白念珠菌FLO8基因突变株构建及鉴定

目的构建白念珠菌FLO8基因突变株。方法将白念珠菌FLO8基因插入pCP20质粒载体ADH1启动子之后,通过定向诱变获得FLO8基因R209T、A311T、654Ter、G723R、T751D突变质粒载体,再通过同源重组技术将带有FLO8突变的基因片段整合至SN152flo8/flo8菌株的ADE2位点。结果通过测序鉴定FLO8基因突变质粒载体构建成功;通过PCR验证表明突变FLO8基因整合到SN152flo8/flo8菌株的ADE2位点。结论以pCP20质粒为载体,通过定向诱变、同源重组等技术,可以高效构建白念珠菌FLO8基因突变株。     

基于Hog-MAPK信号通路探讨白念珠菌氟康唑耐药机制的实验研究

目的探讨Hog-MAPK信号通路在白念珠菌氟康唑耐药机制中的作用。方法通过Real-Time PCR、Western blot等方法比较白念珠菌氟康唑敏感株与耐药株Hog-MAPK信号通路相关的HOG1等基因的mRNA表达,以及磷酸化p38 MAPK蛋白表达的差异,并应用微量液基稀释法检测白念珠菌HOG1基因缺陷株及其原始亲代菌株/标准株对氟康唑MIC值的差异。结果白念珠菌氟康唑敏感株与耐药株之间Hog-MAPK信号通路相关基因mRNA表达和蛋白表达存在一定差异性,敏感株的表达在一定程度上低于耐药株,HOG1基因缺陷株对氟康唑更为敏感。结论白念珠菌氟康唑耐药性可能与Hog-MAPK信号通路中部分基因和蛋白表达有关,这些基因和蛋白表达的降低可能使耐药性发生改变。     

白念珠菌新型耐药基因MXR1的敲除与鉴定

目的 构建用于白念珠菌MXR1基因敲除的载体质粒,并通过Ura-Blaster策略敲除MXR1两条等位基因.方法 分别扩增白念珠菌MXR1基因ORF两侧上下游的片段,通过酶切与连接反应,将上下游片段分别插入到p5921质粒的hisG-URA 3-hisG盒两端,从而形成MXR1敲除载体质粒pUC-MXR1-URA3.通过Ura-Blaster策略将载体质粒转染到白念珠菌RM 1000内,并采用PCR和Southern-blot杂交方法鉴定各步转染、复筛所得的阳性克隆.结果 成功获得MXR1基因缺失的菌株.结论 MXR1基因缺失菌株的构建,有助于深入研究白念珠菌耐药机制.     

酿酒酵母adh2和ald6双基因缺失突变株的构建

酿酒酵母乙醇合成代谢过程中, 阻断或削弱乙醛至乙酸代谢流不但能增强乙醇合成流, 同时还能降低发酵乙酸含量。本研究以乙醇脱氢酶Ⅱ(adh2)基因缺陷型酿酒酵母YS2-Dadh2为出发菌株, 应用长侧翼同源两步PCR(LFH-PCR)策略构建乙醛脱氢酶Ⅵ(ald6)基因敲除组件, 转化酿酒酵母YS2-Dadh2敲除ald6基因, 之后转入表达质粒pSH65到阳性克隆中, 半乳糖诱导表达Cre重组酶切除Kanr基因筛选标记, 最后, 传代丢失质粒pSH65获得单倍体ald6基因缺失突变株。利用同样的敲除组件和技术再次敲除其等位基因, 最终获得双基因缺失突变株YS2-△adh2-Dald6。发酵实验表明与出发菌株YS2相比, 突变株乙酸合成量降低18%, 乙醇最高产量提高12.5%。     

