分离自1例慢性阻塞性肺疾病患者的Aspergillus lentulus在蜡螟模型上的毒力初探

目的建立Aspergillus lentulus(A.lentulus或A.L)感染动物模型,借动物模型初步探究A.lentulus的毒力。方法将125只蜡螟随机分成5组,以Aspergillus lentulus临床株、Aspergillus lentulus标准株作为实验组,烟曲霉、白念珠菌为对照组,PBS为空白对照组。实验组及对照组菌株分别制成10~6 CFU/mL孢子悬液,感染各组蜡螟。记录72 h内蜡螟的生存情况并制作生存曲线,24 h后提取蜡螟肠道组织,HE染色组织切片观察肠道组织损伤情况,用组织匀浆法,测定蜡螟肠道内真菌载量及真菌逆培养阳性率,用真菌荧光染色法观察肠道培养真菌镜下形态。结果 A.lentulus临床株和A.lentulus标准株的蜡螟存活数与对照组之间差异有统计学意义(P0.05);结果显示A.lentulus临床株和A.lentulus标准株肠壁结构大致正常,局部可见水肿少量菌丝、孢子及炎症细胞浸润,对照组肠道结构破坏严重,可见菌丝、孢子及大量炎症细胞浸润;不同菌种感染蜡螟幼虫各组肠道载菌量及真菌逆培养阳性率比较,差异具有统计学意义(P0.05);真菌荧光显微镜观察,A.lentulus临床株和标准株菌丝多、孢子少,白念珠菌和烟曲霉组孢子多。结论与烟曲霉和白念珠菌相比,A.lentulus菌株对蜡螟毒力和肠道损伤能力较弱且致死率低。     

荧光蛋白报告基因在植物寄生真菌研究中的应用

综述菌根真菌、植物内生菌和植物病原真菌等植物寄生真菌转荧光蛋白基因研究现状.介绍转化载体的构建、转化方法及特基因的检测方法,以及转荧光蛋白基因技术在植物寄生真菌侵染过程研究中的应用,指出真菌转荧光蛋白基因存在的问题和展望.     

莱芙特敏荧光染色法、Baso荧光染色法与KOH湿片法在诊断浅部真菌病的应用对比

正浅部真菌病包括手足癣、体股癣、甲真菌病、花斑糠疹和头癣等,目前最常用的诊断技术是KOH湿片法,其具有经济简便等特点,但易受标本中的杂质如油脂、纤维、气泡等干扰,依赖检查人员的主观判断,易造成误差[1-2]。近年来真菌荧光染色技术在各大医院推广,从最初需加A、B液两步法到一步法的改进,荧光染色液的种类也不断增多,我院皮肤科真菌实验室使用莱芙特敏荧光染色法、Baso荧光染色法和KOH湿片法同时对200份标本进行真菌直接镜检,探讨两种荧光染液染色法镜     

固定化蛋白质A在流动注射荧光免疫分析中的应用

利用蛋白质A在近中性pH条件下,能够与大多数哺乳动物抗体的Fc部分结合;在低pH条件下,又能将抗体洗脱下来的特性,以一蛋白质A固相免疫反应器,分离与抗体结合及未结合的抗原.并结合流动注射进样方便的特点建立了一个快速、简便并易于自动化的流动注射荧光免疫分析方法.研究了各种实验变量对测定的影响,并用于人体转铁蛋白的测定．     

流式微球一步法快速免疫检测马铃薯A病毒

[目的]建立流式微球一步法快速免疫检测马铃薯A病毒(PVA)的新方法.[方法]以荧光微球为反应载体,通过在微球表面进行双抗夹心免疫反应形成微球-捕获抗体-PVA-标记FITC检测抗体的复合物,利用流式细胞仪荧光检测系统收集荧光信号.[结果]通过实验优化检测条件,最佳捕获抗体工作浓度为4μg/mL、最佳检测抗体工作浓度为1:25倍稀释、最佳反应时间为2h;与马铃薯Y病毒、莴苣花叶病毒、番茄环斑病毒等均未出现交叉反应;阳性样品经64倍稀释后依然可检出,检测灵敏度是传统微孔板ELISA的4倍.[结论]流式微球一步法能灵敏、快速、简便的检测马铃薯A病毒.     

