水杨酸诱导山葡萄Class Ⅲ几丁质酶基因VCH3启动子在转基因烟草维管组织中的表达

从山葡萄(Vitis amurensis Rubr.)叶片中分离到长度为1 216 bp的山葡萄ClassⅢ几丁质酶基因VCH3的5′端非编码区(GenBank number AF441123),并发现有两个反向水杨酸(SA)顺式作用元件(TGACG)分别位于转录起始位点上游-1 181 bp和-293 bp处.为了鉴定VCH3启动子的功能,我们将该启动子的4个缺失片段(-1 187 bp～ 7bp,-892 bp～ 7 bp,-589 bp～ 7 bp及-276 bp～ 7 bp)分别连接到β-葡糖苷酸酶基因(GUS)编码区的上游,构建成4个融合基因,并利用农杆菌介导叶盘转化法将这4个融合基因转入烟草(Nicotiana tobacum L.)栽培品种NC89中.SA处理的转基因烟草根系GUS酶活性的荧光检测结果表明:只含有TATA盒和CAAT盒而缺失了所有SA顺式作用元件的VCH3(-276)GUS表达盒对SA处理表现出较低程度的诱导性;只包含一个SA顺式作用元件的VCH3(-589) GUS或VCH3(-892)GUS表达盒表现出相似的较高水平的GUS酶活性;而包含两个SA顺式作用元件的全长启动子片段(-1 187 bp～ 7 bp)驱动了最强的GUS酶活性,这说明VCH3启动子诱导的GUS酶活性的最大量表达需要两个SA顺式作用元件的协同作用.GUS酶的组织化学分析结果表明,在SA处理的转基因烟草根横切面中,VCH3启动子4个缺失片段驱动的GUS酶活性在维管组织中的表达活性均强于在外皮层和内皮层的表达活性,因此SA诱导的VCH3启动子维管组织特异性表达元件可能位于-276 bp～ 7 bp之间.以上结果显示,该启动子将在基因工程中具有较大的应用潜力.     

水杨酸诱导山葡萄Class Ⅲ几丁质酶基因VCH3启动子在转基因烟草维管组织中的表达(英文)

从山葡萄(Vitis amurensis Rubr.)叶片中分离到长度为1216 bp的山葡萄Class Ⅲ几丁质酶基因VCH3的5’端非编码区(GenBank number AF441123),并发现有两个反向水杨酸(SA)顺式作用元件(TGACG)分别位于转录起始位点上游-1 181 bp和-293 bp处。为了鉴定VCH3启动子的功能,我们将该启动子的4个缺失片段(-1187 bp～ 7bp,-892 bp～ 7 bp,-589 bp～ 7 bp及-276 bp～ 7 bp)分别连接到β-葡糖苷酸酶基因(GUS)编码区的上游,构建成4个融合基因,并利用农杆菌介导叶盘转化法将这4个融合基因转入烟草(Nicotiana tobacum L.)栽培品种NC89中。SA处理的转基因烟草根系GUS酶活性的荧光检测结果表明:只含有TATA盒和CAAT盒而缺失了所有SA顺式作用元件的VCH3(-276)GUS表达盒对SA处理表现出较低程度的诱导性;只包含一个SA顺式作用元件的VCH3(-589)GUS或VCH3(-892)GUS表达盒表现出相似的较高水平的GUS酶活性;而包含两个SA顺式作用元件的全长启动子片段(-1187bp～ 7bp)驱动了最强的GUS酶活性,这说明VCH3启动子诱导的GUS酶活性的最大量表达需要两个SA顺式作用元件的协同作用。GUS酶的组织化学分析结果表明,在SA处理的转基因烟草根横切面中,VCH3启动子4个缺失片段驱动的GUS酶活性在维管组织中的表达活性均强于在外皮层和内皮层的表达     

水稻OsNRT1-d启动子的分离和功能分析

采用PCR技术,从水稻基因组中分离到OsNRT1-d读码框上游2 019 bp序列.序列分析表明:在起始密码ATG上游-189 bp和-127 bp处分别存在CAAT-box和TATA-box,具有典型的启动子结构.推测的转录起始位点CAC位于起始密码ATG上游-93 bp处.将OsNRT1-d启动子5′-端系列缺失后,分别与GUS报告基因融合,获得的NRT2019∷GUS、NRT1196∷GUS 和NRT719∷GUS转基因载体.农杆菌介导转化水稻,获得的转基因水稻均能启动下游GUS报告基因在水稻的根、叶、花颖和种子中表达;将转基因水稻幼苗放在滤纸上紧急干旱处理和用15% PEG6000进行模拟干旱处理,GUS基因的表达量明显升高,且干旱应答元件在-719 bp～-1 bp的范围内;GUS活性分析表明:OsNRT1-d启动子对ABA、NaCl、(NH4)2SO4、KNO3和Gln等信号没有应答反应.     

