酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ片段的表达、纯化及晶体培养研究

[目的]为了培养用于X-衍射的酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ的蛋白晶体,为研究该酶的三维结构和功能打下基础;[方法]构建了表达酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ片段(Apaldn16)的表达质粒,用核苷酸序列分析证明了克隆片段的正确性.将重组载体转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),经.IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测了蛋白的表达情况.将粗蛋白用Ni-NTA亲和层析分离,收集组分进一步用Superdex 75分子筛纯化.纯化后的蛋白用SDS-PAGE和质谱检验其纯度和正确性,然后用悬滴气相扩散法进行了蛋白结晶条件的初筛.[结果]成功地用大肠杆菌可溶性地高效表达了Apaldn16蛋白.得到了分子量约为36 kD的单一蛋白条带,纯度在95%以上.质谱结果证明该蛋白纯度高,分子量正确.将纯化后的蛋白用悬滴气相扩散法进行晶体初筛,得到了针状簇晶.此晶体经SDS-PAGE检测,证明为Apaldn16蛋白晶体.[结论]利用大肠杆菌高效表达体系可以正确表达Apalan16蛋白,蛋白经过纯化后,用悬滴气相扩散法可以生长出针状晶体,适合于进一步的三维结构研究.     

枯草芽胞杆菌fmbj SrfAC-A结构域的活性测定

[目的]在体外研究surfactin合成酶的A结构域,为获得新的surfactin类似物奠定基础.[方法]本文从枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)fmbj中克隆出surfactin合成酶第7个模块的A结构域基因(SrfAC-A),与表达质粒pET-23a相连后在大肠杆菌表达系统中表达,用Ni-NTA亲和柱对重组蛋白SrfAC-A进行分离纯化后测定其活性.[结果]克隆所得的A结构域对Ile有选择活性,而对其他氨基酸基本无活性.[结论]Surfactin合成酶中的A结构域能在体外独立行使其选择底物氨基酸的功能.     

渗透压冲击法快速高效提取青霉素酰化酶

青霉素在临床上的大量使用造成了细菌的耐药性增强,青霉素本身又具有不宜口服、过敏性强等缺点,人们正致力于研究有诸多优良特性的半合成青霉素。大肠杆菌青霉素酰化酶用于裂解青霉素生产6-氨基青霉烷酸(即6-ＡＰＡ,半合成青霉素的重要中间体),该酶的提取、纯化和固定化研究在半合成青霉素工业有重要的意义[1]。大肠杆菌青霉素酰化酶属胞内酶,文献报道多采用超声波法提取,该法得到的粗酶液比活低,一般要经过四、五步纯化才能得到较高比活[2,3,4]的酶液。采用渗透压冲击法提取青霉素酰化酶,得到的粗酶液比活高,只需经过硫酸铵沉淀一步纯化就…     

热稳定酯酰辅酶A合成酶的异源表达及酶学特性

【目的】为寻找能合成丙酰辅酶A和丁酰辅酶A等聚酮合成前体的生物催化剂,用体外酶学实验对一个酯酰辅酶A合成酶进行了表征。【方法】利用丙二酰辅酶A合成酶作为输入序列,通过BLAST程序在Caldicellulosiruptor owensensis OL的基因组中找到1个酯酰辅酶A合成酶基因。在大肠杆菌中进行了异源表达,并通过亲和层析进行纯化。底物谱、最适反应条件、稳定性和动力学参数通过体外酶学实验进行表征,而定点突变则用于活性中心的氨基酸残基的分析。【结果】该酶具有较好的底物宽泛性,可识别丙酸、丁酸、2-甲基丙酸、戊酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸以及环己甲酸等一系列单酸。反应最适温度为30°C,最适p H为7.0。70°C保温8 h后仍有45%的活性残留,表明该酶相对比较稳定。通过活性中心3个位点的定点突变可以改变酶的底物特异性。【结论】C.owensensis OL来源的酯酰辅酶A合成酶是潜在的生物催化剂,可以用于聚酮前体的合成。     

