耐高渗压高压甘油的一个假丝酵母新种：产甘油假丝酵母

从自然标本中分离获得一高产甘油的菌株ＷＬ２００２－５,仅发酵葡萄糖及微发酵蔗糖,能利用葡萄糖、蔗糖、乙醇生产、微利用甘油和柠檬酸,不利用肌醇,硝酸盐、与ＤＢＢ显色反应为阴性。     

产甘油假丝酵母甘油合成关键酶编码基因的克隆

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)作为优良的甘油生产菌株已经成功应用于工业化生产。但相对于酿酒酵母, 该菌株的耐高渗机理和甘油代谢的分子机制还不甚清楚。本文根据已公布的3-磷酸甘油脱氢酶基因的序列信息, 设计出一组寡核苷酸, 再运用简并PCR结合反向PCR技术从C. glycerinogenes的基因组DNA中获得了4 900 bp的核苷酸序列, 递交GenBank (No. EU186536)。该序列包含完整的编码胞浆3-磷酸甘油脱氢酶编码基因(CgGPD)开放阅读框及其上、下游调控序列。1 167 bp的开放阅读框编码388个氨基酸残基的蛋白。所演绎出氨基酸序列分析比对结果表明该基因产物的序列具有典型的胞浆3-磷酸甘油脱氢酶结构特征, 但与已鉴定的相关基因存在中等程度的同源性并在相应的辅酶催化位点和底物结合位点区域具有高度的保守性, 在氨基酸水平上与安格斯毕赤酵母的相似性最高, 达到70.9%。该基因在Saccharomyces cerevisiae W303A中异源表达能够显著提高细胞的甘油合成能力。     

耐高渗压高产甘油的一个假丝酵母新种——产甘油假丝酵母

从自然标本中分离获得一高产甘油的菌株WL20025,仅发酵葡萄糖及微发酵蔗糖,能利用葡萄糖、蔗糖、乙醇生长,微利用甘油和柠檬酸,不利用肌醇、硝酸盐、赤藓醇、阿拉伯醇、甘露醇,与DBB显色反应为阴性,可在含500g/L葡萄糖或100mL/L醋酸的培养基中及40℃下生长,可在水活度为0890～0900的培养基中生长,出芽生殖,易形成“假丝酵母菌型”假菌丝,不进行有性生殖,线粒体DNA的分子量为20kb,是假丝酵母属的一个新种,定名为产甘油假丝酵母(Candida glycerolgenesis Zhuge[WTBZ] sp.nov.)。     

REMI介导电转化产甘油假丝酵母

为了分离耐高渗和甘油代谢相关基因,以Zeocin为选择标记,利用REMI技术电转化产甘油假丝酵母Candida glycerinogenes。考察了7种限制性内切酶对转化的影响,选择HindIII进一步优化了转化的几个条件。结果表明,在OD600≈1.3时收集细胞,在1.5kV电压下,感受态细胞浓度为2.0×109个细胞/mL,100U Hind III时,能获得129个转化子/μgDNA的较高转化率,58%的转化子稳定,表明REMI技术适合于产甘油假丝酵母的转化。     

产甘油假丝酵母HOG1 MAPK同源基因CgHOG1的克隆及特征分析

摘要:【目的】获得产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)耐高渗和过量合成甘油的关键调控基因—丝裂原活化蛋白激酶基因(CgHOG1),并考察其渗透压调节功能。【方法】运用简并PCR 结合Self-Formed Adaptor PCR技术从产甘油假丝酵母基因组中克隆CgHOG1基因并进行生物信息学相关分析,将CgHOG1基因在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303-1A)hog1Δ缺失突变株中互补表达,考察菌株耐渗透压能力变化。【结果】所获得CgHOG1基因全长1164 bp,编码387个氨基酸序列(GenBank No. KC480066);氨基酸序列与来源于Ogataea parapolymorpha的Hog1p同源性最高,为86%;该基因在酿酒酵母hog1Δ缺失突变株中异源表达能够显著提高菌株的抗盐耐高渗和甘油合成能力。【结论】本文所获得的基因CgHOG1是一个具有耐高渗和过量合成甘油调控功能的新基因,研究结果为产甘油假丝酵母超高渗应答机制的研究及抗盐耐旱作物改造提供了新的基因。     

