康宁木霉K801纤维素酶cbh2基因的克隆及序列分析*

通过聚合酶链式反应（PCR）技术扩增得到纤维素高产菌株康宁木霉Trichoderma kningii K801纤维二糖水解酶（CBHII）基因全序列,并克隆到pGEM-Teasy Vector。序列分析表明,所克隆的cbh2基因长1611bp,包含了纤维二糖水解酶基因的完整编码区序列,并含有三个真核生物典型的内含子序列,其中四个外显子序列共同编码一个471aa的蛋白质。该序列是国内首次克隆得到的cbh2编码区全序列,与国外报道的T. reesei已知序列的同源性达到99.89％,只有两个碱基差别,而推测的氨基酸序列只有一个位置疏水性氨基酸之间发生替代,在推测的氨基酸序列上发现3个潜在的N-糖基化位点。     

康宁木霉K801纤维素酶cbh2基因的克隆及序列分析

通过聚合酶链式反应（PCR）技术扩增得到纤维素高产菌株康宁木霉Trichoderma koeningiiK801纤维二糖水解酶（CBHII)基因全序列,并克隆p GEM-Teasy Vector。序列分析表明,所克隆的cbh2基因长1611bpq,包含了纤维二糖解酶基因的完整编码区序列,并含有三个真核生物典型的内含子序列,其中四个外显子序列共同编码一个471aa的蛋白质。该序列是国内首次克隆得到的cbh2编码区全序列,与国外报道的T.reesei已知序列的同源性达到99．89％,只有两上碱基差别,而推测的氨基酸序列只有一个位置疏水性氨基酸之间发生替代,在推测的氨基酸序列上发现3个潜在的N－糖基化位点。     

嗜热毛壳菌纤维素酶（CBHⅡ）cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum CT2是一种土壤腐生菌,可产生具有重要工业生产价值的纤维素酶类。RACE-PCR获得嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶Ⅱ（CBHⅡ）的编码基因(cbh2)。DNA序列分析表明cbh2的开放阅读框由1428个碱基组成,编码476个氨基酸。推断的氨基酸序列包含一个典型真菌纤维素酶的糖结合域（CBD）、催化域（CD）以及二者之间富含脯氨酸和羟基氨基酸的连接桥。根据氨基酸序列推算该酶分子量为53kD,属于糖苷水解酶第六家族,具有该家族催化保守区的典型特征。PCR扩增cbh2的成熟蛋白编码基因,利用基因重组的方法构建可在毕赤酵母分泌表达系统中表达纤维二糖水解酶蛋白的重组表达载体,并转化毕赤酵母得到重组子。在毕赤酵母醇氧化酶AOX1基因启动子的作用下,重组蛋白得到高效表达,小规模发酵量达1.2 mg/mL。经硫酸铵沉淀、DEAESepharose Fast flow阴离子层析等步骤纯化了该重组表达蛋白。SDS-PAGE得到重组蛋白分子量为67kD,与从嗜热毛壳菌中纯化的该酶分子量一致。该重组纤维二糖水解酶作用的最适合温度50℃,最适pH4.0,在70℃的半衰期为30min,具有较好的热稳定性。     

哈茨木霉A25-2纤维二糖水解酶玉基因的克隆及其编码催化功能域的序列在绿色木酶HP35-3中的表达

本研究从哈茨木霉(Trichoderma harzianum) A25-2总RNA中利用RT-PCR的方法扩增到其纤维二糖水解酶I基因的cDNA序列,并对该基因编码的氨基酸序列进行分析,得到cbhI基因中编码催化功能域的序列。将催化功能域编码序列克隆到表达载体pCP-GH中,用PEG-CaCl2介导的原生质体转化方法将重组质粒转化到绿色木霉(Trichoderma viride) HP35-3中,筛选得到12个转化子。以p-NPC为底物,测定了该12个转化子的酶活力,获得比活力最高的转化子Tv/CDHl-CBM-5,其纤维二糖水解酶活力是HP35-3的3.8倍。SDS-PAGE分析表明,绿色木霉表达了导入的含A25-2纤维二糖水解酶I催化功能域的编码序列。     

