高分子量RGD-蛛丝蛋白重组体的构建、高密度发酵及纯化

蜘蛛丝是自然界综合性能优良的天然蛋白质纤维之一,因其具有良好的生物相容性和可降解性在生物医学领域具有潜在的应用前景。在本室已经构建的RGD-蜘蛛拖丝蛋白基因16多聚体基础上,通过首尾相连、倍加等方法进一步多聚化,得到RGD-蜘蛛拖丝蛋白基因32和64多聚体,分别将这两种多聚体与原核高效表达载体pET-30a( )连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,得到的32多聚体表达重组子命名为pNSR32,64多聚体表达重组子命名为pNSR64。通过酶切、琼脂糖电泳鉴定及对目的片段的测序均与理论值相符。将32和64多聚体基因序列注册GenBank,序列号分别为DQ469929和DQ837297。重组体pNSR32和pNSR64经IPTG诱导表达,SDS-PAGE图谱显示表达产物分子量分别为102kD和196.6kD,与天然蛛丝蛋白分子量接近并与理论值相吻合。高分子量的蛛丝蛋白在原核生物成功实现高效表达,在国内外尚未见报道。在此基础上对pNSR32工程菌进行高密度发酵,建立了简单高效的目的蛋白纯化工艺。     

重组杂合蛛丝蛋白MiSpNT-PySpRp-MiSpCT的二级结构表征

重组蛛丝纤维作为一种性能优异的生物材料,具有良好的生物相容性,在生物医学工程领域具有极大的潜在应用价值。已有研究表明,重组蛛丝蛋白可用作血管、神经导管及药物载体等,但其生物学功能仍有待研究。本研究以大腹园蛛基因组为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得大腹园蛛梨状腺丝（piriform spidroin: PySp）一个完整重复区（Rp）编码序列;此Rp模块与MiSpNT/CT模块重组,构建微小型杂合蛛丝蛋白MiSpNT-PySpRp-MiSpCT,成功在大肠杆菌BL21中高效表达,借助8 mol/L尿素裂解缓冲液进行变性纯化,得到纯度较高的杂合蛛丝蛋白MiSpNT-PySpRp-MiSpCT,产量约100 mg/L。CD图谱显示,MiSpNT-PySpRp-MiSpCT蛋白质溶液主要以α-螺旋和无规卷曲形式存在,随着溶液pH值降低,部分α-螺旋向β-折叠转变;红外光谱显示,在自然成丝及冻干过程中,部分α-螺旋转化为β-折叠,符合天然蛛丝蛋白成丝过程的二级结构变化特征。本研究结果为今后获得具有天然蛛丝纤维优异性能的人工重组蛛丝纤维材料提供一种新的可能。     

蛛丝蛋白的研究进展及应用前景

蛛丝蛋白是一种很特殊的纤维蛋白。由丙氨酸组成的β－折叠和富含脯氨酸的α－螺旋,及其紧密堆砌的二级结构使之成为一种半结晶状态的分子弹簧结构,决定了蛛丝具有强度高,韧性大等一些重要特点。对其蛋白质序列的组成与结构人们已基本研究清楚;蛛丝蛋白基因部分序列的克隆已取得成功,在基因表达方面也取得了一些进展。虽然由于蛛丝蛋白基因序列的高重复性、不稳定性和较长的基因序列,使得对蛛丝蛋白的全基因克隆变得困难重重,但是蛛丝蛋白独特的结构和性质,使其在医学领域尤其是组织工程方面有着诱人的前景。     

蛛丝蛋白的研究进展及应用前景

蛛丝蛋白是一种很特殊的纤维蛋白。由丙氨酸组成的β-折叠和富含脯氨酸的α-螺旋,及其紧密堆砌的二级结构使之成为一种半结晶状态的分子弹簧结构,决定了蛛丝具有强度高,韧性大等一些重要特点。对其蛋白质序列的组成与结构人们已基本研究清楚;蛛丝蛋白基因部分序列的克隆已取得成功,在基因表达方面也取得了一些进展。虽然由于蛛丝蛋白基因序列的高重复性、不稳定性和较长的基因序列,使得对蛛丝蛋白的全基因克隆变得困难重重,但是蛛丝蛋白独特的结构和性质,使其在医学领域尤其是组织工程方面有着诱人的前景 。     

蜘蛛丝蛋白研究进展

由于蜘蛛丝蛋白分子高度重复的一级结构、特殊的溶解特性和分子折叠行为以及具有形成非凡力学特性丝纤维的能力而引人注目。本文从蛛丝蛋白基因、天然蛛丝形成过程、蛛丝蛋白的基因工程生产及蛛丝蛋白的应用前景等几个方面着重介绍了近20年来对蛛丝蛋白的研究进展。围绕蛛丝蛋白展开的研究将有助于揭示蛋白质一级结构、蛋白质分子折叠与蛋白质大分子特性之间的内在联系。     