REMI介导电转化产甘油假丝酵母

为了分离耐高渗和甘油代谢相关基因,以Zeocin为选择标记,利用REMI技术电转化产甘油假丝酵母Candida glycerinogenes。考察了7种限制性内切酶对转化的影响,选择Hind III进一步优化了转化的几个条件。结果表明,在OD₆₀₀≈1.3 时收集细胞,在1.5 kV 电压下,感受态细胞浓度为2.0×10⁹个细胞/mL,100U Hind III时,能获得129个转化子/μg DNA的较高转化率,58% 的转化子稳定,表明REMI技术适合于产甘油假丝酵母的转化。     

产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶编码基因的克隆

当酵母细胞处于高渗压环境时,甘油被诱导合成以提高其胞内渗透压,这一过程受ＨＯＧ途径的调控。ＧＰＤ１基因为ＨＯＧ途径的重要靶基因,高效表达使胞内３磷酸甘油脱氢酶酶活水平提高可极大地提高甘油的产量。本研究将产甘油假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｇｌｙｃｅｒｏｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）染色体ＤＮＡ经Ｓａｕ３ＡＩ部分酶解后的５～１０ｋｂＤＮＡ片段与经ＢａｍＨＩ线性化及ＣＩＰ处理过的酵母大肠杆菌穿梭质粒ＹＥｐ５１连接,以大肠杆菌ＤＨ５α为受体,构建产甘油假丝酵母的染色体基因文库。通过遗传互补法,在含５０ｇ／Ｌ氯化钠的培养基上筛选出１５个转化子,对转化子０６０１进行了进一步鉴定,转化子０６０１所含质粒ＹＥｐ０６０１带有ＹＥｐ５１的标记并可以消除Ｓａｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ６４２菌株由于其ＧＰＤ１,ＧＰＤ２两基因的缺失突变而表现出的渗透压敏感性,表明已克隆到产甘油假丝酵母的编码胞浆３磷酸甘油脱氢酶的基因     

产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶编码基因的克隆

当酵母细胞处于高渗压环境时,甘油被诱导合成以提高其胞内渗透压,这一过程受ＨＯＧ途径的调控。ＧＰＤ１基因为ＨＯＧ途径的重要靶基因,高效表达使胞内３磷酸甘油脱氢酶酶活水平提高可极大地提高甘油的产量。本研究将产甘油假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｇｌｙｃｅｒｏｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）染色体ＤＮＡ经Ｓａｕ３ＡＩ部分酶解后的５～１０ｋｂＤＮＡ片段与经ＢａｍＨＩ线性化及ＣＩＰ处理过的酵母大肠杆菌穿梭质粒ＹＥｐ５１连接,以大肠杆菌ＤＨ５α为受体,构建产甘油假丝酵母的染色体基因文库。通过遗传互补法,在含５０ｇ／Ｌ氯化钠的培养基上筛选出１５个转化子,对转化子０６０１进行了进一步鉴定,转化子０６０１所含质粒ＹＥｐ０６０１带有ＹＥｐ５１的标记并可以消除Ｓａｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ６４２菌株由于其ＧＰＤ１,ＧＰＤ２两基因的缺失突变而表现出的渗透压敏感性,表明已克隆到产甘油假丝酵母的编码胞浆３磷酸甘油脱氢酶的基因     

产甘油假丝酵母甘油代谢关键酶的研究

本文对产甘油假丝酵母的甘油代谢关键酶进行了研究,发现产甘油假丝酵母同化甘油能力极弱,少量葡萄糖明显改善其同化甘油的能力;线粒体3磷酸甘油脱氢酶受3磷酸甘油的强烈诱导,受葡萄糖代谢的阻遏。在甘油发酵过程中,产甘油假丝酵母胞浆3磷酸甘油脱氢酶酶活处于较高水平并在36h和60h时出现两次酶活高峰,其中第一次酶活峰值水平决定产甘油假丝酵母的甘油合成和积累水平,成为甘油高速积累期(18～48h)甘油合成的关键性的限速酶。在甘油发酵18～48h内,3磷酸甘油酯酶的酶活处于高水平,并在36h时出现酶活峰值;处于缓慢甘油积累阶段的48～72h间,3磷酸甘油酯酶已处于低水平表达,此时,3磷酸甘油酯酶则成为甘油合成的限速酶。产甘油假丝酵母稳定并高表达其胞浆3磷酸甘油脱氢酶基因并且其所表达的3磷酸甘油酯酶酶活远高于胞浆3磷酸甘油脱氢酶这一特征是其高产甘油根本所在。     