雅致枝霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

根据真菌△^6 -脂肪酸脱氢酶基因保守的组氨酸Ⅱ区和Ⅲ区附近保守序列设计兼并引物进行RT-PCR,得到雅致枝霉（Thamnidium elegans）As3．2806△^6 -脂肪酸脱氢酶基因459bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术（RACE）向两端延伸得到1504bp的△^6 -脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个1377bp、编码459个氨基酸的开放阅读框TED6。推测的氨基酸序列与已知其他真菌的△^6 -脂肪酸脱氧酶基因的氨基酸序列比对,具有3个组氨酸保守区、2个疏水区及N末端细胞色素b5融合区。将此编码区序列亚克隆到酿酒酵母缺陷型菌株INVSel的表达载体pYES2.0中,构建表达载体pYTED6,并在酿酒酵母INVSel中异源表达。通过气相色谱（GC）和气相色谱,质谱（GC-MS）分析表明,该序列在酿酒酵母中获得表达,产生γ-亚麻酸（GLA）的含量占酵母总脂肪酸的7．5％。证明此序列编码的蛋白能将外加的亚油酸转化为γ-亚麻酸,是一个新的有功能的△^6 -脂肪酸脱氢酶基因（GenBank．AY941161）。     

长梗木霉纤维素酶基因的克隆及序列分析

从富含纤维素环境筛选获得一株纤维素降解菌株FU05,通过形态学特征及ITS序列分析确定其为长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)。PCR扩增获得该菌株的bgl2、cbh2和eg1。序列分析表明,这3种纤维素酶基因与GenBank上其他木霉同种纤维素酶基因具有较高同源性:bgl2基因与里氏木霉bgl2基因(AB003110)同源性达91%;cbh2基因与康宁木霉cbh2基因(DQ504304)同源性达99%;eg1基因与长梗木霉eg1基因(X60652)同源性达95%。3种纤维素酶基因编码的相应氨基酸序列与其他木霉纤维素酶的氨基酸序列相似性也非常高。对上述纤维素酶基因编码的相应蛋白进行PROSITE motif search,对其N端糖基化位点、纤维素结合区、糖基水解酶家族特征结构区等进行了定位。     

甜瓜抗霜霉病基因同源序列克隆与分析

采用RT—PCR扩增的方法,从高抗霜霉病甜瓜品种‘日本安农二号’中克隆到约3kb的cDNA片段（命名为MRGH-D,该基因是一个连续的通读编码框,编码1007个氨基酸。推测的蛋白质分子量为113．7kDa,等电点为7．88,蛋白质预测无跨膜区。根据推测的氨基酸序列,该基因属于TIR—NBS—LRR类抗病基因,具有TIR-NBS—LRR类抗病基因所有的保守结构域。核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析结果显示,MRGH-J与甜瓜抗病基因的同源序列MRGHl2及抗霜霉病相关基因mp-19均具有高达99％的同源性,推测该基因可能在甜瓜抗霜霉病中起作用。     

两个棉花Rac蛋白基因的克隆与表达分析

为研究棉花纤维起始和伸长的分子机理,在棉花纤维EST序列分析的基础上,从棉花纤维中扩增并克隆了2个棉花Rac蛋白的cDNA基因,分别命名为GhRacA和GhRacB。GhRacA cDNA长959bp,推测的编码蛋白包含211个氨基酸。GhRacB cDNA长920bp,编码195个氨基酸的蛋白。GhRacA和GhRacB蛋白均含有GTP／GDP结合和激活区域、Effector区和碱性氨基酸区。GhRacB的C末端有保守的异戊烯基化位点CSIL,而GhRacA没有明显的异戊烯基化位点。序列比较分析表明,GhRacA和GhRacB是2个新的棉花Rac蛋白。RT-PCR分析表明,GhRacA和GhRacB在根、下胚轴、茎、叶和纤维中都有表达,但均在棉花纤维起始和伸长时期有优势表达,推测2个基因在棉花纤维的早期发育中可能有重要的功能。     

人类TECTB基因的电子克隆

用小鼠和鸡的β-tectorin基因（Tectb)的编码区序列对NCBI数据库进行Blastn比较,得到一个相似性很高的人的gDNA序列（GenBank:AL157786),用GENSCAN、MZEF程序和Blast 2 sequence程序分析AL157786,推测AL157786中包含一个编码区由10个外显子构成的基因－TECTB基因。人TECTB基因的开放阅读框为990bp,推测编码329个氨基酸。人TECTB基因与小鼠的Tectb基因在900bp有88.1%的一致性,在329个氨基酸有94.2%的一致性。用Electronic-PCR将人TECTB基因定位于10q25。     

