杂合抗菌肽CecA_mil的改造及在毕赤酵母中的分泌表达

参照毕赤氏巴斯德酵母（Pichia pastoris）偏好密码子,改造并化学合成杂合抗菌肽CecA_mil基因,改造后的CecA_mil基因克隆到pPICZα_A载体中,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα_A_CM,转化Pichia pastoris受体菌X_33。在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,分子量约1.9 kD的CecA_mil杂合抗菌肽获得表达,经表达条件优化,重组酵母菌的摇瓶发酵产率可达到245μg/mL。抗菌特性研究表明,该表达产物具有广谱抗菌活性,对多数G－菌及G＋菌均有较好的抑菌活性,特别是对氨苄青霉素抗性菌和卡那霉素抗性菌抑杀效果更好;具有热稳定性和酸稳定性。这些特点使得重组抗菌肽CecA_mil在食品防腐、疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。     

杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其活性测定

为获得溶血活性低、抗菌活性高的杂合抗菌肽,以家蝇抗菌肽Cec Md和中国林蛙抗菌肽Chensirin为母体肽,并结合毕赤酵母偏爱密码子的原则,设计出6条具有抗菌潜力的新型杂合抗菌肽,将其命名为CC22、CC28、CC29、CC30和CC34(1),CC34,利用SOE-PCR技术合成所需的目的基因,并将其克隆至毕赤酵母表达载体pGAPZαA,通过电击转化技术,将其转化至毕赤酵母SMD1168中,经含有Zeocin的抗性平板筛选阳性转化子,YPD液体培养72h后,经Tricine-SDS-PAGE检测出目的蛋白,然后采用高效液相色谱法对其进行纯化。检测结果显示,表达产物CC29对大肠杆菌、鸡沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC)均为25μg/ml;CC34(1)对大肠杆菌表现相对较弱的抑制作用,最小抑菌浓度为100μg/ml;CC34对鸡沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为50μg/ml;且杂合抗菌肽对有益菌均没有表现出抑制作用。6条杂合肽的溶血活性均呈现较低水平,其中表现出抗菌活性的3条抗菌肽中,以CC29的溶血活性最低,CC34(1)和CC34相对次之。结合抑菌活性,CC29和CC34的抑菌效果较为明显,从而确定溶血活性低且抗菌活性较高的CC29和CC34为新型杂合抗菌肽。     

杂合抗菌肽CecA-Mag的人工合成及其在Pichia pastoris中的分泌表达

根据抗菌肽天蚕素A(cecropinA,CA)N端第1~7个氨基酸残基,马盖宁(magainin,M)N端第2~12个氨基酸残基,以毕赤酵母偏爱的密码子设计合成了杂合肽CA(1~7)-M(2~12)基因,同载体pPICZα-A连接后转化Pichia pastoris受体菌SMD1168,在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,分子量约1.9kDa的CecA-Mag杂合抗菌肽获得表达,抗菌特性研究表明,该表达产物具有广谱抗菌活性,对多数G-菌及G 菌均有较好的抑菌活性。初步抑菌活性测定,显示该杂合肽对金黄色葡萄球菌、耐氨苄青霉素的大肠杆菌及枯草芽孢杆菌有良好的抑杀活性。酸稳定实验显示pH为3.2时仍具有相当高的活性。热稳定性实验显示该杂合肽100℃加热5min后仍具有抑菌活性。这些特点使得重组抗菌肽CecA-mag在疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。     

家蚕抗菌肽在毕赤酵母中的表达

目的：用毕赤酵母真核系统表达有抑菌活性的家蚕抗菌肽(cecropin-XJ)。将pGEX-4T-1-cecropin-XJ上的抗菌肽基因cecropin—XJ克隆至穿梭质粒pSuperY上,用Bln Ⅰ酶切使之线性化后,采用电击法转化酵母SMD1168,转化子用小瓶发酵,经SDS—PAGE检测,表达产物可以在α信号因子的引导下,分泌到培养基中,且表达产物具有明显抑菌活性。     

抗菌肽VIP在毕赤酵母中的高效表达及鉴定

基于人抗菌肽VIP(Vasoactive intestinal peptide)基因序列,按照毕赤酵母密码子偏好性设计引物;用SOE-PCR法扩增目的基因;然后将目的基因克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上,构建VIP分泌表达菌株GS115-p PICZαA-vip。用甲醇诱导96 h收集上清,用质谱进行鉴定,结果显示分泌表达产物与人抗菌肽VIP理论值(3 326.82 Da)完全一致,表明人抗菌肽VIP成功得到分泌表达。琼脂糖凝胶扩散法实验结果显示,重组VIP对大肠杆菌Escherichia coli ATCC25922和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC25923都有很强的抗菌活性,MIC(Minimal inhibitory concentration)分别为8 mmol/L和16 mmol/L。进一步细胞毒性和溶血性实验结果显示,重组VIP对正常细胞NCM460和IPEC-J2没有毒性,其对SD大鼠红细胞不具有溶血活性。通过透射电镜观察了VIP的抗菌机制,结果显示VIP主要通过破坏细胞膜的方式抑杀细菌。本研究为人抗菌肽VIP的开发应用和大量生产奠定了基础。     

