Ⅱ型胶原-硫酸软骨素支架的制备及组织工程软骨的构建

研究经乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)处理的Ⅱ型胶原-硫酸软骨素支架材料的性能特点,并在体外构建组织工程软骨。从鸡软骨中提取Ⅱ型胶原,以不同浓度的EDC为交联剂通过冷冻干燥的方法制备Ⅱ型胶原与硫酸软骨素复合支架并测定其理化性质。将体外培养的新生兔关节软骨细胞接种在Ⅱ型胶原与硫酸软骨素复合支架上,观察软骨细胞在支架上的生长形态并检测支架上软骨细胞分泌的糖胺聚糖含量及Ⅱ型胶原含量。结果表明:采用EDC与硫酸软骨素交联增加了支架的稳定性,最适的交联剂质量浓度为7 mg/mL。软骨细胞在复合支架上增殖分化良好,并保持软骨细胞特异分化的表型,分泌Ⅱ型胶原与蛋白多糖(GAG)。培养14 d后已有软骨样组织形成。     

MMP-2、MMP-3、MMP-9、TIMP-3及Col-Ⅱ因子在兔软骨细胞损伤后的表达变化

检测MMP-2、MMP-3、MMP-9、TIMP-3及Ⅱ型胶原细胞外基质因子在正常兔关节软骨细胞和划伤后不同时间点的表达变化。在无菌条件下获取兔膝关节软骨细胞,原代体外培养软骨细胞,六孔板内制备细胞损伤模型。用显微镜观察正常细胞和损伤后1 d、3 d和7 d 3个时间点的软骨细胞增殖情况。采用实时PCR检测正常软骨细胞和损伤后1 d、3 d和7 d 3个时间点的基质金属蛋白酶-2、3和9,基质金属蛋白酶抑制物-3及Ⅱ型胶原的m RNA的表达水平。成功分离软骨,经原代培养后成功建立损伤细胞模型。MMP-2损伤后第1天与正常组相比升高,第3天时下降,第7天明显水平最高。与正常组相比,MMP-3在细胞损伤后第1天表达明显下降,随后第3天逐渐下降,第7天与第3天未见明显变化。MMP-9划伤后第1天比正常组升高,第3天上升至最高水平,第7天下降。TIMP-3基因在损伤后第1天与正常组相比明显下降,随后第3天稍有升高,第7天水平最低。Ⅱ型胶原划伤后第1天与正常组相比明显升高,随后第3天呈下降趋势接近于正常组,第7天又呈上升趋势。MMP-2、MMP-3、MMP-9、TIMP-3因子和Ⅱ型胶原在细胞损伤后的不同时间点有不同的表达行为,这可为调节细胞外基质基因治疗关节软骨损伤选择合适的靶基因和时间窗提供实验依据。     

大鼠软骨Ⅱ型胶原体外胶原原纤维的形成

建立了Ⅱ型胶原的提取和纯化方法,观察大鼠软骨Ⅱ型胶原体外胶原原纤维形成的动力学、胶原原纤维的稳定性和超微结构。结果表明,Ⅱ型胶原静止期、增长期分别为15、120min,增长期凝胶化速率0.0060,凝胶可复性13.58％,胶原原纤维呈典型的具有64nm周期横纹的自然纤维结构,但纤维直径较体内增长。这些对研究体内胶原原纤维的形成过程及调节机制具有重要意义。     

软骨下骨病变在骨关节炎发病机制中的作用

骨–软骨下骨是一个由关节透明软骨、钙化软骨和软骨下骨组成的整体功能单位,其中任何一个组织的变化都会直接或间接影响该复合单位内其他组织的结构及功能。它们之间的生物力学与生物化学分子的相互作用在关节稳态维持和关节退化中起到重要的作用。在骨关节炎中,关节软骨的损伤或缺损,使传递到软骨下骨上的机械负荷明显增加,导致软骨下骨异常骨重塑,同时出现微裂纹,使其正常力学性能被破坏。软骨下骨正常力学性能的破坏反过来又使得关节软骨承受更大的应力,导致软骨的损伤和退行性病变进一步加重。此外,软骨下骨异常骨重塑导致软骨下骨板孔隙增加和血管新生,为骨–软骨单元的生物化学分子的双向交流提供可能,从而促进骨关节炎的发生发展。     