白念珠菌CaCSC1基因的敲除和功能研究

目的构建白念珠菌CaCSC1基因的基因缺失株,并初步探究它的功能。方法设计长引物,通过PCR直接扩增出带有SAT1flipper的CaCSC1基因敲除盒,转化到野生型白念珠菌菌株CAI4,并通过PCR鉴定出基因型正确的转化子,得到CaCSC1的基因缺失株。最后,通过倍比稀释的方法进行表型筛选。结果成功得到CaCSC1基因的缺失菌株。基因缺失菌株对酮康唑(Ketoconazole)敏感,对Zn2+、Mn2+和荧光增白剂(Calcofluor white)表现出耐受性。结论 CaCsc1蛋白参与对锌离子和锰离子的稳态调控,和细胞膜和细胞壁的完整性也相关。     

长引物P CR法构建白念珠菌SCH9-MYC融合菌

目的：构建白念珠菌SCH9?MYC融合菌。方法运用长引物PCR扩增含有MYC标签和ARG4筛选标记的质粒序列,采用醋酸锂转染法将质粒序列同源重组到白念珠菌SN152的SCH9基因开放阅读框的C末端,在SC?Leu?选择性培养基上筛选阳性克隆,抽取阳性克隆基因组进行PCR验证,将验证为阳性的转染子进行生长曲线测定、spot assay、菌丝诱导实验,进一步筛选出表型正常的融合菌。结果通过PCR验证鉴定出3株融合菌构建正确,通过生长曲线测定、spot assay、菌丝诱导实验筛选出两株表型正常的融合菌菌株。结论运用长引物PCR扩增方法同源重组可以正确构建白念珠菌SCH9?MYC融合菌菌株。     

酿酒酵母HOR2基因缺失突变株的构建

目的:构建酿酒酵母HOR2基因缺失的突变株并研究其对甘油和乙醇产量的影响。方法:以PCR为基础,通过同源重组的方式使目的基因缺失。结果:通过设计含有与HOR2(GPP2)基因两侧序列同源的长引物,以质粒PUG6为模板进行PCR构建含有Cre/loxP系统的酿酒酵母HOR2基因敲除组件,转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS2,获得为loxP-kan-loxP序列组件所替换而产生kanr的阳性克隆子。然后再将质粒PSH65转入阳性克隆子诱导表达Cre酶切除筛选标记,在原ORF基因处保留一个loxP位点,丢失质粒后获得HOR2单倍体缺陷型菌株。重复转化敲除组件实现另一条等位基因的敲除。发酵实验表明,突变株甘油产量降低3.34%,乙醇产量提高1.96%。结论:成功获得了酿酒酵母HOR2基因缺失的突变株,并命名为YS2-HOR2。     

碱性pH条件下白念珠菌钙离子通道CCH1和MID1基因对钙内流的影响及Crz1p转录因子对其的调控作用

白念珠菌Candida albicans对环境pH的适应能力与其致病性有密切关系,钙信号转导途径介导许多环境压力的应答并伴随胞内钙离子浓度的瞬间变化。通过构建钙通道基因CCH1和MID1的缺失突变株,在碱性pH条件下,研究其对胞内钙内流的影响以及转录因子Crz1p对CCH1和MID1基因的调控作用。使用二步法PCR介导的基因敲除技术构建cch1Δ/Δ和mid1Δ/Δ突变菌株,利用流式细胞术比较野生型和突变型菌株在碱性pH条件刺激下胞内钙的瞬间变化,进一步构建pPHO89-LacZ重组质粒并利用β-半乳糖苷     

酿酒酵母SNF4基因敲除缺失菌株的构建

构建一株酿酒酵母SNF4基因缺失菌株并研究其对乙醇产量的影响。扩增带有SNF4基因上下游同源序列和Kanr筛选标记的SNF4基因敲除组件,转化到酿酒酵母YS2获得阳性克隆子,然后将质粒pSH65转到阳性克隆子中,半乳糖诱导pSH65表达Cre酶切除Kanr筛选标记,获得SNF4等位基因完全缺失菌株YS2-△SNF4。发酵实验结果表明,缺失菌株YS2-△SNF4乙醇产量较出发菌株提高了7.57％。利用Cre-LoxP系统,成功构建了SNF4等位基因完全缺失菌株并提高乙醇产生量。     