真菌的自发荧光现象研究

本试验用激光共聚焦扫描显微镜对三株不同真菌的菌丝、分子孢子以及子实体的自发荧光现象进行了观察,结果发现：处于相同培养条件的三株真菌的荧光分布特点不一,并且同一真菌在不同培养基条件下所表现的荧光现象亦有差异,说明真菌的自发荧光具有种属特异性并受到培养基质等因素的影响,而培养时间对荧光强度及类别的影响不显著。化学试剂的处理试验表明,弱碱性物质对真菌的荧光具有减弱效应,而强碱性物质对真菌的荧光则表现为增强,提示不同真菌细胞内的自发荧光物质结构上和组分上的差异,其变化可导致荧光性质的改变。     

应用实时荧光PCR技术检测构巢曲霉的初步研究

目的 根据构巢曲霉（Aspergillus nidulans）3-磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）基因特异位点设计并合成Taqman探针及引物,建立构巢曲霉实时荧光 PCR检测方法。方法 应用lasergene7.1软件对构巢曲霉与13种常见曲霉主要包括黑曲霉（A.niger）、烟曲霉（A.fumigatus）、杂色曲霉（A.versicolor）、土曲霉（A.terrus）、黄曲霉（A. flavus）、温特曲霉（A.wentii）、寄生曲霉（A. parasiticus）、泡盛曲霉（A.awamori）、米曲霉（A. oryzae ）、棒曲霉（A.cavatus）、赤曲霉（A.ruber ）、亮白曲霉（A.ochraceus）及赭曲霉（A.ochraceus）GAPDH基因序列比对分析,在特异位点设计引物和探针,建立构巢曲霉实时荧光 PCR检测方法,并对该方法进行特异性及敏感性分析。结果 用曲霉属22种41株不同曲霉及其他属的12株病原真菌验证实验表明,所建立的荧光PCR方法特异性强;检测灵敏度可达4.03×10－12μg/ml的模板DNA。 结论 应用实时荧光PCR技术能够有效检测构巢曲霉,该方法具有特异、灵敏、快速等特点,可在实际工作中应用。     

不同发酵茶中优势真菌的分离鉴定 及产消化酶活性比较

目的分离鉴定云南普洱茶、广州小青柑、广西六堡茶和湖南熙茯茶中的主要真菌,并探讨其产消化酶活性。方法采用平板涂布法分离不同发酵茶中的真菌,通过其ITS序列进行分子鉴定;利用平板透明圈法测定不同真菌的产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶活性。结果从4种发酵茶中共分离出8种真菌,其中,在云南普洱茶中分离出2种真菌,分别为篮状菌(Talaromyces. sp.)和T.variabilis;广州小青柑中分离出3种真菌,分别为阿曲霉(Aspergillus amstelodami)、烟曲霉(A.fumigatus)和绳状篮状菌(T.funiculosus);广西六堡茶中分离出2种真菌,分别为黑曲霉(A.niger)和冠突曲霉(A.cristatus);湖南熙茯茶中仅分离出谢瓦曲霉(A.chevalieri)。其中Talaromyces. sp.、T.variabilis、A.niger、A.amstelodami、A.fumigatus、T.funiculosus有产纤维素酶活性,Talaromyces. sp.、T.variabilis、A.cristatus、A.fumigatus、T.funiculosus有产淀粉酶活性,Talaromyces. sp.、T.variabilis、A.niger、A.fumigatus、T.funiculosus有产蛋白酶活性,A.niger有产脂肪酶活性。在8种真菌中,T.variabilis、烟曲霉和绳状篮状菌可同时产纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶;黑曲霉能同时产纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶;冠突曲霉仅有产淀粉酶活性;阿曲霉仅有产纤维素酶活性。通过比较不同真菌的产酶活性表明,烟曲霉的产蛋白酶活性能力最强;Talaromyces sp.的产纤维酶活性能力最强;Talaromyces. sp.和绳状篮状菌的产淀粉酶活性最强。结论发酵茶的真菌以曲霉菌属Aspergillus、散囊菌属Eurotium和篮状菌属Talaromyces为主,多数真菌具有产消化酶活性,这些酶可能在茶叶发酵过程中起重要作用,并影响发酵茶叶的品质。     