新疆家蚕抗菌肽在毕赤酵母中表达及活性研究

目的:在毕赤酵母中表达新疆家蚕抗菌肽基因(Cecropin-XJ)并检测其活性.方法:根据作者实验室已克隆获得的新疆家蚕抗菌肽(Cecropin-XJ)基因设计引物,通过PCR方法扩增Cecropin-XJ,将PCR产物和表达载体pPIC9K用EcoR Ⅰ及Not Ⅰ双酶切,构建重组表达质粒pPIC9K-(Cecropin-XJ),酶切及测序正确后,电转化到毕赤酵母GS115,对分泌表达的重组蛋白进行活性检测.结果:PCR扩增获得192 bp Cecropin-XJ,成功构建pPIC9K-Cecropin-XJ,优化诱导条件证明在pH 6的BMMY培养液中,0.5%甲醇诱导约48h后,获得的表达产物活性较强,对多种革兰氏阴性菌和阳性菌具有抗菌活性,在100℃条件下,其活性可维持100min以上.结论:新疆家蚕抗菌肽在毕赤酵母中分泌表达,为大规模发酵生产奠定了基础.     

复合抗菌肽PL在毕赤酵母中的分泌表达及其活性研究

为了获得抗菌活性较强的抗菌肽,将几种抗菌肽串联起来在毕赤酵母中表达,并比较其与单独抗菌肽的抑菌活性。以GenBank中的Protegrin-1(PG-1)、ScorpionDefensin(SD)、Metalnikowin-2A和SheepMyeloidAntibacterialPeptide(SMAP-29)(序列号分别为AAB27599,AAAB27538、P80409和P49928)成熟肽段作为模板序列,根据巴斯德毕赤氏酵母(P.pastoris)偏好密码子,设计并人工合成复合抗菌肽pl基因,同时用SOE法获得ScorpionDefensin的基因,分别克隆到pPICZαA载体中,转化P.pastoris受体菌X-33,在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,复合抗菌肽PL及SD均获得表达。体外抑菌试验检测复合抗菌肽PL与单独的蝎子防御素SD的热稳定性、酸稳定性、最低抑菌浓度等,结果显示复合抗菌肽PL及SD具有很强的热酸稳定性,而针对不同的细菌,复合抗菌肽则表现出了强于单独的SD的活性,特别是对大肠杆菌。上述结果说明了该复合抗菌肽具有很好的开发前景。     

人类抗菌肽hepcidin在毕赤酵母中的分泌表达和纯化

报道了一种低分子量的人类抗菌肽hepcidin基因的克隆、表达以及纯化.试验证明在毕赤酵母中能成功分泌有活性的hepcidin,hepcidin在重组菌株中的表达量约为3 mg/L,Western blot显示2.2 kD的重组hepcidin条带,重组hepcidin通过凝胶过滤及反向高效液相色谱纯化,质谱验证,重组蛋白对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌表现出抗菌活性.     

Hepcidin的基因克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

根据已知hepcidin氨基酸序列,参照毕赤氏巴斯德酵母(Pichia pastoris)密码子偏好性,设计合成了hepcidin目的基因。所合成的hepcidin基因全长96bp,其5′端引入KEX2基因产物(Kex2)的特异性识别位点序列,以保证表达产物具有天然N端。通过基因重组的方法将hepcidin基因克隆到pPicZαA载体中,构建了分泌型重组酵母表达载体pPICZαA-Hepc,经电转至毕赤酵母GS115中表达。使用浓度高达1500μg/mL的Zeocin筛选得到高拷贝插入GS115菌株,经摇瓶发酵和甲醇诱导,上清液有明显的hepcidin表达,表达量达到100mg/L。初步抗菌特性研究表明,该表达产物对枯草芽孢杆菌有明显的抑菌作用,而对大肠杆菌抑菌效果不明显。     

