河北地区临床实验室丝状真菌分离鉴定情况分析

目的开展一项由河北地区多所医院参与的临床实验室丝状真菌检测研究,促进实验室丝状真菌检测能力提升。方法共收集丝状真菌菌株,采用沙堡弱培养基和乳酸酚棉兰染色直接镜检进行菌种常规鉴定;中心实验室采用Vitek MS质谱进行复核鉴定,对MS不能有效鉴定的菌种进行核糖体DNA内转录间隔区ITS和/或钙调蛋白CaM测序分析。结果参与研究的15家三级医院2016～2017年共收集到丝状真菌225株。其中烟曲霉133株(59.11%)、黄曲霉/米曲霉28株(12.44%)、黑曲霉复合群18株(8.00%)、聚多曲霉6株(2.67%)、构巢曲霉6株(2.67%)、其他丝状真菌34株(15.11%)。样本类型包括下呼吸道痰标本203株(90.22%),耳道分泌物10株(4.44%),肺泡灌洗液4株(1.78%),其他样本8株(3.56%)。菌株鉴定正确率(148/225)65.78%,错误率(77/225)34.22%。结论丝状真菌感染中最常见的是曲霉菌属,主要以烟曲霉菌、黄曲霉菌和黑曲霉菌为主。传统的鉴定方法错误率高达30%以上,采用微生物质谱鉴定结合ITS/CaM区测序方法可以有效提高丝状真菌的鉴定正确率,为临床丝状真菌的治疗提供病原学依据。     

培养条件对克柔念珠菌MALDI-TOF MS鉴定结果的影响分析

目的探究不同的培养时间、培养温度、培养基种类及培养气体环境对克柔念珠菌基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)鉴定结果的影响。方法收集中国侵袭性真菌耐药监测网(CHIF-NET)2012-2013年中17所医院克柔念珠菌25株,每株菌平行接种在沙堡弱氯霉素琼脂平板(SDA-C)、血琼脂平板等6种培养基,28℃和35℃2种孵育温度,空气和5%CO_2 2种气体环境中孵育,以真菌rDNA ITS测序为金标准,孵育24 h和48 h后,使用Vitek MALDI-TOF质谱仪(简称Vitek MS)和Bruker Autoflex Speed型MALDI-TOF质谱仪(简称Bruker MS)分别进行菌种鉴定,并对其鉴定正确率进行分析。结果克柔念珠菌孵育24 h和48 h时Vitek MS鉴定正确率均为100%,Bruker MS鉴定正确率分别是98.86%和87.43%。28℃SDA-C上生长的克柔念珠菌种水平鉴定准确率较35℃生长的菌株高。比较各种培养基,孵育48 h时SDA-C上生长的克柔念珠菌Bruker MS鉴定正确率(100%)最高。结论克柔念珠菌接种在SDA-C上,28℃空气培养24 h质谱鉴定效果最佳。常规细菌培养基上生长的克柔念珠菌,Bruker MS鉴定分值≥1.700即可认为菌种鉴定可靠。     

MALDI-TOF MS技术在侵袭性丝状真菌快速鉴定中的应用

目的 探索不同培养基、不同培养时间和不同蛋白质提取方法对侵袭性丝状真菌质谱鉴定准确率的影响,旨在提高基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术鉴定侵袭性丝状真菌的准确率。方法 采用分子生物学方法为金标准,同时运用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术对所收集临床丝状真菌进行鉴定。根据分子生物学的鉴定结果,去除VITEK-MS v3.0数据库中没有的菌株,其余菌株接种在沙氏葡萄糖琼脂(SDA)、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)和察氏培养基(CA)3种不同的培养基中,采用2种不同的蛋白质提取方法(甲酸乙腈法和磁珠法),获得了不同培养时间点(2、3、5、7和9 d)的特异性质谱指纹图谱。结果 不同丝状真菌蛋白质提取方法进行比较,甲酸乙腈法总鉴定准确率为79.8%,磁珠法总鉴定准确率为77.5%,2种丝状真菌蛋白质提取方法的质谱鉴定准确率差异无统计学意义(χ²=1.040,P=0.308)。不同培养基进行比较,SDA培养基总鉴定准确率为90.7%,PDA培养基总鉴定准确率为81.4%,CA培养基总鉴定准确率为67.4%,3种不同培养基的丝状真菌质谱鉴定准确率差异有统计学意义(χ     