蛋白质微阵列检测抗原-抗体相互作用

为了制备蛋白质微阵列和研究芯片表面抗原-抗体的相互作用,研究了如何在玻片表面固化蛋白质和用荧光染料（Cy3,Cy5）对蛋白质进行标记.结果表明,在醛基修饰的玻璃表面,通过共价偶联的方法将抗原或抗体固定到芯片表面,能使二者保持其特异性结合能力.同时,荧光标记后的抗原或抗体仍然具有特异性结合能力.蛋白质微阵列是通过机械手在玻片表面排阵制作的.芯片上的荧光信号获取采用了激光共焦荧光扫描系统.用不同浓度的抗原探针阵列,对其相应的抗体靶分子的特异性结合进行了分析和研究.此外,还通过在玻片表面固定兔IgG和固定鼠IgG,对羊抗兔和羊抗鼠抗体与其相应抗原的特异性相互作用进行了检测.     

精核蛋白对小鼠1-细胞期受精卵转录的影响

应用一种非常敏感的、新的荧光方法 ,进行了精核蛋白对小鼠 1 细胞期受精卵转录影响的观察 .hCG注射后 18h的受精卵作为精核蛋白抗体显微注射对象 .镜下观察 ,非抗体注射与抗体注射的卵细胞荧光强度有明显差异 .根据荧光分光光度计测得的结果 ,抗体注射卵细胞的平均荧光强度值相当于抗体非注射的 2 2 8%,高 1 3倍 ,经t检验 (n =30 )得P <0 0 1,差别有显著性意义 .而非BSA注射和BSA注射卵细胞的镜下观察 ,则没有多大差异 ;测两组卵细胞的相对荧光强度值分别为 10 0 %和 115 %,t检验 (n =30 )得p >0 0 5 ,差别无统计学意义 .将α 鹅膏蕈碱与精核蛋白抗体等量混合后一起注射 ,卵细胞组间荧光的显著性差别不复存在 .实验结果表明 ,精核蛋白在小鼠 1 细胞期受精卵中起着转录抑制作用 .     

低温胁迫下丛枝菌根真菌对玉米光合特性的影响

利用盆栽试验,在15 ℃和5 ℃低温胁迫下研究了丛枝菌根（AM）真菌对玉米生长、叶绿素含量、叶绿素荧光和光合作用的影响.结果表明：低温胁迫抑制了AM真菌的侵染;接种AM真菌的玉米地上部和地下部干物质量、相对叶绿素含量高于不接种植株.与非菌根玉米相比,菌根玉米具有较高的最大荧光（F_m）、可变荧光（F_v）、最大光化学效率（F_v/F_m）和潜在光化学效率（F_v/F_o）及较低的初始荧光（F_o）,并且在5 ℃处理中差异显著.接种AM真菌使玉米叶片的净光合速率（P_n）和蒸腾速率（T_r）显著增强;低温胁迫下,菌根植株的气孔导度（G_s）显著高于非菌根植株;而胞间CO₂浓度（C_i）显著低于非菌根植株.表明AM真菌可通过提高叶绿素含量及改善叶片叶绿素荧光和光合作用来减轻低温胁迫对玉米植株造成的伤害,提高玉米耐受低温的能力,进而提高玉米的生物量,促进玉米生长.     

荧光染色法与KOH湿片法在真菌直接镜检中的应用比较

目的探索一种结果更可靠的真菌直接镜检方法。方法对600例临床高度疑似真菌感染的标本分别采用荧光染色法和KOH湿片法进行真菌直接镜检。结果荧光染色法和KOH湿片法的真菌检出率分别为97%和88.5%。结论荧光染色法是一种适合临床的、快速有效的真菌镜检方法。     

新疆双峰驼天然单域抗体库的构建及初步鉴定

旨在构建新疆双峰驼天然单域抗体库,及从中快速筛选VHH抗体.采用两种不同的抗原(溶菌酶和cAb-HEWL23)用天然文库进行筛选,成功筛选到了相应的抗体,并融溶菌酶筛选的VHH抗体(A3-1,A4-1和A10-1)进行表达和初步的ELISA检测.结果显示,A3-1和A10-1具有结合溶菌酶的能力.该方法简单方便、省时省力,可以快速从天然单城抗体库中筛选VHH抗体.     

