烟曲霉相关基因、转录因子在其细胞壁重塑、稳态和生长定位中的作用

<正>烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是一种腐生的丝状真菌,其营养菌丝存在于土壤、空气和有机物质中,是免疫功能严重受损患者最常见的感染性死亡原因之一。烟曲霉细胞壁是一个动态的结构,这种动态结构成为其对抗环境的主要防线[1]。由于支持烟曲霉生长和繁殖的自然过程的变化或者所处环境应激反应,其细胞壁会经历持续的生物合成和重塑[2]。研究发现,许多基因可通过改变细胞壁成分含量而使细胞壁结构重塑。烟曲霉分生孢子的形成也会伴随着孢子细胞壁的重塑[3-4]。另外,相关基因、转录因子会控制细胞壁的生物合成,调节烟曲霉细胞壁的稳态[5-6]。分生孢子发展形成菌丝的过程、基因的正确定位对烟曲霉的致病相当关键[7]。抵抗宿主环境压力的机械强度主要由其细胞壁提供,所以细胞壁的破坏对菌丝形态有深远的影响。鉴于烟曲霉细胞壁在真菌生理学中的重要作用,它被认为是抗真菌药物的一个极好的靶点。     

烟曲霉细胞壁的组分、组装及其功能概述

环境中普遍存在的腐生丝状真菌烟曲霉Aspergillus fumigatus在免疫功能低下或缺陷的人群中可引起多种急慢性疾病,包括致死率很高的侵袭性曲霉病。细胞壁作为真菌的细胞外骨架结构不仅起维持细胞形状、保护细胞抵抗外界压力等作用,在病原真菌极性生长、入侵新的生态域、启动宿主免疫反应中也起重要作用。细胞壁组分还是真菌感染的分子诊断基础和开发抗真菌药物的理想靶标。近几十年来烟曲霉细胞壁的遗传、生物化学及免疫学方向的研究使其成为研究真菌细胞壁的模式真菌。本文主要概述烟曲霉细胞壁的组分、分子组装机制及其在真菌生存和感染中的作用,并对未来研究方向提出了展望。     

白念珠菌细胞壁相关基因和蛋白的研究进展

随着真菌深部感染率的上升,细胞壁作为真菌中特有和必须的细胞结构,又因其不存在于哺乳动物细胞中,已逐步成为重要的药物作用靶点。以白念珠菌为例,参与其细胞壁构成、分泌、表达等相关的结构功能基因和蛋白已逐步发现和证实,这为发现抗真菌药物新靶标、设计新型抗真菌药物奠定理论基础。     

条件致病真菌烟曲霉麦角甾醇合成通路遗传调控机制研究进展

环境中普遍存在的腐生性条件致病真菌——烟曲霉是引起人类侵袭性曲霉病的重要病原,因此,研究烟曲霉的致病机理,开发有效的治疗药物是全球关注的热点。麦角甾醇是真菌细胞膜的主要成分,参与细胞内许多生物学过程,麦角甾醇合成通路中的羊毛甾醇14-α-去甲基化酶Erg11A (Cyp51A同源蛋白)是抗曲霉病唑类药物的重要靶点,其受到转录因子Srb A与CCAAT结合复合物(CBC)的协同调控作用。文中阐述了主要的抗真菌药物以及抗真菌唑类药物的作用靶点-麦角甾醇及其合成途径的遗传调控机制的研究进展,同时分析了烟曲霉产生抗性的机制,期望为认识烟曲霉耐药产生和研发新型抗真菌药物提供帮助。     

脂筏在真菌极性生长中的作用

脂筏（lipid raft）是细胞膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域（microdomain）,参与细胞的多种生物学行为.随着研究的进一步深入,发现脂筏在真菌的极性生长方面也起着重要的作用.该文通过介绍真菌极性生长、脂筏的结构与功能等,阐述脂筏在真菌细胞极性生长中的作用,为阻断真菌极性生长并开发新的抗真菌药物靶点提供理论依据.     

