辅助噬菌体在噬菌体展示中的应用及研究进展

噬菌体展示技术是一种将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白相融合,展示于噬菌体表面来构建蛋白质或多肽文库,并从中筛选目的蛋白、多肽或抗体的基因工程高新技术。噬菌粒/辅助噬菌体系统是最常用的噬菌体展示系统,此系统中辅助噬菌体对噬菌粒的复制和组装发挥着至关重要的作用。本文结合当今该领域的最新研究动态,概述了噬菌粒和辅助噬菌体双基因组系统,着重介绍了不同辅助噬菌体的特点及其突变机制,并对其应用前景进行了展望,以期为该技术的进一步完善提供一定的借鉴作用。     

丝状噬菌体与噬菌体展示技术

丝状噬菌体的利用,在分子生物学研究以及基因工程发展中起了重大作用[1]。丝状噬菌体作为载体具有多方面的巨大应用潜力。1985年Smith[2]到最先将外源基因插入丝状噬菌体fl的基因Ⅲ,使目的基因编码的多肽能以融合蛋白的形式展水在噬菌体表面,从而创建了噬菌体展示技术。噬菌     

大分子量重组蛋白在丝状噬菌体表面的展示表达及其与小分子相互作用的初步研究

利用pHEN1KM13噬菌粒系统表达融合蛋白,进而确定大分子量重组蛋白在丝状噬菌体表达的部位及其表达后的生物活性。通过蛋白酶切处理前后噬菌体侵染细菌能力的变化快速地检测大分子蛋白质能否在噬菌体表面展示表达;比较了谷胱甘肽S转移酶及其与三个不同长度连接臂融合的外源蛋白在噬菌体表面的表达和组装,确定了不大于40kD的重组蛋白分子能展示表达在丝状噬菌体表面;并利用已知的小分子化合物与蛋白质的相互作用证明了组装在噬菌体表面的谷胱甘肽S转移酶重组蛋白仍保持其天然的结合活性,为利用噬菌体展示系统研究蛋白质与小分子化合物的相互作用建立了基础。     

噬菌体肽库技术

80年代中期,George P.Smith在前人对丝状噬菌体分子生物学研究的基础上首先提出了噬菌体展示技术(Phage Display),其核心就是将蛋白质分子的表型和基因型巧妙地结合于丝状噬菌体这样一个便于对其进行一系列生化和遗传操作的载体上,从而大大简化了蛋白质分子表达库的筛选和鉴定。基于这一优点,噬菌     

噬菌体展示定位和噬菌体展示工程

噬菌体展示是指将外源基因克隆到丝状噬菌体ｆｄ染色体ＤＮＡ上,然后以融合白 形式展示了于噬菌体衣壳蛋白表面的技术。本文将概述丝状噬菌体展示技术的最新进展,特别是表位定位的原理及其应用,可包括以下三部分：１．比较几种不同噬菌体展示策略的技术原理;２．展示表位的重组噬菌体在诊断试剂上的开发价值;３．展示表位的重组噬菌体在疫备研究上的应用前景。     

新型噬菌体表面呈现载体的构建

作为抗体库筛选的一个有效方法,噬菌体表面呈现技术在单链抗体的研制和中得到广泛的应用。以噬菌粒pCANTAB5E和pHB为基础。利用PCR和DNA重组方法,构建了一个新型的用于单链抗体噬菌体表面呈现的噬菌粒载体,随后用一株对大肠杆菌细胞有毒性的人源化单链抗体（1HSCFV）对其呈现单链抗体的效果进行了初步的评价。结果表明新型噬菌粒系统具有更好的呈现能力。     

水蛭素在噬菌体表面的展示

水蛭素是凝血酶强有力的天然抑制剂。通过改造噬菌质粒并构建水蛭素表达载体pCANTAB 5G8Hir,使水蛭素基因通过接头与噬菌体M13的gp3(197～406)基因片段融合。表达产物在gp8信号肽的引导下到达大肠杆菌周质,在辅助噬菌体M13KO7的帮助下组装到丝状噬菌体外壳上。展示在噬菌体表面的水蛭素仍然具有与凝血酶结合并抑制酶活性的作用,说明展示的水蛭素保持了正确的空间构象和生物学活性。水蛭素在噬菌体表面的功成展示为进一步开展其实验定向进化以及结构与功能关系的研究打下基础。     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ及其CBD的噬菌体表面展示系统的构建