活性氧及过渡金属对关节软骨蛋白聚糖降解的影响

在温育的小牛关节软骨切片介质中加入黄嘌呤氧化酶/次黄嘌呤活性氧产生系统,可使关节软骨蛋白聚糖的降解显著增高。这种作用不能被超氧化物歧化酶或铁络合剂二乙三胺戊乙酸抑制,但可被过氧化氢酶抑制。在温育的介质中加入H_2O_2,也可使关节软骨蛋白聚糖降解增高,Cu~(2+)或Co~(2+)对此有显著促进作用,其它过渡金属则作用不明显。应用Sepharose 6B柱层析,分析软骨蛋白聚糖降解产物,多数实验组只在kD=0处有一个大分子的洗脱峰,但Cu~(2+)+H_2O_2组则在kD=0及0.57处出现两个洗脱峰(分别称为峰Ⅰ及峰Ⅱ)。醋酸纤维素薄膜双向电泳证实峰Ⅱ为硫酸软骨素,提示Cu~(2+)与H_2O_2复合物可导致蛋白聚糖分子的断裂。本研究结果可能有助于阐明某些变性型骨关节疾病的发病机理,例如因缺硒所致的大骨节病等。     

碱性成纤维细胞生长因子与胶原对组织工程软骨体外构建的影响

目的：以三维成团培养为培养系统,探讨bFGF与胶原对组织工程软骨体外构建的影响。方法：成团培养兔生长板软骨细胞,设bFGF、胶原及联合作用组。HE染色观察新生组织形态;免疫组化检测Ⅰ、Ⅱ型胶原表达以观察细胞表型;Hoechst 33258法检测细胞DNA含量;羟脯氨酸法与阿新蓝法测定基质中胶原与蛋白多糖的合成。结果：新生软骨的组织学形态近似自然软骨;各实验组软骨细胞DNA含量明显上升;胶原可以显著促进基质的合成;各实验组Ⅰ型胶原的表达少于对照组,Ⅱ型胶原的表达则高于对照组;联合作用组效果更加明显。结论：三维的成团培养可以促进基质合成,有效维持软骨细胞表型;bFGF与胶原有利于工程化软骨构建,其效果具有协同效应,两者联合应用可进一步促进软骨再生。     

大鼠胫骨近端骨骺损伤后骨桥形成分子机制的研究

利用胫骨近端干骺端骨骺损伤的大鼠动物模型,研究骨桥形成的分子病理机制.通过Alcian blue染色观察损伤模型的建立、损伤愈合过程以及骨桥形成情况.采用Tunel试剂盒原位细胞凋亡检测,了解损伤区及周围细胞凋亡情况.利用免疫组织化学及原位杂交实验,观察损伤区周围软骨细胞改变,检测损伤区是否有软骨细胞生成,检测刀Ihh以及Ptch1表达阳性细胞.发现骨骺损伤骨桥形成过程中,完全损伤区中心没有软骨细胞特异的因子Col2al和ColX以及删Ihh和Ptch1的表达,但是完全损伤区和周围正常软骨交界间存在次损伤软骨区,存在软骨细胞凋亡,有Col X的表达,vimentin检测发现,在此区和周围正常软骨间有正常肥大区软骨细胞异常分化而来的成纤维样细胞并形成软骨外膜样结构,次损伤区和软骨外膜结构逐渐被骨桥替代,在此过程中软骨外膜样结构存在Collal、Ptch1和Ihh的表达,提示Ihh可能参与骨桥形成过程.提出骨桥形成过程中损伤中心区域存在膜内化骨,边缘区域存在软骨化骨作用机制.     