抗真菌药物的新作用靶点

近年来,由于各种原因真菌感染发病率明显升高,当前临床上使用的抗真菌药物都存在一定的毒副作用且出现越来越多的耐药菌株,寻找新的药物作用靶点,研发新的、高效、安全的抗真菌药物成了当务之急。现着重对抗真菌药物的几个新的药物作用靶点包括真菌细胞壁、延长因子以及双组分信号转导蛋白等进行详细阐述。     

小GTPase蛋白在烟曲霉耐药性和致病力中作用的研究进展

<正>烟曲霉是广泛存在于自然环境中的腐生真菌,其产生大量的分生孢子易被人体吸入肺中,在一定条件下可造成艾滋病患者和器官移植患者等免疫低下人群的感染。已有研究显示,临床中侵袭性曲霉感染致死率达50%以上,而造成这种高致死率的原因与烟曲霉菌丝极性生长、压力应激和免疫逃逸等过程有关^[1-2]。此外,临床上也面临烟曲霉对抗真菌药物(如三唑类和棘白菌素类等)耐受水平不断升高的棘手难题,这其中重要的耐药分子机制包括药物靶点突变/靶点高表达、药物应激反应等^[3-4]。因此,阐明烟曲霉在药物耐受和致病力等方面的重要分子机制,有助于临床和科研工作中防治烟曲霉感染和开发新型的靶点药物。目前的证据显示,小GTPase蛋白可能是参与调控致病真菌耐药性和致病力的关键分子基础^[5]。该蛋白在真菌细胞中多以单体形式(21～30kD)保守存在,可通过水解GTP实现开关模式转换,并以此参与细胞生长和分化、应激外界压力刺激等关键生命过程^[5]。小GTPase蛋白根据分子特征和功能等分为Rab、Ras、Arf、Rho和Ran...     

作用于细胞壁的抗真菌药物研究进展

与人类细胞相比,细胞壁为真菌的特有结构,因此作用于细胞壁的抗真菌药物相较于其他类型抗真菌药物而言具有高效、低毒的特点,是迄今为止安全性最高的一类抗真菌药物。本文对作用于细胞壁的抗真菌药物进行综述,根据作用机制及靶点的不同分别介绍葡聚糖合成酶抑制剂、几丁质合成酶抑制剂及糖基磷脂酰肌(glycosylphosphatidylinositol,GPI)锚定蛋白抑制剂,对其进行总结和归纳,为相关药物的研发及将来的临床应用前景提供参考。     

ε-多聚赖氨酸和谷胱甘肽影响抗真菌药物对烟曲霉作用效果

为了解多肽ε-多聚赖氨酸和谷胱甘肽对常见抗真菌药物体外抗人类病原真菌烟曲霉效果的影响,利用平板点菌实验、最低抑菌浓度实验中的微量液基法和E-test法,以及ROS检测等方法研究ε-多聚赖氨酸和谷胱甘肽在抗真菌药物体外抗烟曲霉过程中的作用以及可能的作用机制。通过基因定点敲除谷胱甘肽合成酶基因gcsA和gshA观察细胞内谷胱甘肽对于烟曲霉生长的重要性。结果显示,ε-多聚赖氨酸与抗真菌药物尤其是卡泊芬净和伊曲康唑呈协同作用;而谷胱甘肽则能够明显地拮抗伊曲康唑和卡泊芬净的抗烟曲霉作用。ε-多聚赖氨酸与伊曲康唑联用时菌体内的ROS含量比单独使用伊曲康唑时显著增多,而谷胱甘肽与伊曲康唑联用时菌体内的ROS含量比伊曲康唑单独使用时减少。基因敲除实验结果显示γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶基因gcsA为烟曲霉生长必需基因,而谷胱甘肽合成酶基因gshA对生长没有明显影响。结果表明,ε-多聚赖氨酸与谷胱甘肽影响了伊曲康唑和卡泊芬净对烟曲霉的作用。ε-多聚赖氨酸通过促进伊曲康唑刺激细胞产生ROS诱导烟曲霉死亡从而实现协同作用。谷胱甘肽为细胞内必需还原型多肽,通过消除胞内伊曲康唑诱导产生的ROS从而产生拮抗作用。     

Toll样受体在烟曲霉侵染宿主细胞过程中作用的研究进展

烟曲霉侵染宿主细胞时伴有明显的细胞肌动蛋白骨架重排,而重要模式识别受体PRRs(pattern recognition receptors)之一,Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)参与调节病原细菌诱导的宿主细胞肌动蛋白骨架重排,其中TLR2和TLR4两亚型可以识别烟曲霉的病原相关分子模式PAMP(pathogen-assosiated molecular patterns),并诱发炎症因子表达等一系列效应信号,在宿主细胞抗烟曲霉天然免疫中发挥重要作用,但在烟曲霉内化侵入过程中TLR能否特异性介导细胞肌动蛋白骨架重排尚不清楚。因此,研究揭示TLR激活在烟曲霉侵入宿主细胞的调控作用,对寻找可能的抗真菌药物作用靶点具有重要意义。     