一种新的抗菌药物靶标蛋白质(3，4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合成酶)的克隆、表达、纯化及酶活性鉴定

[目的]核黄素( vitamin B12,riboflavin)是辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)和黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)的前体物,对生物体的生物合成至关重要.如果细菌不能够从外界摄取足够的黄素( flavin)就需要自身合成核黄素以维持菌体的生存与增殖.3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合成酶(3,4-Dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase,DHBPs)为核黄素生物合成途径中关键酶之一.在镁离子存在的情况下,DHBPs将5-磷酸核酮糖(ribulose-5 -phosphate,Ru5P)转换成3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸(3,4-dihydroxy-2-Bu-tanone-4-Pho-sphate,DHBP)和甲酸盐(formate),生成的DHBP为核黄素合成的必需原料之一.人类没有合成核黄素的相关途径,因此细菌参与合成核黄素的DHBPs等相关酶就有望成为抗菌药物作用的靶位点.本课题通过对肺炎链球菌的DHBPs进行克隆表达纯化与酶学性质鉴定,为开展其三维结构的解析和抗菌药物设计提供重要的工作基础.[方法]利用PCR技术扩增DHBPs基因,构建重组表达载体pW28-DHBPs.将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21( DE3)中表达,用Ni离子亲和层析及离子交换(DEAE)纯化获得有活性的DHBPs后,进行酶学性质鉴定.[结果]酶切和测序证实成功构建了质粒pW28-DHBPs,在E.coli BL21中表达了可溶性DHBPs,纯化后获得了纯度为95％的靶蛋白质,经分子筛分析DHBPs在溶液中以二聚体形式存在.对DHBPs进行酶学性质分析表明,在25℃、pH为7.5和Mg2+存在的情况下,DHBPs具有将5-磷酸核酮糖转换成DHBP和甲酸盐的活性.[结论]第一次成功克隆并在E.coli BL21中表达了一种肺炎链球菌合成核黄素的相关酶—DHBPs,纯化后的重组DHBPs具有较好的5-磷酸核酮糖分解活性,这为解析其三维结构和基于结构进行的新一代抗菌药物设计提供重要的工作基础.     

白细胞上sLe~x合成的关键酶的克隆

协和发酵公司克隆了特异于白细胞上糖链sLe~x生物合成的α-1,3-岩藻糖转移酶(Fuc-TⅦ)。还确认克隆酶的细胞可接合于Selectin。 得知在白细胞浸润于炎症部位时,白细胞上的sLe~x糖链和血管内皮细胞上的Selectin结合。sle~x糖链合成时需要α-1,3-岩藻糖转移酶和α-2,3-二丙烯转移酶。没有使白细胞维持与Selectin的结合能力的酶。另外,α-2,3-二丙烯转移酶在很多种类的细胞中表达,因此,克隆的酶很可能成为白细胞SLe~x糖     

生物法合成达泊西汀

通过固定化青霉素G酰化酶(PGA)对(±)-N-苯乙酰基-3-氨基-3-苯基丙酸进行酶法拆分,得到合成达泊西汀的中间体(S)-3-氨基-3-苯基丙酸,(S)-3-氨基-3-苯基丙酸经过还原、甲基化、缩合等多步化学合成得到最终产物达泊西汀。(±)-N-苯乙酰基-3-氨基-3-苯基丙酸的最佳拆分条件:底物(±)-N-苯乙酰基-3-氨基-3-苯基丙酸2.83 g,固定化的青霉素酰化酶2.66 g,pH 7.5,25℃反应4 h,(S)-3-氨基-3-苯基丙酸收率为89.4%,e.e.值99.3%。达泊西汀的总收率25.5%,e.e.值96.7%。     