白念珠菌氟康唑耐药株与敏感株SRB1、CDR1、ERG11表达比较分析

目的了解SRB1在白念珠菌氟康唑耐药株和敏感株表达差异,探讨与白念珠菌耐药性的关系。方法使用同一亲本来源的白念珠菌氟康唑耐药株CA-16和敏感株CA-3为研究对象,采用实时荧光定量RT-PCR的方法扩增各菌株的目的基因SRB1、CDR1、ERG11,观察各菌株目的基因表达情况。结果与白念珠菌氟康唑敏感株CA-3相比,在mRNA水平氟康唑耐药株CA-16的SRB1和耐药基因CDR1、ERG11表达升高,SRB1、CDR1、ERG11表达水平差异具有统计学意义(P0.05)。结论白念珠菌SRB1的表达增高和白念珠菌对氟康唑耐药密切相关,SRB1可能是一个新的耐药候选基因。     

白念珠菌高铁还原酶FRP1基因的功能

白念珠菌((Candida albicans)获得铁的能力影响细胞的生长和毒力,高铁还原酶是白念珠菌高亲和铁吸收系统的重要组成部分.[目的]构建高铁还原酶FRP1(Ferric reductase protein)基因缺失突变株,对FRP1基因功能进行初步研究.[方法]使用Northem杂交的方法分析FRP1基因在缺铁和富铁条件下的表达.利用PCR介导的基因敲除技术构建frp1缺失突变株,并且对野生型和缺失突变株在细胞高铁还原酶活性以及缺铁条件下的生长情况进行比较分析.[结果]缺铁条件可以诱导FRP1基因的表达.frp1缺失突变株不能在铁缺陷的固体培养基上生长.[结论]FRP1蛋白可能是白念珠菌在缺铁条件下起主要作用的高铁还原酶.     

白念珠菌高铁还原酶职FRP1基因的功能

白念珠菌((Candida albicans)获得铁的能力影响细胞的生长和毒力,高铁还原酶是白念珠菌高亲和铁吸收系统的重要组成部分.[目的]构建高铁还原酶FRP1(Ferric reductase protein)基因缺失突变株,对FRP1基因功能进行初步研究.[方法]使用Northem杂交的方法分析FRP1基因在缺铁和富铁条件下的表达.利用PCR介导的基因敲除技术构建frp1缺失突变株,并且对野生型和缺失突变株在细胞高铁还原酶活性以及缺铁条件下的生长情况进行比较分析.[结果]缺铁条件可以诱导FRP1基因的表达.frp1缺失突变株不能在铁缺陷的固体培养基上生长.[结论]FRP1蛋白可能是白念珠菌在缺铁条件下起主要作用的高铁还原酶.     

伤寒沙门菌bcfD基因敲除突变株的构建

目的:构建伤寒沙门菌Ty2菌株菌毛亚单位bcfD基因敲除突变株.方法:利用交错PCR得到bcfD基因缺失且含其两侧翼序列的片段,将该片段与pMD 18-T连接,亚克隆到pYG4,电转入大肠埃希菌S17-1/λpir菌株,阳性菌株与受体菌伤寒沙门氏菌Ty2进行固相杂交后筛选.结果:成功获得敲除bcfD基因序列954bp的敲除突变株.结论:交错PCR有利于细菌基因精确敲除突变株的构建,bcfD基因敲除株的构建将为进一步研究该基因在伤寒沙门菌中的功能奠定了基础.     

都柏林念珠菌的PCR-RFLP鉴定

目的建立一种准确、可靠的鉴定都柏林念珠菌基因型的方法。方法临床念珠菌分离自临床生殖器念珠菌病患者,45℃温度试验时几乎不生长,且其他表型实验结果也符合都柏林念珠菌特征。对41例临床念珠菌和1例白念珠菌标准株、1例都柏林念珠菌标准株rDNA内部转录间隔区的基因进行聚合酶链反应（PCR）扩增,HpyF10Ⅵ酶切后观察PAGE图谱。结果聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）后,39例临床株鉴定为白念珠菌。2例临床菌株带型特殊,测序后行BLAST比对分析,1例鉴定为白念珠菌,另1例尚不能肯定为都柏林念珠菌,还需要进一步以其他分子生物学方法鉴定。结论PCR-RFLP方法酶切后两种念珠菌带型区分明显,可以鉴别大部分临床菌株。基因测序是该方法有意义的补充。     

