菌裂解物进行SDS-PAGE和Western-blot验证。结果大肠埃希菌表达的FP(S)相对分子质量约26×103,与预期相符;能与SeV阳性血清发生特异性反应,出现单一条带。结论原核表达的FP(S)蛋白有良好的抗原性,为检测仙台病毒抗体的ELISA检测方法的研究奠定了基础。     

龙眼体胚发生相关未知蛋白DlUP-3基因的克隆与表达分析

在龙眼体胚发生早期的蛋白质组学研究中,发现1个体胚发生相关未知蛋白DlUP-3,通过简并引物结合RACE技术进行其基因全长序列克隆。结果显示:(1)克隆到的龙眼体胚发生相关未知蛋白基因DlUP-3的全长cDNA序列为1 681bp,开放阅读框由1 017个核苷酸组成,编码338个氨基酸(GenBank登录号为GQ167202)。(2)生物信息学分析发现,该基因推导蛋白分子量为36 854.2Da,pI为9.05;该蛋白为Ras蛋白质家族成员,具有ATP/GTP-binding site motif A(P-loop)结合位点和1个典型的Ras_like_GTPase superfamily组件,无典型信号肽结构,但有跨膜螺旋的亲水性蛋白;不规则卷曲是其最大量的结构元件,散布于整个蛋白质中。(3)实时荧光定量PCR分析显示,该基因在龙眼体胚发生过程中均有表达,其中以胚性愈伤组织阶段表达量最低,而球形胚阶段最高。研究表明,DlUP-3基因在龙眼体胚发生过程尤其是球形胚阶段有重要的作用,为进一步研究该基因在龙眼体胚发生过程中的功能奠定了基础。     

牦牛OB基因的克隆及原核表达

肥胖基因(obese gene,OB gene)表达产物瘦蛋白(leption)具有调节体重、影响动物生长和繁殖率等一系列生物学功能。通过牦牛脂肪组织总RNA的提取,利用RT-PCR克隆出牦牛OB基因的成熟肽cDNA,构建OB基因的原核表达载体OB-pET32a(+),在大肠杆菌表达系统使融合蛋白表达,通过SDS-PAGE检测所表达的融合蛋白。结果表明,克隆的OB基因成熟肽片段为456 bp包含EcoR I和BamH I两个酶切位点,与普通牛、瘤牛该基因的相似性达98.6%。原核表达产物为包涵体形态,大小为31 kD,符合预期结果,为OB基因的高效表达系统的构建奠定基础。     

大肠杆菌glgC基因的克隆及原核表达

以大肠杆菌BL21染色体DNA为模板,根据glgC基因的全序列设计了1对引物,在优化的PCR反应条件下扩增出了glgC基因片段,测序结果显示该片段大小为1296 bp,编码432个氨基酸残基。将该基因克隆到原核表达载体pET-28a-c( )中,重组载体pET-glgC转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定,得到了与理论推算的glgC基因表达产物分子质量(约53 kD)相符的特异蛋白条带。     

小鼠Klf4基因的克隆及原核表达分析

目的克隆Klf4基因并对其重组蛋白进行原核表达及分析。方法提取胎鼠皮肤mRNA后反转录为cDNA序列,用一对两端引入特定酶切位点引物,从该cDNA中扩增出Klf4基因编码区序列,将其克隆到pEasy-T3载体上。对质粒双酶切并回收其中Klf4基因片段后,克隆入pET-52b（＋）载体后转化Origmai B（DE3）型大肠杆菌,用IPTG诱导表达,最后采用SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定及分析。结果对所克隆的Klf4mRNA蛋白编码区的DNA序列分析表明,klf4CDS区包括终止密码子在内为1452 bp,与参照序列对比仅有四处存在差异,不仅其同源性达到99.72%,且其氨基酸序列同源性为100%;在IPTG诱导下pET-52b（＋）-Klf4重组质粒可表达与预期相符的约为57×103的蛋白质;经IPTG刺激后重组蛋白表达明显上调,其中IPTG为0.4 mol/L时效果最佳。结论从胎鼠皮肤中克隆的Klf4基因可在原核中表达。     

人SUMO-3基因原核表达及多克隆抗体制备

构建人SUMO-3基因的原核表达载体pET41a(+)-SUMO-3,表达重组GST-SUMO-3融合蛋白,制备人SUMO-3多克隆抗体。试验结果显示,通过PCR方法从重组质粒pEYFP-SUMO-3中克隆到的SUMO-3 N端93个氨基酸的基因序列与NCBI上提供的序列一致,重组质粒pET41a(+)-SUMO-3构建成功;重组pET41a(+)-SUMO-3在E.coli.BL21 (DE3) pLysS中表达GST-SUMO-3融合蛋白,分子量为44.0 kDa,与预期分子量一致;采用亲和层析纯化融合蛋白GST-SUMO-3并免疫家兔,获得人SUMO-3抗体;Western blot 检测显示该抗体可以特异性识别SUMO-3,ELISA检测结果成阳性,抗体效价约为1: 20000。实验结果为进一步研究人SUMO-3及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。     