棕色棉F3'H-羟化酶基因的克隆与生物信息学分析

根据葡萄的类黄酮3′-羟化酶(F3'H)基因全长cDNA序列Blast所得棉花的EST序列设计引物,以开花后16 d(DPA16)的新彩棉5号(xC-5)纤维为材料,利用RACE和RT-PCR技术分离得到了2个类黄酮3′-羟化酶基因cDNA序列,此2个序列编码区完全相同,仅在3'UTR区存在片段长短的差异,推测可能是基因转录后加工方式不同所造成.克隆所获得的棉花F3'H基因编码区全长1 533 bp,编码510个氨基酸,氨基酸序列分析预测表明,该基因所编码蛋白含有一个跨膜结构域,是一种分泌蛋白,定位于内质网上,并含有一段与细胞色素P450功能区相匹配的保守功能域;序列比对结果表明,棉花F3'H基因与其他多个物种的F3'H基因在氨基酸序列上有较高的同源性;聚类分析结果表明,棉花F3'H蛋白与双子叶植物大豆的F3'H亲缘关系较为接近,而与单子叶植物高梁等作物则较远.     

纤维二糖水解酶I基因的系统进化分析

纤维二糖水解酶I（CBHI）是生物降解纤维素的一种重要的外切酶,它作用于纤维素分子末端,水解β-1,4-糖苷键。纤维二糖水解酶由3个部分组成：具有催化活性的催化结构域,作用为锚定纤维素的纤维素结合域以及连接这两个结构域的一段短肽。已知催化结构域属于糖基水解酶家族7（GH7）,纤维素结合域属于糖类结合模块家族1（CBMl）。为进一步探索CBHI编码基因之间的进化关系,本研究依据CBHI的结构域在GenBank数据库中搜索并鉴定CBHI编码基因并据此构建系统发育树。序列的平均长度为1776bp,平均GC含量为57．64％,平均转换颠换比为0．71,平均遗传距离为0．424。得出结论CBHI编码基因只存在于真菌中,是一个相对活跃的基因,它的进化与物种的进化有着密切的关系。     

双烯内酯水解酶基因的克隆和序列分析*

从土壤中分离到一株降解2,4-二氯酚能力较强的假单胞菌菌株GT241-1,从中克隆出参与降解2,4-二氯酚的双烯内酯水解酶基因(dcpD)。该基因编码的双烯内酯水解酶可将顺式-2-氯双烯内酯水解成2-氯马来乙酸。采用的基因克隆策略是用Southem杂交对其邻近基因进行定位后构建基因组库,再用斑点杂交筛选目的转化子。经序列测定得知dcpD基因编码区702bp。核苷酸和推测编码的氨基酸序列分析表明,dcpD与已在GenBank登记的相关基因有一定的差异。     

甜菜ATP合酶β亚基基因atpB的克隆、序列分析及进化

atpB基因编码ATP合酶β亚基,是光合作用中的重要基因。ATP合酶是生物体内能量代谢的关键酶,参与氧化磷酸化和光合磷酸化反应。利用植物叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点,根据已知植物烟草、水稻和菠菜等的叶绿体基因组全序列,设计并合成了一对引物,以甜菜叶绿体DNA为模板,PCR扩增得到包含atpB 完整基因（GenBank登录号为 DQ067451）在内的一段序列,测序与序列分析表明：该克隆片段全长2 293 bp,其中包括有1 497 bp的编码区序列,推测编码498个氨基酸。同源性比较,该克隆基因与烟草、菠菜、油菜、水稻atpB基因的核苷酸序列同源性分别为90.92%、95.79%、87.71%和86.37%,推测的氨基酸序列同源性分别为94.58%、97.19%、92.17%和91.97%。同时,建立了几种植物的氨基酸序列系统进化树。     