白念珠菌SPE1基因高表达菌株构建及鉴定

目的构建白念珠菌SPEl基因高表达菌株。方法将白念珠菌．SPEl基因的ORF置于高表达质粒载体pCaE—xP的MErF3启动子后面,构建pCaEXP—SPEJ的高表达质粒,然后采用醋酸锂转染法将高表达质粒转染白念珠菌RMl000中,在SD—ura’met—cys-选择性固体培养基上筛选阳性克隆,抽取基因组进行PCR验证,将验证为阳性转染子的菌落采用RealTimeRT．PCR方法进行SPE1基因转录水平的表达验证。结果通过酶切鉴定pCaEXP—SPEl高表达质粒构建正确;通过PCR验证表明SPEl基因整合到亲本菌中的RPl0位点;通过RealTimeRT—PCR方法筛选出sPEJ基因在转录水平高表达的菌株。结论利用高表达质粒载体pCaEXP通过基因同源重组等方法正确构建SPEl基因高表达的白念珠菌。     

白念珠菌14-3-3蛋白Bmh1在细胞生长和菌丝发育中的功能解析

【目的】应用Tet-off启动子研究白念珠菌唯一的14-3-3蛋白Bmh1在白念珠菌生长和菌丝发育过程中的功能。【方法】在白念珠菌URA3+菌株SN152中,我们敲除了1个BMH1基因拷贝,并用Tet-off启动子替代另一个BMH1基因拷贝的启动子,得到了可以用强力霉素(Doxycycline)控制Bmh1表达水平的菌株。然后我们通过斑点试验和形态学观察对该菌株的生长和菌丝发育表型进行了分析。通过在ras1、flo8、efg1、cph1、tec1等重要菌丝发育调控因子突变体中过表达Bmh1,我们初步研究了Bmh1在菌丝发育调控网络中的位置。最后,我们构建了一些不同C末端的Bmh1嵌合体并检测了其对白念珠菌生长和菌丝发育的影响。【结果】Doxycycline诱导Bmh1表达水平下调时严重抑制了细胞的生长。非Doxycycline诱导条件下Bmh1高表达强烈促进了细胞的菌丝发育。这一促进作用绕过了ras1、efg1、cph1和tec1等基因缺失的影响,却被flo8基因的缺失阻断。C末端缺失或更换异源C末端的所有Bmh1突变株在Doxycycline诱导时都能够正常生长,但是没有明显促进菌丝发育。【结论】验证了白念珠菌14-3-3蛋白Bmh1是细胞生长所必需的,证明了Tet-off启动子可以严密控制Bmh1的表达水平。Bmh1是一个菌丝发育的正调控因子,位于Ras1、Efg1、Cph1和Tec1的下游,Flo8的上游。Bmh1的保守结构域是细胞生长所必需的,而C末端则是生长非必需的。     

一种强力霉素诱导型白念珠菌基因敲除与筛选标记再循环工具包

【目的】在白念珠菌中建立一个快捷方便经济的基因敲除与筛选标记再循环的DNA操作系统。【方法】通过ExoIII介导的不依赖于连接酶的克隆策略,在异源筛选标记基因CmLEU2、CdHIS1和CdARG4基因的两侧分别插入了loxP位点,成为筛选标记基因盒扩增的模板。全基因合成了经过白念珠菌密码子优化的rTetR元件,并组装成Tet-on启动子。将密码子优化的重组酶Cre基因置于该启动子控制下。然后将他们插入筛选标记基因CdHIS1和CdARG4的CDS区域,形成筛选标记基因再循环载体。【结果】构建了3个用于白念珠菌基因敲除的侧翼含有loxP位点的筛选标记基因载体,以及2个含有Tet-on启动子控制的Cre酶的载体用于筛选标记基因的再循环。【结论】成功构建了一个白念珠菌中可诱导的基因敲除和筛选标记再循环的载体系统并成功应用于多个基因缺失株构建。这个系统有助于快速构建白念珠菌的单基因和多基因敲除菌株。     