金环蛇抗菌肽在毕赤酵母中的组成型表达

[目的]建立金环蛇抗菌肽Cath-BF的毕赤酵母高效分泌表达系统。[方法]Cath-BF基因用引物重叠延伸法合成,克隆于p GAPZa-A,电转化毕赤酵母SMD1168,博莱霉素筛选高抗性转化子,以痤疮丙酸杆菌筛选抗菌肽高效分泌株,摇瓶培养确定分泌表达最适p H值。[结果]获得Cath-BF的毕赤酵母高效组成型分泌表达株,表达产物可有效抑制痤疮丙酸杆菌的生长,抗菌肽分泌水平与培养基p H值高度相关。[结论]成功构建金环蛇抗菌肽Cath-BF组成型高效分泌表达系统。     

Magainin和cecA-mil抗菌肽基因的密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达

选用毕赤酵母偏爱密码子 ,设计合成了新型抗菌肽基因。所合成的magainin基因和cecA mil杂合肽基因全长分别为 1 0 1bp和 60bp ,并在其N端引入kex2裂解位点 ,以保证表达抗菌肽具有天然N端。其中 ,cecA mil杂合肽基因根据cecropinAN端第 1～ 7个氨基酸残基、melittinN端第 5～ 1 2个氨基酸残基所设计合成。基因分别克隆入pPICZα A质粒 ,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα A mag和pPICZα A CM。在AOX1 (醇氧化酶 )启动子调控下 ,类似天然抗菌肽大小的magainin及cecA mil蛋白获得分泌表达 ,其表达量分别为 1 0 5mg L和 1 1 8mg L。初步抑菌活性测定 ,显示两者对金黄色葡萄球菌及E .coliDH5α有较好的抑杀活性。     

泥鳅抗菌肽在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性检测

【背景】泥鳅抗菌肽Misgurin是泥鳅非特异性免疫防御系统的重要组成部分,具有广谱和较强的抗菌能力,所以获得大量抗菌肽是很有必要的。【目的】为了实现高效表达泥鳅抗菌肽Misgurin。【方法】将泥鳅抗菌肽的目的基因与p PIC9K表达载体连接,构建重组表达质粒p PIC9K-misgurin,Sal I酶切线性化,再通过电击法将其整合到毕赤酵母SMD1168染色体上。在MD固体培养基挑选阳性克隆子到MD液体培养基中,30°C、200 r/min摇瓶培养96 h,转接到BMMY液体培养基进行诱导表达,每隔24 h加入5%的甲醇。通过比较抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈直径的大小,筛选出活性较高的菌株p PIC9K-misgurin-22。将该菌株在100 L的发酵罐中诱导表达,48 h后进行活性检测。【结果】经Tricine-SDS-PAGE蛋白胶检测和质谱分析鉴定,p PIC9K-misgurin-22菌株诱导表达的活性物质为抗菌肽Misgurin。发酵罐发酵48 h相对于摇瓶发酵48 h,抗大肠杆菌的生物效价提高了1.47倍,抗金黄色葡萄球菌的生物效价提高了1.43倍;抗菌肽Misgurin对鲍曼不动杆菌、沙门氏菌有较弱的抗菌活性,对致病菌产气荚膜梭菌和益生菌如枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、乳酸菌没有抗菌活性,无明显溶血活性;当温度达到90°C时发酵液的抗菌活性明显减弱,调发酵液的p H值在1.0-12.0之间都有抗菌活性;加入胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K后抗菌活性减弱。【结论】获得了一株在毕赤酵母中表达量较高、有工业化生产潜力的产抗菌肽Misgurin的菌株。     

重组人kallistatin蛋白在毕赤酵母中的高效表达及生物活性分析

为了研究kallistatin(Kal)的生物活性,本实验构建了可分泌表达Kal的毕赤酵母菌株。首先通过PCR方法从pAAV-Kal中扩增出KalcDNA,并克隆至酵母表达载体pPIC9,得到甲醇酵母分泌型表达载体pPIC9-Kal,然后将载体线性化并电击转化毕赤酵母GS115(his4),通过MD平板筛选出阳性表达菌株。阳性表达菌株在BMMY培养基(pH7.0)中29℃培养,经2%甲醇诱导表达96h,摇瓶表达量可达14mg/L。表达上清经PhenylSuperose、Heparin SepharoseFF分离纯化,目的蛋白纯度达到98%,分子量为58kDa。生物活性实验显示,所得到的Kal蛋白具有较好的抗氧化活性,过氧化物酶活性达到(163±4)U/(mg·min),可有效降低H2O2对LX-2细胞的氧化损伤。另外,重组产生的Kal还能抑制HUVEC细胞的增殖。本研究首次成功地利用毕赤酵母表达系统分泌表达了有生物活性的Kal,为继续开展其抗肿瘤活性奠定了基础。     

