水牛皮肤成纤维细胞的分离与体外培养

探讨水牛成纤维细胞的分离与传代培养方法。组织块培养法培养的成纤维细胞原代生长较慢,需12天左右方可汇合形成单层,而酶消化法培养的成纤维细胞原代生长相对生长快,仅需8天便可汇合形成单层。两种方法传代细胞的生长速度相似,仅需4-5天就可汇合形成单层。通过体细胞的核型分析发现,成纤维细胞在传代培养过程中的核型变化不大,66．67％～81．67％的细胞具有正常的二倍体核型,各代之间无显著差异。结果表明,水牛成纤维细胞均能稳定地进行传代培养。     

牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培养

分别用胶原酶Ⅲ和胰蛋白酶成功地分离了牛胎儿成纤维细胞,并对其进行了体外培养,同时探讨了两种酶消化分离牛胎儿组织的时间对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。用组织块直接培养也成功得到了牛胎儿成纤维细胞,并探讨了不同组织块大小对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。通过绘制生长曲线,可以研究牛胎儿成纤维细胞增殖规律;通过制备牛胎儿成纤维细胞的细胞染色体发现,经过传代(12代)、冷冻保存、解冻,牛胎儿成纤维细胞染色体数目不变。     

猪胎儿肾脏成纤维细胞体外培养体系的建立

本研究旨在建立猪胎儿肾脏成纤维细胞体外培养体系,并探讨其作为猪体细胞克隆供体的可能性。使用组织块培养法从体长为10cm以上的猪胎儿分离得到猪胎儿肾脏成纤维细胞,绘制了生长曲线,鉴定了细胞类型并且进行了细胞周期同期化效果的研究。结果表明:该培养体系可以支持猪胎儿肾脏成纤维细胞的体外生长,单个细胞均为梭形细胞,抗波形蛋白免疫荧光染色显示为阳性,而抗角形蛋白免疫荧光染色为阴性,分离到的细胞为胎儿肾脏成纤维细胞。使用血清饥饿法和接触抑制法诱导细胞进入G0/G1期,并且分别比较两者同期化效率,结果显示:血清饥饿2d和4d的同期化效率差异不显著,但都比8d组的高(88.97%和87.69%比82.45%,P<0.05);接触抑制4d、6d组间同期化效率差异不显著,但都比0d组的高(85.56%和85.89%比81.82%,P<0.05)。本研究在国内首次分离得到猪胎儿肾脏成纤维细胞,已经在体外传代培养到32代,其同期化效果好,可以作为体细胞克隆供体。     

牛耳成纤维细胞的培养

体细胞克隆是一种新型、高效且极具生产潜力的繁殖技术,在家畜改良和育种工作中前景广阔.在进行持续且大量的家畜克隆生产中,保证取材方便并不影响供体动物健康是十分关键的,只有这样才能使优势供体源本基因不会受到损害.     

牛成纤维细胞的分离与体外培养

研究了牛胎儿和成年牛皮肤组织成纤维细胞的分离、培养、纯化方法和生长特征。通过组织块贴壁培养和分离单细胞接种培养均能获得原代牛皮肤细胞。用2.5 g/L胰蛋白酶+1mmol/L EDTA和5 g/L胶原酶I联合消化牛皮肤组织较2.5 g/L胰蛋白酶+1 mmol/L EDTA消化,得到更多的单个细胞,两者之间差异极显著(P<0.01),但其死细胞比率却有较大升高;2.5 g/L胰蛋白酶+1 mmol/L EDTA消化牛胎儿组织得到的单细胞数显著高于皮肤组织消化后得到的细胞数(P<0.01),死细胞比率也高于同种酶消化的皮肤组织。分离纯化的胎儿和皮肤成纤维细胞的生长曲线都正常且相似。2.5 g/L胰蛋白酶+1 mmol/L EDTA消化贴壁细胞后死细胞率明显高于用0.5g/L胰蛋白酶+0.53 mmol/L EDTA消化的细胞(P<0.05);培养24 h后细胞贴壁率前者要明显低于后者(P<0.05)。用0.5 g/L胰蛋白酶轻度消化混杂生长的成纤维细胞和上皮样细胞,经过反复贴壁传代2～3代,可得到较纯的成纤维细胞。     