为研究纤维素酶的酶活性和吸附特性之间的关系,将瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ(endoglucanaseⅠ,EGⅠ)和其吸附结构域(cellulose-binding domains,CBD)的基因经PCR扩增后,连接到载体pCANTAB5E上,构建成噬菌粒展示载体pCANTAB5E-egⅠ和pCANTAB5E-egⅠ-cbd。将这些噬菌体展示载体转化到大肠杆菌TGⅠ中,在辅助噬菌体M13KO7的帮助下得到重组噬菌体。用ELISA和Somogyi方法分别测定了EGⅠ及其CBD的表面展示噬菌体对纤维素的亲和性和EGⅠ的CMC活性,结果显示EGⅠ及其CBD已功能展示于噬菌体表面。该系统的成功构建为今后利用噬菌体展示的方法进行纤维素酶的酶分子改造提供了基础。     

噬菌体表面展示技术

噬菌体表面展示技术是将编码外源肽或抗体的可变区ＤＮＡ 片段插入噬菌体或噬菌粒的基因组中,以融合形式与噬菌体的表面蛋白共同表达于噬菌体表面,经过“吸附———洗脱———扩增”过程筛选并富集外源肽或 特异性抗体。其中噬菌体抗体库技术可以模拟体内抗体产生和成熟过程,不经细胞杂交,甚至不经免疫制备针对任何抗原的单克隆抗体     

噬菌体表面表达抗汉坦病毒衣壳蛋白单链抗体的研究

噬菌体展示表达(Phage display expression)的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一 在同一噬菌体颗粒内,其基因组中含有表达蛋白基因,在噬菌体表面进行特定的表达.该技 术为研制工程抗体提供一新的途径,在九十年代逐渐被人们认识并得到极其广泛的应用 [1,2].噬菌体表面表达技术适于表达Fv和Fab分子片段,当表达的抗体基因与噬菌 体外壳蛋白基因Ⅲ融合时,在噬菌体颗粒表面呈现单价表达,与噬菌体外壳蛋白基因Ⅷ融合时,呈现多价表达.     

选择感染性噬菌体（SIP）技术：一种新的相互作用分子筛选技术

选择感染性噬菌体（SIP）技术是利用丝状噬菌体次要衣壳蛋白PⅢ的分子结构组件,并以噬菌体展示技术为基础发展而来.SIP的技术关键在于使没有感染性的噬菌体颗粒必须严格依赖分子间的相互作用、结合而重获感染性,已有的研究表明SIP技术可望成为一项获得相互作用分子对的极其有效和高度特异性的新技术,具有广阔的应用前景.     

应用抗病毒抗体表位筛选的多肽文库的构建

1985年,Sndth在《科学》杂志上提出构建"融合噬菌体",即在这种丝状病毒的包膜蛋白上表达融合蛋白[1]．1990年,Scott和Smith山利用这种表面表达载体建立了随机多肽文库,可以很方便地筛选出抗体及其他功能蛋白的强结合配基[2]．我们建立了十二肽的随机多肽库,将从中筛选出抗HIV-gP160抗体的抗独特型多肽．1材料和方法1．1质粒、菌株和培养墓噬菌粒成h血四、大肠杆菌XLI-Blue和辅助噬菌体VCSM13由军事医学科学院微生物流行病研究所王海涛教授惠赠．SB液体培养基：30gtmptone,20g酵母膏,10gMops溶于IL去离子水中,调pH7．0．枝…     

细菌病毒--噬菌体的应用概况

噬菌体是细菌病毒 ,它分裂细菌细胞可获取胞内物质 ,可改造做基因工程载体 ;噬菌体表面展示技术广泛应用于疾病诊断、特异性抗体及蛋白药物生产等。噬菌体双报告基因的插入在研究蛋白质功能方面显示了广阔的应用前景     

affinity与avidity

在专业文献中,常见到“affinity”及“avidity”这样两个表示“亲和”意思的词汇。如Ashkenazi在他的文章Immunoadhesins中这样写到:“可溶性受体在临床上的应用是有效的,而它与IgG融合后则有更多优点,如延长半衰期、提高avidity及affinity”,这里affinity与avidity的意思显然是有所区别的。国内有人这样写道:“丝状噬菌体载体(单链丝状噬菌体和噬菌粒)包括基因Ⅲ的单价系统和基因Ⅷ的多价系统。前者可筛选高亲和力(affinity)抗体,后者可筛选高亲和力(avidity)抗体”,显然这两个“高亲和力”要表达的意思应该也是不同的,但即使附有英文,该句意思还是颇费理解的。那么,到底affinity与avidity的真正区别在哪里呢?     