Modification of a gene encoding hybrid xylanase and its expression in Pichia pastoris

To obtain the protein expression of a hybrid xylanase in yeast, the gene encoding it was modified according to the codon bias of Pichia pastoris and expressed extracellularly in this yeast as an active xylanase, MBtx, exhibited a molecular mass of approximately 35 kDa on SDS–PAGE. The pH behavior of MBtx in terms of both activity and stability was similar to that of Btx, original gene product in Escherichia coli, while a certain difference was observed in optimal temperature for activity and in thermal stability. HPLC analysis revealed the xylan in wheat could be hydrolyzed by MBtx and the major hydrolysis product was xylotriose. These results showed codon usage played a key role in regulating the expression of the hybrid xylanase in P. pastoris and the recombinant hybrid xylanase, MBtx, produced by P. pastoris could be potentially useful in feed industry.     

Peroxisome-targeted and tandem repeat multimer expressions of human antimicrobial peptide LL37 in Pichia pastoris

Although the human antimicrobial peptide LL37 has a broad spectrum of antimicrobial activities, it easily damages host cells following heterologous expressions. This study attempted two strategies to alleviate its damage to host cells when expressed in Pichia pastoris using the AOX1 promoter. Tandem repeat multimers of LL37 were first designed, and secretion expression strains GS115-9K-(DPLL37DP)_n (n?=?2, 4, 6 and 8) containing different copies of the LL37 gene were constructed. However, LL37 tandems still killed the cells after 96?hr of induction. Subsequently, peroxisome-targeted expression was performed by adding a peroxisomal targeting signal 1 (SKL) at the C-terminus of LL37. The LL37 expression strain GS115-3.5K-LL37-SKL showed no significant inhibition in the cells after induction. Antibacterial activity assays showed that the recombinant LL37 expressed in peroxisomes had good antimicrobial activities. Then, a strain GS115-3.5K-LL37-GFP-SKL producing LL37, green fluorescent protein, and SKL fusion proteins was constructed, and the fusion protein was confirmed to be targeting the peroxisomes. However, protein extraction analysis indicated that most of the fusion proteins were still located in the cell debris after cell disruption, and further studies are required to extract more proteins from the peroxisome membrane.     

植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein的密码子优化及其在毕氏酵母中的表达

根据甜蛋白des-pGlu1-Brazzein的成熟区氨基酸序列,按照酵母密码子的偏好优化其编码序列,合成了4对末端具粘合位点的寡聚核苷酸序列,经连接、PCR扩增后得到了179 bp的des-pGlu1-Brazzein编码序列,插入到pPIC9K载体中,构建了重组表达载体pPIC9K-Bra。经酶切、电击转化到毕赤酵母菌GS115中。酵母工程菌株经筛选鉴定后诱导表达,目的蛋白的表达量约占上清总蛋白的51.6％,分离纯化后的des-pGlu1-Brazzein具有一定的甜度。     

果蝇防御素在毕赤酵母中的表达及活性检测

抗菌肽是昆虫感染细菌后,由血细胞及脂肪细胞在瞬时分泌的抗菌物质。具有广谱抗菌活性和抑杀耐药菌株等优点。抗菌肽不仅抗菌谱广,而且对某些真菌、原虫、病毒及肿瘤有一定的杀灭和抑制作用,还能加速免疫和伤口愈合过程。防御素是一类在自然界中广泛存在的、具有微生物抗性的小分子抗菌肽。利用PCR技术,以果蝇总DNA为模板,扩增出两端加入了连接接头的防御素基因,将接头处理成粘性末端,将防御素基因与分泌型酵母表达载体pHBM905B重组,构建重组酵母表达载体pHBM905B/defensin,经"三明治"夹心平板筛选及菌落PCR鉴定证明目的基因已整合入酵母染色体中。挑选阳性克隆经甲醇诱导表达,以SDS-PAGE电泳对表达产物进行分析,证明表达蛋白的相对分子量约为10kD,与预期结果一致。用琼脂糖扩散法检测上清液的生物学活性,可以观察到明显的抑菌圈,显示其具有较强的抗菌活性。同时表达产物有极强的热稳定性,展示了诱人的应用前景,为进一步的开发研究奠定了基础。     

影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素

要在一种宿主表达系统中成功表达外源蛋白并获得较高产量,必须要较为全面地了解影响其表达的许多因素。影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素主要包括：外源基因的特性、表达框的染色体整合位点和方式、宿主菌的甲醇利用表型、基因剂量、分泌信号、产物稳定性和翻译后修饰等。本文就这些因素进行分析,并提出一定的对策和建议。