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)染色体倍性分析

摘要：【目的】产甘油假丝酵母作为一株优良高产甘油菌株,已成功应用于工业生产15年。近年来由于产甘油假丝酵母染色体倍性尚不明确,限制了对其进行遗传改造的研究进展,因而我们对产甘油假丝酵母染色体倍性研究,分析确定其染色体倍性。【方法】选用酿酒酵母细胞进行生孢,制备酿酒酵母单倍体细胞作对照,并选用热带假丝酵母作为二倍体酵母细胞对照,利用血球计数板得到热带假丝酵母、产甘油假丝酵母、单倍体及二倍体酿酒酵母细胞数,提取染色体,通过二苯胺检测法测定DNA含量。由于在相同紫外照射条件下单倍体细胞比二倍体细胞更容易死亡,因     

溶氧对Candida glycerinogenes产甘油发酵过程的影响

研究了溶氧浓度对产甘油假丝酵母分批发酵生产甘油过程的影响。实验结果表明：当溶氧浓度控制在30%时,C. glycerinogenes的甘油产量、得率和产率达到最高,分别为120.7 g/L、0.575 g/g和1.69 g/(L•h),而糖酵解代谢副产物形成最少。当溶氧浓度为10%时,发酵过程呈现出“巴斯德效应”的特征,生成的酵解代谢副产物维持在较高水平。在快速生长阶段,随着溶氧从10%增加到60%,细胞呼吸类型表现为从厌氧呼吸向好氧呼吸转变,酵解代谢副产物依次减少。在生长稳定期,控制的溶氧浓度越高,酵解代谢副产物乙醇、乙酸等的生成减少。分别选用Logistic方程、Luedeking-Piret方程和Luedeking-Piret-like方程,能较好地模拟细胞生长、甘油合成和葡萄糖消耗的动力学过程。     

利用荧光蛋白研究产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD启动子

[目的]克隆产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD的启动子(PCggpd),并通过报告基因gfp的差异表达来研究葡萄糖浓度对PCggpd在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的诱导特性.[方法]采用PCR扩增的方法分别从产甘油假丝酵母基因组和pCAMBIA1302载体中克隆出CgGPD的启动序列PCggpd和绿色荧光蛋白基因gfp.将两个基因同时构建到酿酒酵母表达载体pYX212-zeocin中,构建时将绿色荧光蛋白基因gfp置于CgGPD的启动序列下游,获得重组质粒pYX212-zeocin-PCggpd-gfp.通过电击转化酿酒酵母W303-lA.将重组酿酒酵母S.cerevisiae W303-1A-GFP置于不同葡萄糖浓度培养基中进行培养,利用荧光显微技术对其进行荧光检测.[结果]重组酿酒酵母能产生稳定的荧光,当葡萄糖浓度为2%时,重组酿酒酵母在YEPD培养基中产生较弱的荧光,随着葡萄糖浓度的升高,荧光强度有明显的增强.[结论]PCggpd属于环境胁迫诱导型启动子,高浓度的葡萄糖能诱导PCggpd启动绿色荧光蛋白的高水平表达,这对完善产甘油假丝酵母的遗传背景研究,阐明其高产甘油的机理具有重要意义.     

玉米浆在产甘油假丝酵母甘油发酵中的作用机理

以复合培养基和合成培养基进行比较发酵,研究了玉米浆在产甘油假丝酵母甘油发酵过程中的作用机理。结果表明:玉米浆中的磷、氮和微量元素是影响产甘油假丝酵母甘油发酵的3个关键因素。当玉米浆磷浓度为121·75mg/L(玉米浆浓度为14g/L),最大甘油转化率达到53·44%。玉米浆磷可以调节EMP途径与HMP途径之间碳架代谢流的分布,随着玉米浆浓度进一步增加,过量磷能抑制HMP途径而激活EMP途径,因而复合培养基各项发酵参数的变化非常显著。玉米浆氮对磷的调节功能有协同作用,但并不是产甘油假丝酵母甘油发酵的理想氮源。玉米浆中的微量元素能够显著提高葡萄糖的消耗速率、促进菌体的生长和增加甘油的产量。     

新一代高产甘油重组菌的构建及其初步发酵

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes WL2002-5)是一株发酵生产甘油的工业化菌株。为进一步提高其产甘油能力,本研究利用前期研究中成功克隆的产甘油假丝酵母中甘油合成关键酶3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD1,构建根癌农杆菌双元载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1后,电击转化根癌农杆菌LBA4404,通过根癌农杆菌介导法(ATMT)转化产甘油假丝酵母,构建了产甘油假丝酵母重组菌。并从中筛选出一株酶活力和产甘油性能较好的产甘油假丝酵母重组菌株C.g-G8。以葡萄糖为底物摇瓶发酵96h后,重组菌C.g-G8的甘油产量比野生型菌株Candida glycerinogene提高18.06%,平均耗糖速率提高12.97%,平均酶活力提高27.55%。本研究成功利用ATMT法转化产甘油假丝酵母构建新一代高产甘油菌株。     