法夫酵母β-胡萝卜素转化酶(Asy)基因的克隆及可溶性表达研究

[目的]从高产虾青素的法夫酵母(Phaffia rhodozyma) 7B12菌株中克隆β-胡萝卜素转化酶基因(β-Carotene converting enzyme gene,asy),并将该基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行可溶性表达,为深入研究该酶的性质及应用提供基础.[方法]采用cDNA末端快速扩增技术,克隆得到asy基因全长cDNA序列,将其克隆到表达载体pET32a中,通过优化温度和IPTG浓度提高其可溶表达量;进一步在E.coli BL21(DE3)中共表达携带asy基因的重组质粒和pACCAR 16△crtx质粒(携带由乙酰辅酶A合成β-胡萝卜素的基因链),用液相色谱分析共转化菌株中类胡萝卜素种类的变化,鉴定可溶性表达的Asy酶活性.[结果]法夫酵母7B12菌株asy基因的cDNA序列与GenBank能检索到的唯一一条asy基因mRNA序列(Accession No.DQ002007.1)一致性达到97％,该序列总长1 971 bp,最大开放阅读框为1 614 bp,编码538个氨基酸,在E.coli BL21 (DE3)中表达的Asy融合蛋白分子量约为70 kD;条件优化后转化asy基因的重组菌在26℃、0.5 mmol/L IPTG的条件下诱导时,可溶性融合蛋白比例达85％.与pACCAR16△crtx单质粒转化相比,共转化pACCAR 16△crtx及asy基因的菌株类胡萝卜素产物的成分发生了明显的变化,其中α-胡萝卜素的含量明显减少,伴随出现了3种新的色素,根据出峰时间判断其中一种为β-胡萝卜素和虾青素的中间产物——β-隐黄质.[结论]从法夫酵母中克隆得到asy基因,通过优化诱导温度及IPTG浓度等条件提高了该基因在E.coli BL21(DE3)中的可溶性表达量,经鉴定可溶性的Asy融合蛋白具有转化β-胡萝卜素的活性.     

哈茨木霉A25-2纤维二糖水解酶玉基因的克隆及其编码催化功能域的序列在绿色木酶HP35-3中的表达

本研究从哈茨木霉(Trichoderma harzianum) A25-2总RNA中利用RT-PCR的方法扩增到其纤维二糖水解酶I基因的cDNA序列,并对该基因编码的氨基酸序列进行分析,得到cbhI基因中编码催化功能域的序列。将催化功能域编码序列克隆到表达载体pCP-GH中,用PEG-CaCl2介导的原生质体转化方法将重组质粒转化到绿色木霉(Trichoderma viride) HP35-3中,筛选得到12个转化子。以p-NPC为底物,测定了该12个转化子的酶活力,获得比活力最高的转化子Tv/CDHl-CBM-5,其纤维二糖水解酶活力是HP35-3的3.8倍。SDS-PAGE分析表明,绿色木霉表达了导入的含A25-2纤维二糖水解酶I催化功能域的编码序列。     

布氏锥虫自噬蛋白ATG12的表达、纯化及二级结构预测

[目的]表达纯化布氏锥虫自噬蛋白TbATG12,并对其二级结构进行预测。[方法]克隆TbATG12编码序列,采用酶切连接方法构建表达载体TbATG12(pET-28a),转化进入BL21(DE3)表达菌株诱导蛋白表达,利用Ni^(2+)-NAT亲和层析及分子筛层析方法纯化蛋白。采用核磁手段,采集一维和二维谱图,利用JPred 4预测其二级结构。[结果]16℃、0.5 mmol/L IPTG诱导20 h,TbATG12以可溶蛋白形式存在。纯化后蛋白纯度可达95%。TbATG12谱峰分布均匀,强度较强,二级结构预测其含有3个α-螺旋和5个β-折叠,为后续解析TbATG12溶液结构提供指导。[结论]克隆、表达纯化得到纯度>95%可溶TbATG12蛋白,二级结构预测和比对发现其结构在进化上很保守。