T4噬菌体表面展示技术的研究进展

噬菌体表面展示技术(phage display)是由Smith于1985年首先建立起来的一种新的生物技术[1],它能将表达的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面,保持相对独立的空间构象和原有的生物活性[2].常用的噬菌体表面展示系统主要有丝状噬菌体、λ噬菌体及T4噬菌体展示系统等.虽然它们都具有噬菌体展示系统的优点,但对于丝状噬菌体来说,它不能展示那些难以分泌的肽和蛋白质,而且它的N端可融合外源多肽的容量有限,较大蛋白的融合会造成空间障碍,影响噬菌体的装配,使其失去感染力.而对于λ噬菌体,大分子蛋白的融合会抑制噬菌体的组装,使其生长受到影响,因此这两种噬菌体更适用于构建短肽库和cDNA表达文库[3],而不适于构建重组疫苗和表达分子量大具有完整结构域的蛋白质[4,5].     

丝状噬菌体表面呈现技术

对丝状噬菌体的结构、基因组及生命周期的深入认识,是丝状噬菌体表面呈现技术建立和发展的基础,可将外源基因片段插入噬菌体的基因Ⅲ（ｇ３）或基因Ⅷ（ｇ８）的先导序列的紧下游,使外源基因表达的多肽以融合蛋白的形式呈现有噬菌体表面外壳蛋白ｇｐ３或ｇｐ８的Ｎ端,这样的呈现常能使表达的多肽保持生物活笥,据此可用活的噬菌体直接方便,高效率地筛选目的基因或检测该基因产物的活性,这技术已被用于抗体基因库,ＣＤＮＡ     

噬菌体展示技术的发展及应用

噬菌体展示技术是一种用于筛选和改造功能性多肽的生物技术 ,编码多肽的ＤＮＡ片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合后 ,以融合蛋白的形式在噬菌体的表面表达出多肽序列。这是一种表型与基因型的统一。噬菌体展示技术最初是以Ｍ 13噬菌体为载体的 ,其宿主菌为大肠杆菌。以大肠杆菌为宿主的展示系统还有其他 ,如λ噬菌体和Ｔ4噬菌体等展示系统。还有利用真核细胞的病毒以及酵母菌作为展示系统的。这些展示系统各有各的优势 ,但最常用的仍是Ｍ 13噬菌体表达系统。最初的噬菌体展示系统是将外源肽或蛋白质与噬菌体外壳蛋白ＰⅢ或ＰⅧ的Ｎ末端融…     

裂解型布鲁氏菌噬菌体的分子特征研究

目的:研究布鲁氏茵噬茵体Tb(Tbilisi)的形态学和分子生物学特征.方法:采用透射电镜观察噬茵体颗粒形态,双层琼脂法观察噬斑形态,梯度密度离心纯化噬茵体颗粒,提取噬茵体基因组,采用多种限制性内切酶(S1,DNase I,RNase A,BamHI)对基因组进行酶切琼脂糖凝胶电泳,SDS-PAGE观察噬茵体颗粒全蛋白片段.结果:Tb噬茵体电镜下显示头部直径为57±2nm,短尾(32±3mm长),分类学属于短尾噬茵体科.培养48小时后显示清晰噬斑,大小为2～3mm.核酸结构分析均表明Tb噬菌体基因组为线性dsDNA分子.基因组DNA经限制性内切酶BamHI酶切产生2条清晰条带,分子量在34.5kb左右.SDS-PAGE全蛋白电泳显示Tb噬菌体含有9条主要结构蛋白.结论:该研究证实了Tb噬菌体属于短尾病毒科噬菌体,对宿主菌存在裂解效应并产生2～3mm清晰透亮形态的噬斑,基因组为dsDNA分子,全蛋白包含9条主要的结构蛋白.该研究结果为布鲁氏菌噬菌体的分子水平的研究提供了新的研究基础.     

丝状噬菌体

丝状噬菌体的分子生物学研究和应用是近年来发展较为突出的一个领域,它们具有丝杆状的形态,在分类中归属于丝杆噬菌体科(Inoviridae),内有两属,即丝状噬菌体属(Inovirus)和杆状噬菌体属(Plectrovirus)。这里所谈的丝状噬菌体隶属于丝状噬菌体属,包括感染大肠杆菌和其它肠道细菌、假单胞菌、弧菌和黄单胞菌的噬菌体。至今,研究较清楚