鲤鱼肥胖基因的分子克隆及在大肠杆菌中的表达

为了研究鲤鱼肥胖基因的结构特点和体外表达产物的生物学活性 ,利用RT PCR技术从鲤鱼肠系膜脂肪组织中扩增出鲤鱼肥胖基因的cDNA编码序列 ,分析表明该cDNA序列由 4 38个核苷酸组成 ,编码 14 6个氨基酸组成的多肽 ,鲤鱼肥胖基因与人、猪、鼠的相比 ,核苷酸同源性分别为 :84 %、 86 %、 95 % ;氨基酸的同源性分别为 84 %、 82 %、 96 %。构建了原核表达载体 pET 2 8a li,利用IPTG在大肠杆菌中进行了诱导表达 ,并对表达产物进行了初步纯化和生物活性检测 ,结果表明 ,鲤鱼肥胖基因在大肠杆菌中进行了高效特异性融合表达 ,融合蛋白质分子量约为 2 0kD ,经薄层扫描分析 ,目的蛋白占菌体总蛋白的 2 0 3%。表达产物经过纯化和复性能够明显抑制小鼠的摄食和生长 ,说明表达产物Leptin具有明显的生物学活性     

猪肥胖基因在大肠杆菌中的高效融合表达

采用PCR方法扩增猪肥胖基因编码原成熟蛋白cDNA序列,并在5′端加上BamHⅠ位点,3′端加上EoRⅠ位点,将5′端密码子CCC转变为大肠杆菌常见密码子CCG,扩增得到459bp的片段,克隆于融合表达载体p GEX-2TBamHⅠ和EcoRⅠ位点,酶切、测序正确,经0．1mmol/LIPTG诱导表达出一条约42kD的融合蛋白,其中26kD为pGEX-2T中带有的谷胱苷肽转移酶,16kD是猪肥胖基因表达产物瘦蛋白。利用非融合表达产品制备抗血清,检测融合表达的重组蛋白,Western-blot为阳性。     

肥胖基因的分离及其在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术自外周血白细胞染色体DNA中扩增获取了肥胖基因(ob基因)的外显子2和3序列.经过拼接,获得了全长的ob基因编码序列. 测序结果表明,获得的序列与文献报道完全一致.利用PCR技术扩增出成熟蛋白的编码序列,克隆至表达载体pBV220中获得了表达菌株,并对表达产物进行了初步纯化,为进一步研究ob基因产物的功能与应用奠定了基础.     

鲤鱼中Sox9b基因的克隆和表达

Sox9基因是一个重要的转录调控因子,参与性别决定及软骨等多种组织和器官的发育过程。本研究利用简并引物扩增鲤鱼基因组DNA,首次发现在鲤鱼中存在两种形式的Sox9基因。二者在保守盒区编码的氨基酸序列相同,并都存在一个内含子,但内含子序列差异很大,分别长704bp和616bp。在此基础上采用RACE技术克隆了鲤鱼Sox9b基因的5’端和3’端,通过拼接获得了2447bp的全长cDNA序列。编码428个氨基酸。其中96—174位共79个氨基酸为HMG保守盒。将鲤鱼Sox9b基因与三刺鱼等九种动物的氨基酸序列相比较发现。它们的同源性高达75％以上,显示soz9基因在进化中较保守。应用半定量RT—PCR技术对成体鲤鱼不同组织中Sox9b基因的表达进行了分析。结果表明该基因广泛表达,尤以脑及精巢中表达最为丰富。     

鲤鱼生长激素基因的改造及其在大肠杆菌中的表达

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）改造了锂鱼生长激素基因,扩增出编码锂鱼生长激素成熟肽的序列,并将此序列克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ⅱ ＫＳ质粒中,序列分析后,亚克隆到大肠杆菌表达载体ｐＢＶ２２０中。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层扫描,结果表明锂鱼生长激素基因已大肠杆菌中获得表达。锂鱼生长激素成熟肽的分子量为２２０００道尔顿,表达率占细胞总蛋白的１８％以上％。     

鲤鱼生长激素基因在鲫鱼中的基因转移及PCR检测

鲫鱼群体内,个体之间的生长速度差别不大,遗传保守性较强,用常规育种方法很难获得生长速度快、个体差异较大的后代。通过基因转移技术,将外源基因如鱼的生长激素基因导入鱼的受精卵中,而获得转基因鱼是钱定向育种的一条有效途径。已有报道,在虹鳟鱼生长激素cDNA上游连结一个病毒启动子构建成表达质粒,由此获得的转基因鲤鱼比对照生长速度快20％。但是未见有将鲤鱼生长激素基因导入鲫鱼受精卵的报导。我们克隆了鲤鱼生长激素基因,并用它构建了含有病毒启动子（F.1,插入0．8Kb,位于XbaI和PstI之间)的表达质粒（Fig.2,命名为pCMV－TK－CGH）。用该质粒对鲫鱼受精卵进行注射,注射了1000粒卵,获得了转基因实验鲫鱼480尾。孵化率为48％。将其中100尾幼鱼于水簇箱中进行放养。选择其中个体较大的50尾进行PCR检测。其中8条鱼的基因组DNA有0．6Kb的PCR扩增产物（Fig.3),表明其上整合有外源的鲤鱼生长激素基因,其整合率为16％。其中最大的一条体重4．2g,体和6cm,比对照（0．7g,4cm）体重增加5倍,体长增加2cm(Fig.4)。我们构建的是高效表达质粒,其上含有巨细胞病毒增强子和人单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子（属强启动子）,对鲤鱼生长激素基因有较强的启动作用。鲤鱼和鲫鱼在分类上属同科不同属,考虑到两者生长激素基因有较强的启动作用。鲤鱼和鲫鱼在分类上属同科不同属,考虑到两者生长激素基因的同源性,对转基因鲫鱼的PCR检测参照了加拿大学者Du所用引物的设计、使注射的外源基因与其本身的内源生长激素基因相区别。我们的转基因整合率（16％）与Zhang(10%)、Grass和Hackett等报道的接近。转基因鲫鱼生长速度增加的倍数（5倍）与Du等人的结果（2－6）接近。但是,这一生长速度快的优势能否遗传给后代,有待进一步观察。     