抗真菌药物及其作用机制研究

由于唑类药物长期使用,真菌耐药性及其交叉耐药现象不断出现,对临床治疗具有重要威胁。近年来提出新型抗真菌药物的新靶点,并研发出具有高活性强、强疗效的抗真菌药物。本研究对近年来新型抗真菌药的种类、结构和特点进行阐述,并介绍不同型药物对真菌的细胞壁、细胞膜、蛋白质合成、呼吸链等作用新靶点和作用机制的研究进展。     

烟曲霉FADB基因参与菌株耐药的潜在机理

FAD结合的氧化还原酶编码基因FADB (GenBank ID:Afu4g14630)的编码产物在烟曲霉中为一种与FAD结合的氧化还原酶,可能参与真菌的呼吸。为了探究其具体功能,本研究通过克隆烟曲霉FADB基因,构建烟曲霉FADB基因的敲除株,了解该基因对烟曲霉药物敏感性、渗透压、氧化压力物质敏感性的作用机理。采用高通量基因替换方法构建出FADB基因的敲除盒,筛选出符合的烟曲霉FADB敲除株ΔFADB。观察该突变株与野生株AF293对药物敏感性、氧化压力、渗透压物质敏感性的变化。利用E-test法检测ΔFADB对3种唑类药物(泊沙康唑、伊曲康唑、伏立康唑)的敏感性,结果证实ΔFADB对泊沙康唑的敏感性明显提高。在渗透压和氧化压力的培养试验中,与野生株AF293相比较,ΔFADB对氧化剂D-山梨醇和甲萘醌更敏感。加入泊沙康唑后,ΔFADB比野生株AF293产生的活性氧更多。说明烟曲霉FADB基因参与泊沙康唑抗烟曲霉机制并起到一定作用,该基因诱导的氧化应激反应可能是抗真菌药物杀伤真菌的作用机制之一,本研究为烟曲霉唑类耐药机制的研究提供了新的理论基础。     

酿酒酵母孢子壁结构及其合成相关基因研究进展

细胞壁是酵母细胞区别于哺乳动物细胞的重要特征结构。酵母细胞壁的结构组成、合成、再生等与酵母自身繁殖及环境胁迫压力密切相关。目前,酵母孢子壁的形成机理、调控过程机制及孢子壁合成相关基因的功能尚未研究清楚。本文以酿酒酵母为例,简要描述酵母孢子壁的形成过程,重点阐述孢子壁甘露糖层、葡聚糖层、壳聚糖层和二酪氨酸层的结构组成及其合成相关基因的国内外研究进展,以期为抗真菌药物的新靶点研究提供参考。     

烟曲霉极性因子kipA基因的敲除与鉴定

目的构建烟曲霉kipA基因突变株。方法通过In-Fusion技术将kipA基因的上下游基因与抗性基因顺序链接,以潮霉素抗性基因替换靶基因,达到用同源重组手段敲除烟曲霉kipA基因的目的,以realtime-PCR对基因突变株进行鉴定和验证。结果 RT-PCR结果显示,成功构建烟曲霉kipA基因突变株。结论烟曲霉kipA基因突变株的构建,为后续烟曲霉极性生长与血管侵袭性的研究提供了实验基础。     

桂皮醛抗曲霉的敏感性及对烟曲霉细胞壁的影响

目的探讨桂皮醛对曲霉的抗菌活性及对烟曲霉细胞壁的影响,为研发新型靶向抗真菌药物提供依据。方法用沙氏琼脂(4%葡萄糖、1%蛋白胨、2%琼脂)试管稀释法测定曲霉菌MIC。将烟曲霉菌分别制备成1×106 CFU/mL的0.1%的桂皮醛及卡泊芬净吐温80沙氏(4%葡萄糖、1%蛋白胨)液基,37℃孵育48h后,离心、制片,透射电镜观察,以氟康唑作对照。结果桂皮醛、卡泊芬净、氟康唑对曲霉菌MIC(烟曲霉菌0.019 5μg/mL、0.039 1μg/mL、32μg/mL,黄曲霉菌0.039 1μg/mL、0.039 1μg/mL、32μg/mL)。电镜显示0.1%的桂皮醛及卡泊芬净作用烟曲霉菌48h后,细胞壁外层溶解脱落、细胞核及细胞器溶解消失,但细胞膜仍然完整。0.1%氟康唑对烟曲霉菌细胞壁及细胞膜均无影响。结论桂皮醛、卡泊芬净对烟曲霉菌均有较强的抗活性,但桂皮醛优于卡泊芬净。桂皮醛及卡泊芬净作用在烟曲霉菌细胞壁而不影响细胞膜,氟康唑对烟曲霉菌细胞壁及细胞膜均无影响。桂皮醛有望成为一种有效的靶向治疗曲霉菌感染的理想药物。     