ITS序列分析与MALDI-TOF MS质谱技术在丝状真菌鉴定中的应用

丝状真菌常用的鉴定方法为形态方法和基因鉴定方法,前者限于检验人员的知识和技能,后者操作繁琐,费用略昂贵,不适合常规开展。因此,寻找丝状真菌快速鉴定方法势在必行。本文采用VITEK MALDI-TOF MS（基质辅助激光解析电离时间飞行质谱）IVD数据库（3.0版本）对临床分离的254株丝状真菌进行鉴定,并以ITS（internal transcribed spacer 内转录间隔区）序列分析为标准,验证MALDI-TOF MS质谱技术鉴定丝状真菌的准确性。结果表明MALDI-TOF MS质谱技术可以对大部分丝状真菌实现快速、准确的鉴定,其中对毛癣菌属（100%）、毛孢子菌属（100%）、毛霉菌属（100%）、曲霉菌属（96.5%）准确率很高,对犬小孢子菌（75%）、镰刀菌属（50%）、新月弯孢霉（46.2%）准确率较低,对丝状真菌鉴定的总体准确率为86.36%,与ITS测序分析符合率为83.97%。     

三种前处理在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定假丝酵母菌属中的应用比较

目的比较3种前处理方法在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF-MS)鉴定假丝酵母菌属中的结果可靠性。方法以ITS测序鉴定结果为金标准,对临床分离的66株假丝酵母分别采用传统直涂法、改良直涂法和甲酸-乙腈蛋白提取法进行前处理,MALDI TOF-MS鉴定,比较3种方法的Biotyper Log值,分析质谱图的差异。结果传统直涂法、改良直涂法和甲酸-乙腈提取法对66株假丝酵母的属水平鉴定率分别为48.5%、50.0%和97.0%,Biotyper Log均值分别为1.628、1.674和2.010,其中甲酸-乙腈提取法对66株假丝酵母的种水平鉴定率为53.0%。甲酸-乙腈提取法得到的质谱图比另2种方法的质谱图离子峰更加密集,图像更复杂,鉴定结果可信度更高。结论甲酸-乙腈蛋白提取法对假丝酵母菌属的鉴定成功率和可靠性明显高于传统直涂法和改良直涂法,对临床假丝酵母菌病的准确诊断具有重要价值。     

MALDI-TOF MS对肺炎链球菌鉴定与分型的应用

目的探讨MALDI-TOF MS对肺炎链球菌鉴定和质谱分型的应用价值。方法收集2009年1月至2013年5月温州医科大学附属第二医院临床分离的112株肺炎链球菌标本,采用Optochin敏感试验和全自动细菌分析仪对收集的菌株进行鉴定验证,并用Microflex MALDI-TOF质谱仪进行分析鉴定。根据质谱图的相似性进行细菌同源聚类树分析并构建质谱分型模型,采用荚膜肿胀试验对参与分型的菌株进行血清型比较。结果除20株不符合检测条件之外,92株临床菌株和1株标准株经质谱分析均为肺炎链球菌,选取的60株菌株以0.5的差异水平,将60株肺炎链球菌分为18个质谱型别,在这些菌株的血清分型中有19F、19A、23F、23A、3和14六个血清型别,分布于不同的MALDI-TOF MS分型中,其中19F有18株,占30%(18/60),分布在6种不同的MALDI-TOF MS分型中,也有3型血清型较为集中地分布于相应的MALDI-TOF MS一个型别里。结论 MALDI-TOF MS能快速、准确、简便地鉴定肺炎链球菌,且能达到种的水平。对比血清型,按照0.5差异水平,建立的18个质谱分型部分的型别与血清型有一致性,但也存有差异。     