绵羊胎儿成纤维细胞体外培养及转基因研究

目的用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养绵羊胎儿成纤维细胞,探讨绿色荧光蛋白对绵羊胎儿成纤维细胞生物学特性的影响.方法体外分离培养绵羊胎儿成纤维细胞,经脂质体介导EGFP基因转染第一代成纤维细胞,G418筛选10～12*!d,挑选转基因单克隆细胞,传代培养,进行细胞形态观察、生长曲线以及染色体核型分析,并进行了培养细胞性别鉴定.结果整合有EGFP基因的绵羊胎儿成纤维细胞生物学行为与未转染外源基因的细胞无明显差别,根据荧光强度可直接反应外源基因的表达量.结论 EGFP基因作为体内报告基因可用于转基因细胞的研究,并将整合有EGFP基因的转基因细胞为克隆动物提供核供体奠定了基础.     

牛胎儿成纤维细胞的组织块贴附法分离培养与电穿孔法基因转染

为获得转基因克隆牛的供体细胞,采用组织块贴附培养的方法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞,经2～3次传代纯化,绘制生长曲线,分别分析体外传代培养10代以内和20代以上细胞的核型特征。分别采用800、900、1000V／cm和1、5、10、15和20ms的参数组合,将线性化的带有新霉素抗性和绿色荧光蛋白双重筛选标记的人胰岛素原乳腺特异表达载体pNEI电穿孔转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,经800μg／mLG418筛选2周,继续以300μg／mLG418扩大培养2～3代,取部分筛选后的细胞进行PCR检测结果表明,体外培养的牛胎儿成纤维细胞生长旺盛,体外传代20次后核型未发生改变;转染后24～48h在荧光镜下检测各组均可观察到绿色荧光表达,筛选后各组克隆形成数以900V／cm和5ms组最多;PCR检测得到了预期条带,说明目的基因已经成功导入。分离得到的牛胎儿耳成纤维细胞有可能作为体细胞核移植的供体,进行转基因克隆研究。     

水牛腔前卵泡的体外培养方法

本研究旨在建立一套适合水牛腔前卵泡体外生长发育的培养体系.取用来自本地屠宰场的中国沼泽型水牛卵巢,采用梳刮法回收腔前卵泡,以McCoys 5a作为基础培养液,分别用微孔板培养法、二维培养法、三维培养法进行体外培养.结果表明:不同培养方法对水牛腔前卵泡的体外发育能力有显著差异.培养至10 d,三维培养法的卵泡存活率显著高于微孔板培养法和二维培养法的卵泡存活率(65.05% vs 33.08%,49.52%,P<0.05);二维培养法的卵泡成腔率为1.91%(2/105),三维培养法的卵泡成腔率为1.94%(2/103),而微孔培养法的卵泡未发现成腔;三维培养法的卵泡直径平均增长显著高于微孔板培养法和二维培养法的卵泡直径增长(13.03±5.37 μm vs 7.53±2.26 μm,10.27±4.24 μm,P<0.05).由此可见,三维培养法是水牛腔前卵泡的有效体外培养方法.     

小鼠胚胎卵巢卵泡体外无血清培养体系的建立(英文)