黑曲霉纤维二糖水解酶基因cbhA在毕赤酵母中异源表达

[目的]对黑曲霉纤维二糖水解酶cbhA基因进行了克隆和在毕赤酵母中的真核表达。[方法]采用PCR方法扩增黑曲霉纤维二糖水解酶A(Cellobiohydrolase A,CBHA)基因,获得的DNA序列与cbhA基因表现出高度相似,推导出的氨基酸序列与真菌CBHA酶也高度相似,属于糖基水解酶第7家族。将扩增得到的cbhA基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,与α-因子信号肽序列形成融合蛋白,进一步通过电转化方法将线性化质粒p PIC9K-cbhA转化至毕赤酵母GS115菌株进行表达。[结果]在甲醇诱导下,重组菌株CMC比酶活力是对照的2.5倍,SDS-PAGE分析结果也确认了cbhA基因在重组菌株GS115/p PIC9K-cbhA中的表达。对该酶性质的分析表明,重组CBHA酶水解CMC底物最适p H值为5.0,最适温度为55℃。[结论]黑曲霉纤维二糖水解酶基因cbhA的克隆和其真核表达工程菌株的构建,为获得纤维二糖水解酶A高产菌株,实现纤维素酶多组分的人工组装奠定了基础。     

里氏木霉不同糖苷水解酶基因转录水平比较分析

以前期里氏木霉RNA-seq中发现的7个糖苷水解酶基因为对象,分析其不同条件下的表达特性,以期为寻找新的纤维素降解功能酶提供证据。运用生物信息学方法,分析了7个基因可能的编码产物和结构特征。以不同的产纤维素酶菌株（QM 9414、RUT C30）为材料,采用实时荧光定量PCR,对7个糖苷水解酶基因（编号4–10）在各种碳源条件下转录情况与主要的3个纤维素酶基因cbh1,cbh2,egl1（编号1–3）进行了比较分析。信息学分析表明,7个基因编码蛋白分属于GH47（4号、5号）,GH92（6–8号）,GH16（9号）,GH31（10号）糖苷水解酶家族,具有典型的信号肽序列。cbh1,cbh2,egl1基因在纤维素酶诱导条件下,转录水平均表现显著的增加,上调倍数以QM 9414菌株表现的最高。QM 9414菌株中,cbh1,cbh2,egl1基因在纤维素条件下的上调倍数显著高于乳糖,3个基因在RUT C30菌株中的转录水平则显示乳糖条件下上调幅度更大。7个糖苷水解酶基因也存在类似的情况,而且编码α-甘露糖苷酶和内切β-葡聚糖酶的8号、9号基因上调倍数在纤维素酶诱导条件下仅次于纤维素酶基因,而以甘油为碳源条件下,8号、9号基因上调倍数高于纤维素酶基因。4号基因在上述碳源条件下,转录水平变化不大。结果表明：4号基因可能是组成型表达。基因5、6、7、8、9、10的表达呈现明显的菌株和碳源依赖性,且在纤维素酶诱导条件下基本上是和3个纤维素酶基因共转录的。     

球毛壳菌（Chaetomium globosum）过氧化物膜蛋白过敏原基因克隆、序列分析及原核表达

以球毛壳菌cDNA文库中获得过氧化物膜蛋白（pero）基因片段（GenBank Accn:BP099709）为基础,用RACE 技术获得该基因的全长cDNA序列。序列长747bp,由412bp的3′RACE产物和508bp的5′RACE产物拼接而成。开放阅读框501bp,编码166个氨基酸,蛋白分子量为17.5kD,理论等电点为5.75。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA序列,序列分析表明该基因由2个内含子和3个外显子组成。ClustalX多序列比对表明：该基因与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的过氧化物膜蛋白过敏原同源性最高（83%）。将pero基因编码区克隆到原核表达载体pET28a中,构建成表达质粒pET28a-pero并转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况,结果发现在21kD处有一特异性融合蛋白带,大小与预期相符,说明该基因已经在大肠杆菌中表达。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY555771,AY584753,AAS66898)。     