MALDI-TOF MS与16S rDNA方法对 弧菌科微生物的鉴定与系统分类学分析

目的比较基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)与16S rDNA方法对弧菌科微生物的鉴定及系统分类学分析能力。方法对19株弧菌科微生物,采用MALDI-TOF MS进行蛋白质图谱采集,通过对特征峰的分析,实现对微生物的鉴定和系统分类学分析;同时对19株微生物进行16S rDNA测序,用邻接法对16S rDNA序列进行鉴定和系统分类学分析,比较两种方法在弧菌科微生物鉴定和系统分类学分析中的异同。结果两种方法对19株弧菌科微生物的种属鉴定结果一致。系统分类学分析中,多株同种属的弧菌的两种方法分析结果一致,但对拟态弧菌和霍乱弧菌在树状图中的位置和亲缘关系,两种方法差异较大。结论 MALDI-TOF MS与16S rDNA均能够快速准确地鉴定弧菌科微生物,但利用MALDI-TOF MS进行系统分类学分析还有待数据库的扩大及算法的优化。     

真菌通用引物Its1和Its4在丝状真菌鉴定中的价值评价

目的 对真菌通用引物Its1和Its4在丝状真菌鉴定中的价值进行评价.方法 收集中山大学附属第一医院2012年1月至2012年8月间分离的丝状真菌11株,使用真菌通用引物Its1和Its4采用PCR法扩增核糖体基因,对PCR产物进行序列测定,将测序结果与GenBank中已知标准或临床菌株DNA序列比对,确定丝状真菌的菌种;同时与传统形态学鉴定方法进行比较,从而对真菌通用引物Its1和Its4在丝状真菌鉴定中的价值进行评价.结果 从DNA提取到序列测定结束,在2个工作日内即可完成.所有菌株均测序成功,测序结果与GenBank中的序列比对,烟曲霉、杂色曲霉、橘青霉、溜曲霉可以鉴定到种;黄曲霉和米曲霉、阿姆斯特丹散囊菌和冠突散囊菌由于高度同源性无法区分鉴定到种.结论 利用真菌通用引物Its1和Its4结合PCR技术和测序技术,可快速、准确将大部分丝状真菌鉴定到种.     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术作为常见益生菌菌种鉴定辅助工具的研究

目的评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术用于常见益生菌菌株鉴定及潜在益生菌菌株筛选的可行性。方法利用16S rDNA序列分析在方法学上对MALDI-TOF MS技术的鉴定能力进行研究;通过MALDI-TOF MS技术对现有保藏菌株的鉴定结果研究MALDI-TOF MS技术的鉴定准确性及优越性。结果 MALDI-TOF MS技术具备较16S rDNA序列分析更高的菌株鉴定能力;MALDI-TOF MS技术的鉴定结果准确、稳定。结论 MALDI-TOF MS技术可以作为准确、快速、廉价及可高通量操作的菌株鉴定方法应用于常见益生菌菌株的鉴定及潜在益生菌菌株的筛选。     

一株与血红铆钉菇相关的青霉属菌株的分离与鉴定

目的:鉴定一株从采自北京市房山区的野生血红铆钉菇中分离得到的丝状真菌,分析其遗传地位,为进一步研究该菌株与血红铆钉菇的关系奠定基础。方法:以血红铆钉菇为材料,进行了组织分离,获得1株丝状真菌菌株,编号为JZB2120006,对其进行了形态学鉴定,并提取了基因组DNA,进行了ITS片段的扩增、测序及系统发育分析。结果:分子生物学鉴定结果表明,该菌株与Penicillium sclerotiorum ZZ07-5菌株有99.3%的同源性。结论:结合形态学特征将该菌株鉴定为P.sclerotiorum,ITS基因序列GenBank登录号为KC594044。     