α-苦瓜素基因的克隆和原核表达

α-苦瓜素(Alpha-momorcharin)是一种多功能核糖体失活蛋白,具有抗肿瘤、抗HIV-1和抗菌活性,并同时具有免疫抑制活性.利用PCR(polymerase chain reaction)技术从苦瓜基因组中扩增出了成熟的α-苦瓜素蛋白基因,并亚克隆到表达载体pET28a( )上,然后分别在BL21(DE3) 和RosettaTM(DE3)pLysS中进行表达.结果表明只在RosettaTM(DE3)pLysS中,重组α-苦瓜素基因能成功地表达出33 kD大小的重组蛋白,而且在18℃和22℃的温度下,经IPTG诱导后,能成功地表达出大量可溶性重组蛋白.利用重组蛋白的N末端带有的6×His 标签,通过Ni-NTA柱纯化获得了α-苦瓜素重组蛋白.Western杂交实验表明,纯化后的重组蛋白可与鼠抗His-Tag单克隆抗体发生特异性反应.α-苦瓜素重组蛋白的获得为进一步系统研究和改造其功能与活性奠定了基础.     

家蝇Thymosin(THY)基因的克隆及原核表达

采用EST测序技术从构建的家蝇(Musca domestica)幼虫c DNA质粒文库中筛选到胸腺肽(Thymosin,THY)基因,以该基因的c DNA文库质粒为模板,设计引物,通过PCR扩增,测序鉴定,获得THY基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建p ET-28a(+)-THY重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。研究结果表明,THY基因ORF全长384 bp,编码127个氨基酸,理论分子量14.3 k D,等电点为5.22,具有THY家族的蛋白保守结构域。构建重组原核质粒p ET-28a(+)-THY,经IPTG诱导,蛋白在大肠杆菌中获得表达,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,Western blot检测发现纯化的目的蛋白大小正确。     

金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药辅助基因femB的克隆和原核表达

金黄色葡萄球菌femB基因与甲氧西林高水平耐药密切相关,可能成为开发抗MRSA药物的新靶位.以金葡菌基因组DNA为模板,PCR扩增femB全长基因,所得片段与pGM-T载体连接并转化感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆以PCR、双酶切及测序鉴定.将鉴定正确的目的片段定向克隆到pGEX-4T-1表达载体中,转化至大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达GST/FemB融合蛋白;采用SDS-PAGE及Western blot对融合蛋白进行鉴定.结果显示,重组质粒在宿主菌中获得了高效表达,融合蛋白相对分子质量为75 kD,该融合蛋白可与抗GST-tag抗体特异结合;表明femB基因的原核表达系统构建成功,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

金黄色葡萄球菌CHIPS基因克隆及原核表达

趋化抑制蛋白(Chemotaxis Inhibitory Protein ofStaphylococcus aureus,CHIPS)是由金黄色葡萄球菌分泌到菌体外的一种蛋白。在感染早期,它能特异性地与中性粒细胞和单核细胞上的C5a受体(C5aR)和fMLP受体(FPR)结合,从而阻止中性粒细胞和单核细胞对C5a和fMLP的结合作用,导致对病原吞噬作用的延迟。人们可以利用CHIPS对C5a-C5aR的阻止作用来研制治疗由C5a诱发的炎症性疾病的药物。将CHIPS作为免疫原防治疾病也将成为新的研究课题。实验成功构建了CHIPS蛋白的原核表达系统,为CHIPS免疫原性研究及蛋白的其他功能研究奠定了基础。     

GA2ox1氧化酶基因的克隆及原核表达

采用RT-PCR从拟南芥基因组中克隆到GA2ox1基因,通过Gateway克隆技术构建原核重组表达载体pDEST17-GA2ox1,并转化大肠杆菌BL(21)star,对蛋白原核表达条件进行优化.结果表明,最佳表达条件为温度30℃、IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导6 h.蛋白表达形式为包涵体,与Biotech对GA2ox1基因在大肠杆菌中的表达情况推测的结论一致.重组蛋白分子质量约为40 kD,经Ni Sepharose亲和层析柱纯化和Western blot鉴定得纯度90%以上的GA2ox1重组蛋白.研究结果为GA2ox1抗体制备及蛋白功能的进一步研究奠定了基础.     

滇龙胆GrHMA基因的克隆和原核表达

HMA蛋白(heavy metal transporting ATPase)是一种在植物中广泛存在的多功能蛋白。根据滇龙胆转录组GrHMA基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR扩增GrHMA基因序列,并进行TA克隆、测序及序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrHMA,转入E.coli Rosetta(DE3)中,并在37℃、1.0 mmol/L IPTG下成功诱导表达。序列分析表明,GrHMA基因是HMA超家族的成员;GrHMA氨基酸序列系统发育分析表明,GrHMA与TcHMA处于同一进化枝。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。这些结果为GrHMA蛋白的进一步纯化及结构和功能的研究奠定基础。     

苹果S6PDH基因克隆与原核表达

6-磷酸山梨醇脱氢酶(sorbitol-6-phosphate dehydrogenase,S6PDH)是蔷薇科植物中合成山梨醇的重要酶。以苹果叶片为材料,利用RT-PCR法克隆到S6PDHcDNA全长,将其与大肠杆菌表达载体pET-32a( )构建原核表达载体pET-S并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE检测结果表明该基因表达了1个约54kD的蛋白,为进一步研究目的蛋白的结构和功能提供了试验基础。