一种强力霉素诱导型白念珠菌基因敲除与筛选标记再循环工具包（英文）

【目的】在白念珠菌中建立一个快捷方便经济的基因敲除与筛选标记再循环的DNA操作系统。【方法】通过ExoIII介导的不依赖于连接酶的克隆策略,在异源筛选标记基因CmLEU2、CdHIS1和CdARG4基因的两侧分别插入了loxP位点,成为筛选标记基因盒扩增的模板。全基因合成了经过白念珠菌密码子优化的rTetR元件,并组装成Tet-on启动子。将密码子优化的重组酶Cre基因置于该启动子控制下。然后将他们插入筛选标记基因CdHIS1和CdARG4的CDS区域,形成筛选标记基因再循环载体。【结果】构建了3个用于白念珠菌基因敲除的侧翼含有loxP位点的筛选标记基因载体,以及2个含有Tet-on启动子控制的Cre酶的载体用于筛选标记基因的再循环。【结论】成功构建了一个白念珠菌中可诱导的基因敲除和筛选标记再循环的载体系统并成功应用于多个基因缺失株构建。这个系统有助于快速构建白念珠菌的单基因和多基因敲除菌株。     

表皮生长因子受体在阴道念珠菌病发病过程中的作用初探

目的初步探索表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)在阴道念珠菌病发病过程中的作用及分子机制。方法培养阴道上皮细胞(VK2/E6E7细胞),白念珠菌刺激后利用荧光定量PCR检测EGFR及可能相关的免疫通路因子的表达。构建EGFR-siRNA VK2/E6E7细胞模型,与白念珠菌共培养后,分别利用ELLISA及全自动细胞检测仪检测表皮生长因子受体敲除前后阴道上皮细胞分泌细胞因子的变化以及对白念珠菌感染防御能力的改变。构建阴道念珠菌感染小鼠模型,qPCR检测阴道组织表皮生长因子受体及免疫通路因子的表达;并检测EGFR磷酸化抑制剂阻断通路后,阴道组织局部的真菌载量和炎性细胞的变化。结果 qPCR检测显示,EGFR、STAT3、GM-CSF及IL-1β在VK2/E6E7细胞感染白念珠菌后表达升高,且具有统计学意义(P0.05);ELLISA检测结果显示,EGFR-siRNA VK2/E6E7细胞感染白念珠菌后GM-CSF、IL-8、 IL-1β、 MIP-3α表达显著下降(P0.05);全自动细胞检测仪检测结果显示,EGFR敲除细胞在感染白念珠菌30 h后的防御能力和细胞活性较正常细胞明显降低。qPCR检测显示小鼠阴道感染白念珠菌后EGFR、HER2、STAT3、IL-8表达升高具有统计学意义(P0.05);局部应用磷酸化抑制剂阻断EGFR通路后,小鼠阴道灌洗液菌载量较对照组明显增加,且在感染后第7日差异有统计学意义(P0.05)。结论表皮生长因子受体及其通路因子在阴道念珠菌病发病过程中起到较为重要的作用。     

酿酒酵母NST1基因敲除菌的构建及其对抗氧化的影响

构建一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NST1基因缺失菌株并研究其对抗氧能力的影响。以酿酒酵母BY4741中的NST1基因为研究对象,利用Cre-LoxP基因敲除系统将NST1基因与G418抗性基因(kan~r)相替换,实现目的基因的敲除。通过稀释点样实验、荧光电子显微镜检测和荧光定量PCR等技术分析NST1基因在酿酒酵母抗氧化体系中的作用。经过G418抗性筛选和基因组PCR鉴定,成功获得了NST1基因缺失菌株nst1Δ,实验数据显示nst1Δ重组菌胞内ROS增多,并且降低了细胞壁完整性信号通路(CWI)途径下游基因RLM1的表达水平,表明NST1基因的敲除对酿酒酵母BY4741的抗氧化性能有影响。