小鼠胶原诱导性关节炎模型的建立及其免疫学变化研究

目的 胶原诱导性关节炎模型（collagen induced arthritis,CIA）是研究类风湿性关节炎发病机制和治疗药物筛选的理想模型,也是目前国际上公认的关节炎模型.但是,目前鲜见Ⅱ型胶原诱导CIA模型的系统免疫学变化的报道.因此,本研究采用DBA/1小鼠诱导了CIA模型,并对其免疫学改变进行了系统研究.方法 将牛Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂混和并充分乳化,于DBA/1小鼠尾根部皮内注射进行初次免疫,20 d后同样方法进行再次免疫.应用千分尺测量CIA模型小鼠的左右两侧足掌厚度,并进行关节炎评分.酶联免疫吸附试验测定小鼠血清Ⅱ型胶原特异性抗体,Luminex技术和αLISA技术测定血清及培养上清中的细胞因子水平.结果CIA小鼠于造模后23 d开始,陆续出现前肢、后肢的红肿、功能障碍,发病率高达100％,且随着时间的延长其关节肿胀程度呈进行性加重,关节炎评分增高.CIA小鼠脾脏指数较正常组明显升高,且Ⅱ型胶原刺激的特异性T细胞增殖明显增强.细胞因子检测结果表明,脾细胞培养上清中IFN-γ和1L-4含量及IFN-γ/IL-4比值明显升高,TNF-α和IL-1β水平亦显著升高.此外,CIA小鼠血清中存在高水平的Ⅱ型胶原特异性抗体.结论 Ⅱ型胶原诱导CIA模型发病率高,免疫学改变以Th1细胞因子升高为主,兼有细胞免疫功能及体液免疫功能损伤.     

唇腺炎性病变组织的共聚焦显微拉曼光谱特征研究

目的:研究唇腺炎性病变组织的拉曼光谱指纹特征,为拉曼光谱技术临床鉴别诊断唇腺炎性病变提供理论基础。方法:收集舍格伦综合征病变唇腺30例、唇腺急性炎症组织18例及正常唇腺组织30例,应用激光共聚焦显微拉曼光谱仪对唇腺组织进行拉曼光谱检测。应用主成分分析法(Principal component analysis,PCA)及判别函数(Discrimination function analysis,DFA)对光谱数据进行分析,研究唇腺组织光谱指纹诊断价值。结果:唇腺炎症组织与正常组织光谱间存在光谱指纹差异,这些差异代表了某些蛋白、核酸及脂类物质等生物大分子发生改变。PCA-DFA分析发现这些差异性拉曼光谱具有鉴别诊断价值,可以区分不同唇腺组织,总体诊断准确率达91.8%,经交互验证后准确率为89.4%。结论:不同唇腺炎症组织及正常组织间拉曼光谱存在差异,不仅揭示生物大分子改变,还具有临床鉴别诊断价值。拉曼光谱技术在唇腺炎性病变组织鉴别诊断具有巨大应用潜力。     

拉曼光谱分析技术在细胞生物学研究中的应用进展

细胞是生物体结构和功能的基本单位,自被发现以来新的研究方法不断涌现。单细胞拉曼光谱能提供细胞内核酸、蛋白质、脂质含量等大量信息,可在不损伤细胞的条件下实时动态地监测细胞分子结构变化,亦可获得细胞的“分子指纹”,具有敏感性高、实时检测、活样品不需固定或染色、不损伤细胞等众多特点。近年来国内外研究者将拉曼光谱应用于细胞药物处理、细胞水平疾病诊断、单细胞生命活动监测、亚细胞结构等研究,取得了不同程度的进展。随着研究的深入,拉曼光谱分析技术必将在干细胞,癌症研究、细胞分选、药物筛选等领域大有作为。     

SERS光谱技术在人体体液研究中的应用

SERS光谱技术具有高检测灵敏度和高特异性的优点,广泛应用于生物组织,细胞及生物分子的研究,表现出极大的应用潜力。本文首先介绍了拉曼及SERS光谱技术的原理,综述了SERS光谱技术在人体体液分析检测的研究概况,特别介绍了本课题组针对血液、精液、尿液开展的研究工作,最后简要讨论SERS光谱技术的发展前景。     

拉曼光谱在胃癌诊断中的应用与研究进展

拉曼光谱是一种分子振动光谱技术,具有分子水平的肿瘤检测和诊断能力.胃癌是常见恶性肿瘤,经常到晚期才得到诊断,死亡率较高,而早期胃癌预后较好,因此胃癌早期检测和诊断显得尤为重要.文章介绍了拉曼光谱用于胃癌早期检测和诊断的应用,并综述其研究进展,结果认为拉曼光谱探针与内镜整合,将实现胃癌活体检测和诊断,极具临床应用价值.     