MADLI-TOF MS自建库在马尔尼菲篮状菌快速鉴定中的应用

目的评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MADLI-TOF MS)自建库对临床分离马尔尼菲篮状菌快速鉴定的能力。方法收集广州、玉林、防城港3个地区临床分离的马尔尼菲篮状菌,通过ITS区扩增测序进行菌种准确鉴定。菌株通过微型玻璃珠研磨结合甲酸/乙腈提取法预处理。通过采集建库菌株不同时间点、不同平板上菌丝相和酵母相菌落的质谱数据,建立包含马尔尼菲篮状菌超级图谱的自建库;并用非建库的马尔尼菲篮状菌及临床常见的真菌评估建立的自建库。结果建立了包含具有39个特征峰的马尔尼菲篮状菌超级图谱的自建库;用于评估的菌株均被鉴定到种,准确率为100%。结论 MADLI-TOF MS建立的马尔尼菲篮状菌自建库能够对于临床马尔尼菲篮状菌进行快速、准确的鉴定。     

39株指/趾甲分离黄曲霉复合体(Aspergillus section Flavi)菌种鉴定和抗真菌药物敏感性

目的对来自伊朗马什哈德地区(Mashhad, Iran)甲真菌病患者指/趾甲分离的39株黄曲霉复合体(Aspergillus section Flavi)菌株进行菌种鉴定及抗真菌药物敏感性研究。方法菌种鉴定采用β-tubulin/calmodulin基因测序的分子鉴定联合MALDI-TOF质谱鉴定;体外药物敏感性试验参照CLSI M38-A3方案检测包括特比萘芬、新三唑类药物、棘白菌素类等10种抗真菌药物。结果基于形态学鉴定的39株黄曲霉复合体(Aspergillus section Flavi)菌株中,分子鉴定结果表明38株为Aspergillus flavus(A.flavus)/Aspergillus oryzae(A.oryzae),1株为Aspergillus minisclerotigenes(A.minisclerotigenes)。对38株分子鉴定为A.flavus/A.oryzae菌株采用MALDI-TOF质谱鉴定结果为A.flavus,而MALDI-TOF质谱错误鉴定同形菌种A.minisclerotigenes为A.flavus。抗真菌药物敏感性结果表明,特比萘芬、泊沙康唑和棘白菌素类药物对黄曲霉复合体(Aspergillus section Flavi)菌种均具有抗真菌活性。结论分子鉴定联合MALDI-TOF质谱鉴定可准确鉴定黄曲霉复合体菌株到菌种水平,特别是分子鉴定不能区分A.flavus/A.oryzae,而MALDI-TOF鉴定可将二者区分。完善参考菌种数据库是MALDI-TOF质谱准确鉴定的关键。特比萘芬、泊沙康唑和棘白菌素类药物可作为治疗黄曲霉复合体(Aspergillus section Flavi)菌种所致甲真菌病的潜在有效药物。     

一种联合MALDI-TOF MS直接鉴定阳性血培养瓶方法改进及与Sepsityper Kit试剂盒法、SELTERS法和血清分离胶法的比较

目的评价直接使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)联合Sepsityper Kit试剂盒法(简称试剂盒法)、SELTERS法和血清分离胶法(简称分离胶法)鉴定阳性血培养瓶血中细菌的符合率,并对SELTERS方法进行改进,以缩短样本处理时间。方法对656例临床血培养阳性标本,应用试剂盒法、SELTERS方法或分离胶法处理后,直接使用质谱仪快速鉴定菌株,同时进行传统培养,比较分析二者之间的差异。结果656例血培养阳性标本共分离出626株单种菌感染和30株多种菌感染标本。MALDI-TOF MS联合试剂盒法、SELTERS法或分离胶法可在1 h内快速鉴定血培养阳性标本。在单种细菌感染中,MALDI-TOF MS联合试剂盒法直接鉴定革兰阳性菌的种、属符合率分别是66.8%(141/211)、21.3%(45/211),革兰阴性菌的种、属符合率分别是97.1%(367/378)、0.8%(3/378),真菌的种、属符合率分别是32.4%(12/37)、0.0%(0/37);MALDI-TOF MS联合SELTERS法直接鉴定革兰阳性菌的种、属符合率分别是66.8%(141/211)、21.3%(45/211),革兰阴性菌的种、属符合率分别是96.3%(364/378)、2.4%(9/378),真菌的种、属符合率分别是32.4%(12/37)、2.7%(1/37);MALDI-TOF MS联合分离胶法直接鉴定革兰阳性菌的种、属符合率分别是51.2%(108/211)、20.9%(44/211),革兰阴性菌的种、属符合率分别是93.4%(353/378)、1.6%(6/378),真菌的种、属符合率分别是13.5%(5/37)、2.7%(1/37);MALDI-TOF MS联合改良SELTERS法直接鉴定革兰阳性菌的种、属符合率分别是59.1%(13/22)、18.2%(4/22),革兰阴性菌的种、属符合率分别是88.5%(23/26)、3.8%(1/26),真菌的种、属符合率分别是0.0%(0/2)、50.0%(1/2)。而对于多种菌感染的血培养瓶,3种方法鉴定率均较低。结论MALDI-TOF MS联合试剂盒法、SELTERS法或分离胶直接鉴定阳性血标本中的病原菌,其结果可在1 h内获得,并与传统培养结果相比具有较高的符合率。但是这些方法检测更快速、操作更简便,同时改良SELTERS法样本处理时间缩短,成本降低,且符合率与前3种方法没有区别。这4种方法均能满足临床快速诊断和及时有效抗菌治疗的需求,临床可根据自身情况选择。     