渗透压对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响

研究了不同磷浓度时渗透压对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响。结果表明,不同磷含量时,产甘油假丝酵母甘油合成越多,分泌至胞外和积累于胞内的甘油也越多,其最大甘油合成量存在一个最适渗透压。同样;在相同渗透压下,其最大甘油合成量也存在一个最适磷浓度。在相同磷含量时,渗透压增高能够促进胞内聚磷酸盐积累;当渗透压相同时,培养基中磷含量增加,胞内游离磷和聚磷酸盐均增加。在生长稳定期后期,富磷可以促进胞内游离磷和聚磷酸盐积累显著增加。经分析发现,产甘油假丝酵母胞内积累甘油与聚磷酸盐,可能对克服对数生长期细胞数量少而渗透压胁迫大的困境发挥了极其重要的作用,从而能维持其生长稳定期较高的生物量、细胞存活率和甘油产量。     

限磷对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响

研究了磷酸盐限量对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响。结果表明, 当酵母细胞从适磷或富磷培养基转接入低磷培养基时, 发酵过程中胞内积累的磷逐渐减少; 而当菌体从低磷培养基转接入适磷或富磷培养基时, 发酵过程中胞内聚磷酸盐的积累量迅速增加。当细胞在第14小时和第38小时从适磷培养基转接入低磷培养基时甘油得率分别高达60.9%和61.4%, 而甘油产率则分别为2.03 g/(L·h)和2.23 g/(L·h)。这些现象说明限制发酵培养基中的磷浓度是产甘油假丝酵母高产甘油的必要条件, 并为其反复分批发酵法生产甘油提供了重要依据。     

Cloning and characterization of a NAD+-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase gene from Candida glycerinogenes, an industrial glycerol producer

The osmotolerant yeast Candida glycerinogenes produces glycerol as a major metabolite on an industrial scale, but the underlying molecular mechanisms are poorly understood. We cloned and characterized a 4900-bp genomic fragment containing the CgGPD gene encoding a glycerol-3-phosphate dehydrogenase homologous to GPD genes in other yeasts using degenerate primers in conjunction with inverse PCR. Sequence analysis revealed a 1167-bp open reading frame encoding a putative peptide of 388 deduced amino acids with a molecular mass of 42 695 Da. The CgGPD gene consisted of an N-terminal NAD⁺-binding domain and a central catalytic domain, whereas seven stress response elements were found in the upstream region. Functional analysis revealed that Saccharomyces cerevisiae gpd1 Δ and gpd1 Δ/ gpd2 Δ osmosensitive mutants transformed with CgGPD were restored to the wild-type phenotype when cultured in high osmolarity media, suggesting that it is a functional GPD protein. Transformants also accumulated glycerol intracellularly and GPD-specific activity increased significantly when stressed with NaCl, whereas the S. cerevisiae mutants transformed with the empty plasmid showed only slight increases. The full-length CgGPD gene sequence including upstream and downstream regions has been deposited in GenBank under accession no. EU186536 .     

一些氨基酸对产甘油假丝酵母甘油生产的促进作用

以EMP途径与TCA循环中间代谢物的添加为对照,研究在尿素为氮源的产甘油假丝酵母发酵过程中添加氨基酸对甘油产量的影响。结果表明:对甘油产量有强促进作用的氨基酸有谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、赖氨酸、酪氨酸、脯氨酸、组氨酸和丝氨酸,其最适添加浓度在0.26～0.45g/L之间,丙酮酸、α_酮戊二酸、草酰乙酸、柠檬酸和琥珀酸的最适添加浓度在0.24～0.42g/L之间;赖氨酸最适于在0h添加,丙酮酸和草酰乙酸在第14h,谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、甘氨酸、α_酮戊二酸和琥珀酸在第30h,天冬酰胺、丝氨酸和柠檬酸在第48h;在最适条件下添加这些促进剂,甘油产量均呈显著增加趋势,转化率和增加率分别达到60%和16%以上。氨基酸的作用机理为其脱氨形成的碳骨架经特定的分解代谢途径进入TCA循环,使其强化,导致碳代谢流在3_磷酸甘油醛节点处发生转移,使甘油合成途径的代谢流增加。