调节原始卵泡形成、起始生长的信号目前仍知之甚少。一个重要的原因就是缺乏一个良好的研究模型。我们以妊娠１３天昆明白小鼠胚胎卵巢为研究材料,经过５天的贴壁培养后,分别用牛血清（ＦＢＳ）、无血清（ＩＴＳ）和含有人卵泡刺激素（ＦＳＨ－ＩＴＳ）培养液继续体外培养到第１９天,发现ＩＴＳ组培养的胚胎卵巢卵泡发育要显著优于ＦＢＳ组（Ｐ＜０．０１）,如：培养至第７天时（Ｐ１,相当于出生日）,卵泡数分别为２９５±１８和 ２０６±１７;培养至第１３天时（Ｐ７）,卵泡数分别为 ５９４±３１和 ２６２±２８;培养至第１９天时（Ｐ１３）,卵泡数分别为 ３７１±２５和 ５０±１１（Ｆｉｇ．１,２＆４）。ＩＴＳ处理组的绝大部分卵巢在培养早期（如：Ｐ５前）都形成了皮质－髓质样的卵泡生长模式,而ＦＢＳ处理组超过半数卵巢不能形成皮质一髓质样的卵泡生长模式;ＦＳＨ－ＩＴＳ处理组和ＩＴＳ处理组的胚胎卵巢卵泡发育并无显著差异（Ｆｉｇ．２,４＆５）。 结果提示所建立的以ＩＴＳ为血清替代物的无血清培养模型更益于小鼠胚胎卵巢卵泡的体外发育;ｈＦＳＨ不是小鼠胚胎卵巢早期发生发育所必须的。     

一种早期胚胎体外培养新方法的建立

建立一种不依赖于液体石蜡的早期胚胎体外培养方法——套皿法,并比较了4种不同处理方法体外培养胚胎的效果。结果显示,采用套皿法进行胚胎培养,盖液体石蜡和不盖液体石蜡皿中的胚胎在各阶段的发育率差异不显著。与套皿法相比,用单皿微滴覆盖法(Brinster法)培养的胚胎在各阶段的发育率显著降低。不覆盖液体石蜡单皿中的胚胎则阻断于二细胞阶段。实验设计的套皿法是一种有效的早期胚胎体外培养方法,为早期胚胎体外培养提供了一种新方法。     

Establishment of a clonal cell line that differentiates into adipose cells in vitro

Summary From the fibroblastic cells of murine mammary tumor tissue we isolated a clonal cell line that could be induced to differentiate into fat-accumulating cells in vitro. Differentiation began after the cultures had reached confluence and was accompanied by (a) an increase in the incorporation of sodium acetate into the triglyceride (TG) fraction of cellular lipids, (b) a more than 50-fold increase in cellular TG content per milligram cell-layer protein basis and (c) the cessation of cellular DNA synthesis. The addition of insulin to the culture medium enhanced lipid accumulation and increased the fraction of cells that differentiated into adipocytes. When insulin (5 to 10 μg/ml) was added exogenously, 80% or more of the cells were induced to differentiate into mature adipocytes within 2 weeks. This cell line can be used as a model for mammalian cell differentiation and also as a convenient material for the study of lipid metabolism in adipocytes. This work was supported by Grants in Aid from the Ministry of Education, Science and Culture and from the Ministry of Health and Welfare of Japan.     

高效的'大红'甜橙实生苗上胚轴离体培养与植株再生体系的建立

以‘大红’甜橙实生苗上胚轴为外植体,研究其离体培养和植株再生技术的结果表明,MS 1.0mg·L-16-BA的培养基诱导不定芽的效果最好,30d时诱导率达97.5%。外植体抗性筛选出最适kanamycin浓度为50mg·L-1。IBA和NAA都促进不定芽生根。1/2MS 4.0mg·L-1IBA和1/2MS 1.5mg·L-1NAA诱导根的效果最佳,生根率和根数分别达到76.92%、0.81和92.31%、1.88。     

■木新芽变离体培养体系研究

为保存和加快繁殖(?)木新芽变材料,采用离体培养技术对外植体进行了愈伤组织诱导,分化,丛芽增殖和生根培养的研究．结果表明：叶片形成的愈伤组织都不分化,而茎段愈伤组织在含细胞分裂素 BA,KT 的培养基中均可分化,以 MS+KT0．6+IBA0．5培养基分化效果好,分化率达3．0个芽/块．1/2MS+IBA 2 mg/L 培养基最适合生根培养;芽变材料在黑暗条件下生根率达100%．