木薯可溶性淀粉合成酶(MeSSⅡb)启动子克隆及梯度缺失分析

木薯淀粉被广泛用作各种食品、饲料及工业淀粉制品的原材料。然而目前,国内外还未见木薯可溶性淀粉合成酶基因Me SSs的启动子相关研究报道。本研究通过在木薯基因组数据库中查询Me SSⅡb基因第一个外显子及其上游序列,通过PCR扩增获得Me SSⅡb上游序列。对获得的上游序列通过Plant CARE及PLACE进行启动子结构及元件分析,并与其它物种中SSSs基因启动子区序列利用BLAST进行比对分析后,确立翻译起始位点上游1 566 bp序列为启动子区,进而设计并构建了包括完整启动子在内的5'端梯度缺失启动子融合GUS蛋白植物表达载体p E1566::GUS、p E1356::GUS、p E1116::GUS、p E531::GUS、p E453::GUS、p E387::GUS、p E138::GUS转化本氏烟草进行启动子活性验证。利用叶盘侵染法转化本氏烟草进行启动子梯度缺失分析后发现,缺失启动子p E1356、p E1116、p E531活性丧失,缺失至翻译起始位点上游138 bp的缺失启动子p E138,仍具有启动子活性。上述表明,在克隆启动子区1 566 bp片段中,在-1 566 bp和-1 356 bp之间210 bp序列片段对于完整启动子活性尤为重要,而-1 356 bp至-531 bp之间存在启动抑制因子,在-453 bp和-138 bp为基础启动序列,初步推断为转录起始结合位点。     

一种改良的克隆小麦GLP3基因启动子的TAIL-PCR技术

以小麦基因组DNA为模板,用一种改良热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)技术克隆到全长为1748bp的小麦GLP3基因的上游侧翼序列。测序结果表明,TATA-box位于基因转录起始位点CAT-box上游-27bp处;CAAT-box位于CAT-box上游-163bp处;ATG位于CAT-box下游94bp处,5'UTR(非编码区)序列全长93bp,表明该序列为小麦GLP3启动子序列。     

香蕉果实特异性ACC合酶基因启动子区的克隆及其功能初探

根据本实验室所获得的香蕉果实特异性ACC合酶cDNA序列,以改进的接头连接PCR方法通过两次步行从香蕉基因组中分别扩增并克隆了其基因5′旁侧区近端1.2kb和远端1.6kb的片段。通过拼接,构建出含有2505bp启动子区和转录起始位点下游86bp的共2591bp的基因5′旁侧区片段;其启发性动子区中34至28为推测的TATA盒序列,158至146为推测的CCAAT盒,与其它植物基因启动子结构相类似。将2.5kb启动子片段与β-葡糖苷酸酶(GUS)基因编码序列融合,用基因枪法将构建的嵌合基因转入香蕉叶、根和果实的细胞后,只在果实细胞中观察到报告基因的瞬时表达,从功能上证明了此25kb的启动子片段具有指导报告基因在香蕉果实中特异性表达的作用。同时构建5个含不同5′端缺失启动子与GUS融合基因的表达载体。瞬时表达结果表明可能负责果实特异性表达的调控区存在于转录起始位点至-1111的启动子区中,而在-1111至-608区间可能存在一个正控制区。     

拟南芥AtMPK3启动子应答逆境信号的表达模式和必需区域分析

蛋白激酶AtMPK3参与MAPK级联途径, 在植物逆境信号转导中起重要作用. 为深入研究AtMPK3基因在转录水平上应答各种环境胁迫的分子机制, 本研究从拟南芥基因组中分离了AtMPK3基因转录起始位点上游1016 bp的启动子序列, 对其进行了生物信息学分析. 对该启动子进行了系列缺失突变, 并将完整启动子和缺失启动子片段与GUS报告基因融合, 转基因导入到拟南芥中. 携带AtMPK3启动子及其各种缺失突变体的转基因植株在干旱、高盐、低温、机械损伤等胁迫条件的GUS组织化学染色和荧光定量分析表明, AtMPK3启动子应答干旱、高盐、低温、机械损伤逆境信号的必需元件位于启动子序列中转录起始位点上游−188 ~ −62区域内, 揭示了AtMPK3启动子在不同环境胁迫条件下的表达模式的差异. 本研究结果有助于阐述AtMPK3基因在转录水平上应答不同胁迫信号分子机制.     