FTA-DNA直接提取法在病原真菌分子鉴定中的应用

目的建立并评价FTA-DNA直接提取法在病原真菌分子鉴定中的应用。方法采用whatman FTA-DNA直接提取法从25个不同种属的45株培养的菌株和6例临床标本中提取病原真菌DNA,用于病原真菌的测序鉴定。配制不同浓度的孢子悬液探索该方法的检测限和安全性。结果 45株菌株扩增后均能得到1条清晰的DNA扩增片段,并成功测序。应用该方法亦成功从腹水、胸水、口腔拭子、宫颈拭子来源的临床标本中直接提取DNA并成功鉴定病原真菌。该DNA提取方法联合降落PCR能检测到1.0×103个cell/mL的孢子悬液,1.0×104个cell/mL及以下浓度的孢子悬液可以被FTA卡完全灭活。结论 FTA-DNA直接提取法可快速有效地从培养的菌株及部分临床标本中提取并保存病原真菌DNA,用于病原真菌的测序鉴定。     

数据处理和分析方法在 MALDI-TOF MS鉴定微生物中的应用

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)因其具有快速、准确、高通量等特点在食品微生物检测和临床微生物鉴定领域有广泛的应用。对MALDI-TOF MS数据的预处理和分析是微生物鉴定的关键步骤,通过对数据的处理可以从大量的数据中提取微生物的特征肽或者蛋白信息,并通过有监督和无监督学习方法对这些特征信息进行分类和聚类,从而实现对微生物的鉴定、分型和同源性分析。本文就MALDI-TOF MS鉴定微生物中所应用的数理统计分析方法和数据分析软件进行综述。     

利用基因组学和MALDI-TOF MS技术鉴定放线菌纲细菌的核糖体蛋白质标志物

【目的】基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)法基于微生物的特征蛋白指纹图谱鉴定菌种,本研究利用基因组学和MALDI-TOFMS技术鉴定放线菌纲细菌的核糖体蛋白质标志物。【方法】从MALDI-TOF MS图谱数据库选取放线菌纲代表菌种,在基因组数据库检索目标菌种,获取目标菌株或其参比菌株的核糖体蛋白质序列,计算获得分子质量理论值,用于注释目标菌株MALDI-TOFMS指纹图谱中的核糖体蛋白质信号。【结果】从8目,24科,53属,114种,142株放线菌的MALDI-TOFMS图谱中总共注释出31种核糖体蛋白质。各菌株的指纹图谱中核糖体蛋白质信号数量差异显著。各种核糖体蛋白质信号的注释次数差异显著。总共15种核糖体蛋白质在超过半数图谱中得到注释,注释次数最高的是核糖体大亚基蛋白质L36。【结论】本研究找到了放线菌纲细菌MALDI-TOF MS图谱中常见的15种核糖体蛋白质信号,可为通过识别核糖体蛋白质的质谱特征峰鉴定放线菌的方法建立提供依据。     