SMAD3介导TGF-β1刺激软骨细胞增殖和抑制软骨细胞肥大性分化(英文)

为研究TGF β1 SMAD3信号对小鼠软骨细胞增殖和分化的影响 ,分离了野生型与Smad3基因剔除 (Smad3ex8 ex8)突变纯合子小鼠肋骨软骨细胞并进行了体外培养 .通过3 H TdR参入实验检测了体外培养软骨细胞的增殖能力 .TGF β1可以刺激野生型软骨细胞的增殖 ,Smad3基因缺失导致小鼠软骨细胞丧失对TGF β1刺激生长作用的应答 .Northern杂交显示 ,TGF β1促进野生型小鼠软骨细胞表达Ⅱ型胶原 ,而Smad3基因缺失突变纯合子软骨细胞大量表达肥大性软骨细胞的分子标记物X型胶原 .结果表明 ,SMAD3介导转化生长因子TGF β1刺激软骨细胞增殖并抑制软骨细胞的肥大性分化     

Nme2基因在畸形精子症中的作用分析

为了探讨Nme2(metastasis suppressor non-metastatic 2)基因在男性生殖中的作用,利用GEO(gene expression omnibus,GEO)基因芯片数据库对Nme2在精子发生中的表达情况进行数据挖掘和分析,通过MTT(5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)和PI-Hoechst实验构建过氧化氢诱导的GC-1 spg细胞氧化损伤模型,荧光定量PCR技术检测氧化损伤分子OGG1(8-oxoguanine DNA glycosylase),ALDH2(aldehyde dehydrogenase 2family)以及Nme2的表达。发现Nme2在不同类型生精细胞中差异性表达,在畸形精子中的表达显著降低;进一步研究发现Nme2在细胞氧化损伤过程中表达上调。结果表明Nme2与畸形精子症相关,其作用机制可能通过应答氧化损伤信号来实现。     

磷脂分子链构象及相变的拉曼光谱研究

本文报导了几种纯磷脂的固态、分散体或脂质体的激光拉曼光谱特性.在室温条件下固态DMPC、DPPC和DSPC的拉曼光谱表明,它们的分子链的有序性呈现差别.DMPC分子链的有序性远较其它二者为低.研究了DSPC的热致相变,分别观察固态DSPC的Ⅰ_(1100)/Ⅰ_(1064).～温度关系特性曲线和它的分散体的Ⅰ_(2882)/Ⅰ_(2847)～温度关系特性曲线,并发现上述两种关系特性曲线在相变温度之前均出现预相变峰,这可能反映在磷脂分子的相变过程中除trans(?)gauche构象转变外还存在其它构象的变化.DPPC分散体和脂质体的拉曼光谱特性进行比较的结果表明,曲率效应可能是脂质体分子链的有序性不同于分散体的原因.     

胶原蛋白的三股螺旋

关于胶原蛋白的研究,人们近来集中地注意到在细胞内的胶原纤维单体三个多肽亚基(α-链)形成特征的三股螺旋这个事实。从细胞外胶原蛋白的α-链在离体条件下很慢又很不完全的回复重天然状态的事实,人们设想这个原始合成的α-链可能有肽链延仲,而且这些延伸的或“挂了号”的肽链可能导致三股α-链迅速形成一种三股螺旋的结构。之后发现在许多组织内胶原生物合成过程中三股螺旋形成前的一种前体(前胶原蛋白)。Ⅰ型及Ⅱ型前胶原蛋白具有分子量为120,000—125,000的肽链。同时也发现所有的前α-链都含有半胱氨酸(而这个氨基酸在细胞外间质的胶原蛋白中是很罕见的),最近在人体组织中发现的Ⅲ型则例外。前胶原蛋白Ⅲ的双硫键位于前α-链和某些前胶原特有的三股螺旋双硫键稳定分子之间,它们的分子量约     