里氏木霉双基因同步缺失菌株的构建与甘露聚糖酶表达研究

在里氏木霉中建立了一个快速的双基因位点同步同源重组新方法,较好解决了里氏木霉基因逐个敲除周期长等问题。研究以里氏木霉自身甘露聚糖酶基因（man5A）为重组表达的报告基因,通过一步转化,将该基因定点整合入纤维二糖水解酶Ⅰ（cbh1）基因位点,同时缺失主要的两个纤维素酶基因（cbh1、cbh2）,得到重组工程菌Man12。将重组工程菌Man12与出发菌株Tu6Δku70进行摇瓶发酵,结果显示,重组菌株的甘露聚糖酶产量比出发菌株提高10倍,而纤维素酶产量降低了60%,胞外总蛋白分泌水平降低了40%。Real-time PCR检测甘露聚糖酶基因（man5A）的转录水平,发现重组菌株较出发菌株提高了25倍。在里氏木霉中首次报道了通过一步转化实现两个基因同步定点整合的方法,对利用基因工程手段构建高效表达重组蛋白的里氏木霉工程菌株具有一定的指导意义。     

苏云金芽孢杆菌chiA,chiB全基因的克隆、表达及其序列分析

以苏云金芽孢杆菌科默尔亚种15A3菌株基因组DNA为模版,用touchdown PCR方法扩增几丁质酶ChiA和ChiB的全基因序列(GenBank登录号:EF103273和DQ512474)。将PCR产物连接pUCm-T克隆载体,获得重组质粒pUCm-chiA和pUCm-chiB,分别转化E.coliXL-Blue。克隆的几丁质酶基因可以利用本身的启动子异源表达各自的蛋白,不需要几丁质作为诱导物。表达的几丁质酶能够分泌到胞外。证明15A3菌株可组成型表达2种几丁质酶。经核苷酸及氨基酸序列分析证明,chiA基因全长1426bp,含有343bp的上游非编码区和1083bp的ORF,编码360个氨基酸。推测成熟蛋白分子量为36kD,只有一个几丁质酶催化域。chiB基因全长2279bp,含有248bp的上游非编码区和2031bp的ORF,编码676个氨基酸。推测成熟蛋白分子量约为70.6kD,具有三个功能域。核苷酸序列分析显示chiA和chiB的启动子所处的位置及转录起始碱基都不相同,-35区相同,而-10区有两个碱基不同,SD序列也不完全一致。     

黑曲霉木聚糖酶Xyn43A基因的克隆和生物信息学分析

[目的]克隆黑曲霉木聚糖酶(Xyn43A)基因,进一步对其进行生物信息学分析。[方法]利用3'RACE与5'RACE技术,克隆Xyn43A全长cDNA序列,扩增Xyn43A的DNA序列,并进行序列分析。[结果]cDNA全长1152bp(不含Poly(A)),包含一个957bp开放阅读框,编码信号肽19个氨基酸,成熟肽299个氨基酸,5'与3'非编码区分别为113bp、82bp。预测该蛋白相对分子量为33.47kDa,等电点为4.55。该序列含一个长度为86bp的内含子。Xyn43A为亲水性稳定蛋白,有4个N-糖基化位点,26个磷酸化位点。与GH43族木聚糖酶亲缘性较近,具有GH43族糖基水解酶典型的5叶片螺旋桨结构。[结论]克隆了一个新的木聚糖酶基因,属于GH43族糖基水解酶。     

红纹黄单胞菌a-氨基酸酯水解酶的克隆、序列分析及热稳定性提高

【目的】克隆红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶基因全序列,对序列进行生物信息学分析,并提高酶的热稳定性。【方法】利用多聚酶链式反应(PCR)克隆α-氨基酸酯水解酶基因全序列;应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过同源建模,预测红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的三维结构;通过定点突变替换氨基酸序列中高度柔性的位点,提高该酶的热稳定性。【结果】从红纹黄单胞菌(Xanthomonas rubrillineans)中扩增得到α-氨基酸酯水解酶基因aeh(GenBank登录号JF744990),核苷酸序列长度1 917 bp,编码638个氨基酸。序列比对和同源性分析显示,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str.GPE PC73的肽酶及地毯草黄单胞菌Xanthomonas axono-podis pv. citri str. 306的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶氨基酸序列相似性最高,分别为91%和83%,系统进化分析表明,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str. GPEPC73的肽酶亲缘性最高。基于预测的三维模型,对高度柔性的位点进行饱和突变,从282株突变体中筛选得到3株T50较野生型高5°C以上的突变体。【结论】对红纹黄单胞菌AEH的氨基酸序列分析有助于探索同源蛋白的进化过程。对高度柔性位点进行饱和突变的策略可以用于提高热稳定性。