盐角草磷酸乙醇胺N-甲基转移酶基因（SePEAMT）启动子的克隆及瞬时表达

磷酸胆碱是合成磷脂酰胆碱和甘氨酸甜菜碱的重要前体,磷酸乙醇胺N-甲基转移酶（PEAMT）是磷酸胆碱合成的关键酶。根据已知的SePEAMT cDNA5'端序列设计两个基因特异的反向引物(PP1,PP2),通过锚定PCR获得了PEAMT起始密码子上游1249bp的序列。RLM-RACE反应确定其转录起始位点A位于起始密码子上游301bp处,由此获得了948bp的SePEAMT启动子序列。PlantCARE和PLACE在线启动子预测工具分析表明：该序列除了含有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box外,还含有一些胁迫诱导元件（如ABRE、HSE、LTR）和花粉特异的激活元件AGAAA。构建了SePEAMT启动子与报告基因GUS 融合的表达载体pPro,并通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,染色结果表明SePEAMT启动子可以有效地驱动GUS基因的瞬时表达。     

竹节花黄斑驳病毒启动子的缺失分析及功能

竹节花黄斑驳病毒(CoYMV)是侵染单子叶植物竹节花的一 种双链环状DNA病毒,它的启动子可介导外源基因在烟草韧皮部特异表达。为了研究其组织 特异性表达的最佳启动子区域,对CoYMV启动子进行了5′端五种不同长度的缺失分析,用不同长度的启动子片段与GUS基因及NOS3′端转录中止序列构建了全长启动子及5 个缺失启动子序列的六个嵌合GUS基因植物表达载体。利用农杆菌将上述嵌合基因转化烟草 外植体后,每种表达载体都获得了一批转基因烟草植株。转化再生烟草植株的PCR分析、GUS 酶活测定及GUS组织染色的结果表明六种类型的嵌合基因已整合到烟草染色体中,并有五种 表达出GUS活性。缺失到870bp的启动子比全长启动子(1040bp)的活性约高78%,870bp比585bp启动子介导的GUS活性略高但差别不明显,缺失到447和232时GUS活性有明显下 降,但仍具有韧皮部特异表达的特性。当缺失到TATA box附近的44bp时启动子丧失组织特 异性,GUS活性也降低到测不出来的水平。以上结果表明CoYMV启动子从转录起始位点上游 870bp～230bp及232bp下游区分别与启动子的活性和韧皮部组织特异性密切相关,870bp上游可能存在一个负调控序列,所以该启动子的活性和组织特异性的最佳调控区应在87 0bp或585bp的下游区。CoYMV启动子与35S启动子驱动GUS基因在烟草中表达的活性相比, 前者为后者的70%左右,考虑到前者仅在韧皮部细胞表达而后者为组成型表达,所以CoYMV启 动子在韧皮部的活性可能与35S启动子相当或更高。CoYMV启动子在其它转基因植物中驱动外 源基因表达的特点正在研究中。     

水稻几丁质酶基因RCH8创伤诱导转录及启动子功能分析

高等植物几丁质酶基因受病害侵染、真菌激发子、乙烯、机械创伤等因素诱导转录。我们已经测定过水稻(Oryza sativa L.cv.IR 36)Ⅰ类几丁质酶基因RCH 8的DNA序列。为了研究水稻中与防卫反应有关的几丁质酶基因启动子的活性、功能和表达调控,我们以RCH 8几丁质酶基因保守的编码区序列为探针,分别在创伤处理2—24h后提取水稻(Oryza sativa L.cv.IR 36)叶片的总RNA作Northern杂交,发现创伤处理6h可以检测到几丁质酶基因的表达,12h表达水平最高。合成了一个与RCH8翻译起始密码附近反义链DNA序列互补的21-mer的寡核苷酸引物(5'-GCTCTCA-TGGTGGCAATGCAA-3')作引物延伸实验,表明RCH8基因的转录受创伤诱导,RCH8转录起始位点位于翻译起始位点上游第42碱基A。在pUC 19载体质粒中构建了一组5'端不同程度缺失的RCH8基因启动子与GUS报告基因翻译融合的重组质粒,用PEG法转入烟草原生质体中,通过测定GUS酶活性发现RCH8启动子-1016-676之间的DNA序列缺失后表达活力显著下降,缺失到-68碱基处的启动子仅有很低的活力。