哈特草螺菌食源性感染致脓毒症1例

为探讨实验室常规鉴定手段对哈特草螺菌临床分离株的鉴定能力,分析案例患者血液中哈特草螺菌的感染来源,本文使用自动生化鉴定系统、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometer, MALDI-TOF MS)、16S rRNA基因测序和RNA聚合酶的β亚基(rpoB)基因测序对哈特草螺菌进行鉴定,并对患者多部位标本进行哈特草螺菌检测。结果显示,自动生化鉴定系统将哈特草螺菌错误识别为洋葱伯克霍尔德菌,MALDI-TOF MS和16S rRNA基因测序无法鉴别哈特草螺菌、aquaticum草螺菌或camelliae草螺菌,rpoB基因测序可以准确将其鉴定为哈特草螺菌;除血液外,仅在患者粪便中检出少量哈特草螺菌,血液和粪便来源的哈特草螺菌肠杆菌基因间重复共有序列聚合酶链反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction, ERIC-PCR)结果显示,两者的DNA...     

对中国黄牛毛囊DNA六种提取方法的研究

本研究的目的是寻求一种简便、高效和对黄牛没有创伤的DNA提取方法,从而为黄牛基因组DNA的制备提供最优可行方案。本研究以中国黄牛毛囊作为DNA的提取材料,设计了离心柱法、磁珠法、SDS法、CTAB法、碱裂解法和煮沸法等6种DNA提取方法,然后分别对提取的DNA样本进行了分光光度计鉴定、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳。发现在这6种方法中,耗时最短且成本最低的是煮沸法;DNA纯度、浓度和完整度最理想的是CTAB法;而磁珠法可实现大规模高通量提取,能减少实验者的手动工作量,并且适用于基因测序各种常规操作。以此得出,适用于基因测序的6种黄牛毛囊DNA提取方法中最优的是磁珠法。本研究对中国黄牛毛囊DNA的6种提取方法进行了总结和分析,为今后提取毛囊DNA的研究提供了借鉴和参考。     

飞行质谱鉴定临床分离真菌准确度的Meta分析

目的基于循证医学系统性评价飞行质谱鉴定临床分离真菌的准确度,并与常规方法准确度进行比较。方法检索主要英文数据库PubMed、Cochrane、Web of Science,以及中文数据库CBM、万方、维普、知网数据库,检索飞行质谱鉴定临床分离真菌的原始文献。结果经筛选后纳入19篇文献(6609株真菌),Meta分析结果显示飞行质谱鉴定真菌至种水平正确率为0.9368(95%CI=0.9091～0.9598),常规方法鉴定真菌至种水平正确率为0.9104(95%CI=0.8874～0.9340);对结果进行了亚组分析,主要包括:菌株类型、研究类型、样本处理方法、金标准检测范围、鉴定阈值等;敏感性分析表明结果稳定可靠,Begg和Egger’s结果表明飞行质谱鉴定真菌不存在发表偏倚,常规方法鉴定真菌存在一定发表偏倚。结论基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱系统(MALDI-TOF MS)方法对鉴定临床致病性真菌准确率较高,是临床常规方法的可靠替代方法。     

我国首例Paraconiothyrium cyclothyrioides感染致眼内炎的相关研究

目的报道我国首例由Paraconiothyrium cyclothyrioides引起的真菌性眼内炎,并分析其生物学特征、感染途径及治疗方法。方法通过形态学鉴定、生长温度试验、ITS测序等方法对我院1株眼外伤患者左眼前房沉积物中培养分离到的丝状真菌进行鉴定。结果该丝状真菌在PDA平板上在25℃生长快速,可见灰橄榄色周边有白色绒毛状菌落,表面皱褶,35℃生长缓慢,可见黄豆大小白色凸起菌落;25℃及35℃培养后镜下可见大量结节状菌丝,未见分生孢子,属于不产孢株;ITS测序结果为Paraconiothyrium cyclothyrioides。结论本病例是国内首次报导的由Paraconiothyrium cyclothyrioides引起的真菌性眼内炎。