卟啉类光敏药物主要活性组份对溶菌酶的光敏杀伤特性

研究了卟啉类光敏药物主要活性组分：原卟啉（ＰＰ）、血卟啉（ＨＰ）及双卟啉醚、酯混合物（ＤＨＥ）对Ｈｅｌａ细胞（宫颈癌）的光敏杀伤作用特性,首次发现ＰＰ对癌细胞杀伤力最大,是最有效的卟啉组分。进而研究了其作用的分子机制,采用激光喇曼光谱技术,研究了三种组分对溶菌酶空间结构的光敏损伤。结果表明,它们对溶菌酶主链和侧链结构的损伤明显不同：ＰＰ对蛋白质主链结构中的β—折叠,β—回折的光敏损伤明显强于ＨＰ和ＤＨＥ且不随浓度而变．     

TGF-β1对体外培养的关节软骨细胞的作用

以原代培养的软骨细胞为材料,研究了转化生长因子IGF－β1对关节软骨细胞的增殖和软骨特异性基质代谢的作用,结果显示TGF－β1可以刺激细胞外基质中蛋白多糖含量的增加,并可以在转录水平上调节Ⅱ型胶原的表达。TGF－β1可以在体外诱导高密度培养的软骨细胞形成透明软骨样结构。没有用TGF－β1处理的高密度培养细胞不能形成透明软骨样结构,在透射电镜下观察发现其内部结构发生了异常变化。这些结果表明TGF－β1对于支持关节软骨细胞的体外培养具有重要的作用。     

氧化苦参碱对阿霉素所致大鼠心肌损伤的保护作用研究

目的：研究氧化苦参碱对阿霉素致大鼠心肌损伤的保护作用。方法：SD大鼠随机分成4组,阿霉素级（adriamycin,ADM）、阿霉素＋氧化苦参碱组（oxymatrine,OMT）,氧化苦参碱组,正常对照组。免疫组化染色法检测大鼠心肌Ⅰ Ⅲ型胶原的表达,用光镜及电镜观察心肌组织的病理改变及超微结构变化。结果：ADM组中大鼠心肌Ⅰ Ⅲ型胶原的表达显著增加,ADM＋OMT组也有相似改变,但较ADM组有显著下降,两组之间有显著差异（P〈0．05）;正常对照组与OMT组无变化。光镜及电镜结果显示ADM组与ADM＋OMT组大鼠心肌组织,均有损伤,但ADM＋OMT组较ADM组损伤明显减轻。OMT组动物未观察到心肌组织病理变化。结论：氧化苦参碱对阿霉素所致大鼠心肌损伤具有保护作用。     

D1/D2/Cytb-559复合物的共振拉曼光谱

光系统Ⅱ（ＰＳⅡ）反应中心Ｄ１／Ｄ２／Ｃｙｔｂ－５５９ 复合物在４８８ ｎｍ 处激发的共振拉曼光谱显示４ 个主要谱带,其峰位分别在１５３２（υ１）、１１６５（υ２）、１０１０（υ３）和９７０（υ４） ｃｍ － １处,表明ＰＳⅡ反应中心结合的β－胡萝卜素分子是全反式构型。Ｄ１／Ｄ２／Ｃｙｔｂ－５５９ 复合物的色素抽提液的拉曼光谱也显示４ 个主要的拉曼峰,其中υ４ 谱带的强度急剧下降,说明ＰＳⅡ反应中心内部结合的β－胡萝卜素分子与抽提液中自由的β－胡萝卜素分子的构象不同,而与光合细菌反应中心内部的类胡萝卜素分子的构象相似,其共轭多烯链的平面也处于扭曲状态