乳糖诱导高分子量重组蛛丝蛋白发酵培养基优化

在M9培养基的基础上,以乳糖为诱导剂,对基因重组蛛丝蛋白工程菌pNSR32/BL21(DE3)的发酵培养基进行了优化。利用单因子实验和正交试验优化出表达高分子量重组蛛丝蛋白的最优培养基配方,结果表明：优化的碳源为0.3%的甘油,氮源为3%的酵母膏、0.75％的蛋白胨和0.05％(NH4)2SO4及少量的无机盐。优化培养基有利于菌体的生长和目的蛋白的表达,表达重组蛛丝蛋白达总蛋白量的20%。     

蛋白质内含子介导蛛丝功能化平台的建立

为建立高效快捷的蛛丝功能化修饰平台,蛋白质内含子的反式剪接技术被首次应用于重组蛛丝的功能化修饰。在体外通过Ssp Dna B的反式剪接作用,在蛋白质水平上将12 k Da泛素相关修饰蛋白(SUMO)与蛛丝蛋白(W2CT)连接形成功能化蛛丝蛋白SUMOW2CT。修饰后SUMOW2CT与W2CT均能形成纳米至微米级的丝纤维,但SUMOW2CT自动成丝速度明显下降且产量约为W2CT的一半。与W2CT丝纤维(W)相似,SUMOW2CT丝纤维(UW)不具有超收缩能力和对2%SDS不耐受,但机械性能低于W2CT丝纤维。功能化蛋白SUMOW2CT形成的丝纤维中SUMO蛋白仍保持着正确三维结构,可被SUMO蛋白酶酶切。外源功能化蛋白质虽在一定程度上降低了丝的形成速度和机械性能,但修饰上的功能化蛋白仍保持着生物活性,表明断裂蛋白质内含子介导的蛛丝修饰平台成功建立,也为蛛丝的功能化修饰和应用奠定了坚实的技术基础。     

蜘蛛丝蛋白的结构及其应用

蜘蛛的拖丝是一种既具有抗张强度又具有高度弹性的奇特蛋白质纤维。近看来,生物学者用现代生物工程技术和其它技术对蛛丝蛋白分子的结构和物理特性,主要是机械特性,进行了广泛深入的研究,取得了很大进展,指出了蛛丝蛋白的工业应用价值。1蛛丝蛋白结构研究进展概述编码一种拖丝蛋白（Spidroiril）的部分cDNA克隆以前已获分离产物,但是所预期的氨基酸顺序并不能解释拖丝蛋白的氨基酸组成。此后又分离出一种编码另一拖丝蛋白（SPidloin2）的部分dD：NA克隆,说明蜘蛛的拖丝是由复合蛋白组成的。Spidroin2的氨基酸顺序是一种与Spidro…     

次壶腹腺丝蛋白功能模块的研究

蜘蛛丝是天然的生物材料,具有潜在的巨大应用价值。研究蜘蛛丝蛋白质的结构与功能,有助于破解蜘蛛丝蛋白质的成丝机理,为制备优良材料学性能的仿生蜘蛛丝纤维提供理论依据。以MiSp蜘蛛丝的重复区和C端非重复区蛋白多肽为研究对象,在不同pH值和离子条件下,在体外研究其二级结构与成丝的关系。CD图谱显示:表达纯化的重组蜘蛛丝蛋白R1R2在pH 7.5、6.5和5.5时二级结构相似,均为无规则卷曲,而R1R2CT则主要呈现为α螺旋构象;扫描电镜结果表明:在以上3种pH条件下,只有pH 5.5时R1R2和R1R2CT才形成重组丝纤维,R1R2CT纤维形态较平整,类似于天然蛛丝纤维形态,而R1R2丝纤维则呈条带状,表面粗糙。另外,氯化钠不利于形成形态平整的丝纤维。该成果为研究蛛丝蛋白的成丝机理奠定基础,也为制备仿生蛛丝蛋白纤维提供理论依据。     

4种常见蜘蛛蛛丝光学显微镜观察及机械性能的测定

对4种常见蜘蛛大腹园蛛Araneus ventricosus、迷宫漏斗蛛Agelena labyrinthica、草间钻头蛛Hylyphantes graminicola和棒络新妇Nephila clavata蛛丝的物理特性和机械性能进行了初步研究.结果 表明:捕丝是由2根核心丝构成,4种蛛丝呈现不同的颜色;4种蜘蛛蛛丝的密度略有不同,棒络新妇的蛛丝密度最大,草间钻头蛛的蛛丝密度最小;蛛丝中棒络新妇的断裂伸长率和断裂强度都最大,分别为47.3%和852.6 Nmm-2,草间钻头蛛蛛丝的断裂伸长率和断裂强度都最小,分别为32.1%和652.3 Nmm-2.与其它物理化学材料相比,蛛丝具有优异的综合力学性能,生物学特性与生物学功能具有高度一致性.