病毒免疫荧光结合物性能的研究

统一测定荧光血清中各种成分的方法,观察荧光素(F)、蛋白质(P)及免疫活性抗体(ab)间的比例关系,使之规格化,对荧光血清的制备检定有重要意义,也是免疫荧光技术在推广应用中极待解决的问题。E.H.Beutner报告了抗人IgG的检定及其对抗梅毒螺旋体抗体及抗核抗体的染色效果。E.H.Hébert,等报告了细菌的直接荧光抗体制剂的最适F/P。为了     

荧光蛋白在双色蜡蘑中的构建与表达

菌根是真菌与植物之间形成的互惠互利的营养共生体,对生态环境有重大的意义。外生菌根真菌与植物互作机制以及真菌基因功能的深入研究都需要对菌根真菌进行遗传转化,本研究以外生菌根真菌模式生物双色蜡蘑(Laccaria bicolor)为研究对象,选择细胞核中的核小体蛋白H₂B基因为目的基因,以pCEBN为表达载体,融合红色荧光蛋白,最终构建在真菌中表达的双元载体,使用根瘤农杆菌介导转化法转化双色蜡蘑菌丝,随后利用PCR对真菌转化子进行验证后,通过激光共聚焦显微镜观察到菌丝细胞核中的红色荧光,成功将融合荧光蛋白转化菌根真菌,为后续研究菌根真菌中基因的亚细胞定位提供了实验平台。结果表明,利用双元载体和农杆菌转化方法,建立了高效的双色蜡蘑转化体系(93.33%),在激光共聚焦显微镜下观察到菌丝细胞核中红色荧光信号,验证了融合荧光蛋白在双色蜡蘑中的成功表达。本研究成功地构建了菌根真菌中的核小体蛋白和红色荧光蛋白融合表达的真菌转化体系。     

石果衣真菌(Endocarpon pusillum)比较转录组分析揭示其抗旱特性

从沙漠地区地衣石果衣中分离得到的地衣型真菌(Endocarpon pusillum)具有极强的抗旱能力.为了研究石果衣真菌的抗旱机制,本研究利用转录组测序和荧光定量的方法分别对纯培养和共生状态的真菌进行分析和比较.比较转录组分析是针对纯培养的石果衣真菌,比较其在正常培养和胁迫培养条件下的2个样品,得到1781个差异表达基因.以抗旱植物和非地衣型真菌的抗旱机制作为参照,一些普遍存在机制中所涉及的基因在石果衣真菌中也是差异表达的.然而不同的是,石果衣真菌的抗旱机制中不涉及有关渗透压调节基因的差异表达,这一特点为揭示石果衣真菌为干旱适应物种提供了证据.此外,石果衣真菌不同于其他生物,还有一系列差异基因被归类于其特有的干旱适应机制.为了确定共生与纯培养状态下的石果衣真菌的抗旱机制是否一致,本研究挑选了23个候选基因,利用荧光定量的方法在脱水地衣体中进行验证.本研究为下一步地衣型真菌的研究提供有价值的数据支持,同时也会有助于抗旱基因的功能研究.     