两性霉素B脂质体抗烟曲霉的研究

目的通过对两性霉素B脂质体(L-AmB)的烟曲霉抵抗实验的研究,初步探讨其抗真菌的机制,为临床的合理使用两性霉素B脂质体提供实验指导。方法将烟曲霉菌株复苏后,接种于沙保弱平板,恢复正常毒力。用洗液洗脱烟曲霉的孢子,进行两性霉素B脂质体及两性霉素B体外抗真菌的研究;用注射器吸取一定量的含烟曲霉孢子的溶液,注入小鼠的肺部,当确证其肺部感染了烟曲霉后,用L-AmB进行治疗,后期通过观察小鼠肺部的病理结果判断疗效并检测鼠肺部细胞在药物治疗后的细胞自噬相关基因LC3B,Beclin-1的水平。结果 L-AmB组的体内外抑菌作用强于AmB组且L-AmB可显著增加鼠肺部细胞的自噬水平。结论两性霉素B脂质体可通过显著的增加细胞的自噬水平,来有效的抵抗烟曲霉的感染。     

新的抗真菌药物靶点研究进展

近30年来,侵袭性真菌感染发病率持续上升,病死率居高不下,而治疗药物十分有限是造成其高致死率的重要因素之一。因此,发现新的抗真菌靶点和药物,已成为迫切需要。正在研究的新的抗真菌靶点如下：一是信号通路介导的抗真菌靶点,包括钙调神经磷酸酶及其分子伴侣Hsp90、3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶（PKH）以及参与Ras蛋白修饰的相关酶等,其拮抗剂包括传统免疫抑制剂的类似物以及Hsp90抗体、KP-372-1和PS77以及手霉素A等;二是GPI锚定蛋白合成通路的催化酶,其抑制剂有E1210和M720等化合物;三是分泌型天冬氨酸蛋白酶,肽类、逆转录病毒抑制剂,以及砜类的衍生物等均可以抑制这一靶点;四是海藻糖的合成的两个关键酶Tps1和Tps2。鉴于侵袭性真菌感染严重影响人类公共健康安全,而新型抗真菌药物的研发又依赖于新靶点的探索,因此,本文靶向这一核心真菌临床问题,系统介绍了当前新的抗真菌药物靶点发展概况,并在靶点选择可行性以及针对靶点的药物研发策略上提出见解。     

烟曲霉肺部感染的免疫逃逸作用机制研究进展

侵袭性曲霉感染是免疫低下患者死亡重要原因。烟曲霉作为曲霉感染中最为常见的一类是重症患者中常见的肺部真菌感染,具有侵袭性和难治性。其通过吸入宿主体内,通过分泌的蛋白水解酶等定植于肺部。为了对抗宿主体内的保护性免疫反应并持续性生长繁殖,烟曲霉已经开发出了许多复杂且有效的免疫逃逸策略,包括黏附/定植、适应内环境压力、改变营养摄取、逃避宿主补体监视和下调宿主抗真菌反应等多种机制。了解真菌病原体与宿主间复杂的免疫串扰将是研究真菌感染发生机制和治疗标靶的核心内容,为从抗宿主免疫层面探讨烟曲霉治疗方法提供新思路。该文对近年来有关烟曲霉肺部感染的免疫逃逸机制研究进展作一综述。     

植物几丁质酶及其在抗真菌病害中的应用

植物几丁质酶的研究是抗真菌基因工程的热点之一。几丁质酶能够水解真菌细胞壁的主要成分几丁质,在植物抗真菌病害反应中发挥重要的作用。介绍了几丁质酶的基本生物学特性、基因的诱导表达,并对植物几丁质酶基因在抗真菌病害基因工程中的应用进行了阐述。     

细胞壁在细胞极性建立和胚胎发生中的作用

植物细胞壁是一个活性的动态结构,其结构层次与组分随着发育进程而发生变化,且广泛参与细胞的各项生命活动,特别是在参与细胞命运决定、充当细胞发育信使、调控植物胚胎早期极性建立以及模式建成等方面发挥重要作用。