鸡舍空气真菌浓度及多样性研究

采用6级Andersen生物空气采样器和常用真菌计数培养基,对鸡舍空气真菌的浓度和多样性进行了研究。空气样本经培养、计数和纯化共鉴定出78种真菌,以有丝分裂孢子真菌为主,优势真菌类群为Cladosporium,Penicillium,Aspergillus,Candida,Alternaria及Fusarium等,其中包括A.flavus,A.fumigatus,A.niger及F.sporotrichioides等在内的10余种禽类病原真菌。鸡舍内空气真菌的平均浓度为2.3×103CFU/m3。A.flavus,A.fumigatus及A.niger在鸡舍空气中的浓度相对较高。鸡舍空气真菌呈对数正态分布,Cladosporium,Penicillium及Aspergillus主要分布在C和D级(3.0~6.0μm),A和B级(>6.0μm)及E和F级(<3.0μm)相对较少。此外,还分离到出现频率较低但对公众健康构成潜在危害的病原真菌,如Candida albicans,Histoplasma capsulatum,Cryptococcus neoformans及Coccidioides immitis等。     

轮状病毒免疫荧光技术

<正>免疫荧光检测的原理是利用抗原抗体特异性反应的特点,使荧光素和抗体结合后不改变抗原抗体反应的特异性。所以当用荧光标记的抗体和特异抗原作用时,能形成抗原抗体复合物,并且在荧光显微镜下,由紫外光激发,能看到明亮的荧光。从而对标本中的微量抗原或抗体进行鉴定。     

Asia-I口蹄疫病毒P1-2A基因真核表达质粒的构建及小鼠免疫试验

目的:构建含有Asia-Ⅰ型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A 基因的真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A,并用pVAXⅠ-P1-2A免疫小鼠,评价其体液免疫和细胞免疫水平.方法:通过RT-PCR 方法扩增得到含有FMDV P1-2A编码区的目的基因,并将其克隆到pMD18-T载体上.将pMD18-T-P1-2A和 pVAXⅠ分别经EcoRⅤ和XbaⅠ双酶切后连接构建真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A.将酶切鉴定正确后的重组质粒转染HeLa细胞进行IFA检测.再进行小鼠血清特异性抗体试验、小鼠T淋巴细胞增殖试验和IFN-γ ELISPOT试验.结果:酶切结果与预期目的条带大小相符;荧光结果表明经pVAXⅠ-P1-2A转染的细胞有明显的黄绿色荧光,说明P1-2A基因在HeLa细胞中得到了表达;小鼠免疫结果表明,免疫的小鼠都产生了较强的体液免疫和细胞免疫,并且T淋巴细胞增殖数和产生IFN-γ的细胞数和对照组相比显著提高(P<0.05).间接ELISA试验表明,在免疫第14天抗体水平比对照组明显增高(P<0.05).结论:成功构建了真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A,并通过小鼠免疫试验发现重组质粒试验组能够诱导产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答.     

重组抗A型肉毒毒素人鼠嵌合单克隆抗体的瞬时表达及中和活性研究

为了制备重组抗A型肉毒毒素(botulinum neurotoxin A,BoNT/A)人鼠嵌合单克隆抗体并分析中和活性,以BoNT/A作为抗原筛选鼠源抗BoNT/A噬菌体单链抗体库,将筛选得到的鼠源抗BoNT/A特异性单链抗体的重链和轻链可变区分别克隆到pGP5KCγ和pGP5KCκ载体构建表达质粒。表达质粒共转染HEK-293EBNA1细胞,瞬时表达抗BoNT/A人鼠嵌合单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)。蛋白A亲和纯化mAb,分子排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)分析mAb纯度,小鼠中和试验评价mAb中和活性。结果显示,经过筛选得到4个序列正确且各不相同的抗BoNT/A单链抗体。4个抗BoNT/A人鼠嵌合mAb表达质粒均构建成功并转染HEK-293EBNA1细胞,根据转染效率指示绿色荧光蛋白的表达推测,50%～62. 5%的细胞表达抗BoNT/A抗体。表达上清经过蛋白A亲和纯化,浓度均200μg/mL,单体纯度均90%。小鼠中和试验显示mA1、mA2、mA3和mA4单株抗体均不能完全中和4 LD_(50)的A型肉毒毒素,但从延迟小鼠生存时间可以得出4个抗体的中和活性为mA3mA2mA1mA4。mA1、mA2、mA4中任何一个抗体与mA3连用中和活性为80 LD_(50)/mg。本研究制备了4个具有不同程度中和活性的抗BoNT/A人鼠嵌合mAb,为A型肉毒神经毒素鸡尾酒疗法奠定了基础。