中国人肥胖基因真核表达载体的构建

为研究肥胖（ｏｂｅｓｉｔｙ）的病因及肥胖基因（ｏｂ）的表达与调控,根据文献报道的ｈｏｂ序列设计引物,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增中国人的ｏｂ基因（包括信号肽在内的ｃＤＮＡ全长５４０ｂｐ）,ＰＣＲ产物采用Ｔ－Ａ克隆法首先连接到克隆载体ｐＵＣ１１９,然后定向转移到经改造的真核表达载体ｐＳＶ－β－ｌａｃＺ,酶谱分析表达克隆基因为的人肥胖基因。     

鲤鱼硒蛋白W基因的克隆、序列分析及其组织表达

硒蛋白是一类含有硒代半胱氨酸(Selenocysteine,Sec)的蛋白质,具有抗氧化和免疫调节等多种生物学功能。尽管目前已知硒对鱼类生长发育、抗氧化和免疫等方面有着重要的作用,但是有关鱼类硒蛋白的研究还不全面,特别是对鱼类硒蛋白W(Selenoprotein W,Sel W)的结构和功能还知之甚少。为了深入研究鱼类硒蛋白的结构特征和生理作用,本文利用RT-PCR和RACE技术从肝胰脏中克隆获得了鲤鱼Cyprinus carpio Sel W的c DNA全长序列(cc Sel W)。cc Sel W c DNA全长704 bp,含有261 bp的开放阅读框,编码86个氨基酸。预测的cc Sel W分子量为9.5 k D,在其N-端含有特征序列C-X-X-U基序,且第13位氨基酸为13Sec。在cc Sel W c DNA 3'-UTR区域含有一个89 bp的Sec插入序列(Sec-insertion sequence,SECIS),形成经典的AUGA-AA-GA型SECIS。由于在其SECIS二级结构的顶环上有一个额外的小茎-环结构,所以鲤鱼SECIS属于Ⅱ型SECIS结构。cc Sel W与斑马鱼Danio rerio和热带爪蟾Xenopus tropicalis的同源性最高,均为84.7%,与其他物种的同源性在54%~60%之间。系统发育树结果显示,cc Sel W和斑马鱼、两栖类位于同一分支上。RT-PCR结果显示,cc Sel W mRNA在所检测的11个组织中均有表达,其中以精巢中的表达量为最高,下丘脑和肠中表达量次之,其余组织中表达量大致相当,低于精巢、下丘脑和肠。这些结果丰富了鱼类Sel W的研究内容,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

羊驼显性白毛调控KIT基因的分子克隆及在大肠杆菌中的表达

为研究羊驼显性白毛调控基因的结构特点及体外表达产物的生物活性,利用RT-PCR技术,首次从羊驼皮肤组织中扩增出羊驼KIT基因exon10-14 cDNA编码序列。结果表明:羊驼KIT基因exon10-14 cDNA长414bp,包括30 bp的exon10、127 bp的exon11、125 bp的exon12、91 bp的exon13和41 bp的exon14(全长151 bp),编码含138个氨基酸残基的蛋白;羊驼与牛、羊、猪、人、马等相比,核苷酸的同源性分别为94%、93%、93%、92%、92%,氨基酸的同源性均大于97%。构建了原核表达载体pET-32a( )-KIT,转化大肠杆菌DH5α,在异丙基硫代半乳糖苷诱导下表达KIT蛋白。结果表明:羊驼KIT基因在大肠杆菌中进行了高效特异性融合表达,融合蛋白分子量约为36 kD,目的蛋白约占菌体总蛋白的20%。     

Molecular cloning of the common carp (Cyprinus carpio) rhodopsin cDNA

A recombinant phage clone containing a 1584 nucleotides rhodopsin cDNA was screened from a carp retinal cDNA library. The inserted DNA consisting of a single open reading frame of 1062 nucleotides at positions 72 to 1133 encodes a 354 amino acid polypeptide. The deduced amino acid sequence of carp rhodopsin showed 95.7, 85.5 and 74.4% identity with that of goldfish, sand goby and lamprey, respectively. The sites of palmitoylation, glycosylation, disulfide bond formation and Schiff base formation in the putative rhodopsin are all conserved.     

鲤TYK2基因的克隆鉴定及组织表达分析

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Molecular characterization of cathepsin L from hepatopancreas of the carp Cyprinus carpio

Purified cathepsin L from carp, Cyprinus carpio, consists of a 28 kDa single-chain form that is different from the 24 and 5 kDa mammalian two-chain form. We cloned cathepsin L from carp hepatopancreas. The sequence consisted of a 1490 bp cDNA and a 1014 bp open reading frame, encoding a deduced protein of 337 amino acids that is likely processed to an active enzyme (single-chain form) with 222 amino acids. Its similarity to other types of vertebrate cathepsin L is less than 69%. Mammalian cathepsin L is further processed to a two-chain form, but possibly this is not the case with carp cathepsin L: the P1 site where cleavage occurred in the two-chain form of mammalian cathepsin L contains a serine, while carp cathepsin L processes a valine. Therefore, carp cathepsin L may have a different mechanism of action from mammalian cathepsin L.     

Molecular cloning and expression in E. coli of a Salmonella typhi porin gene

Immunoscreening of a Salmonella typhi cosmid library in E. coli allowed the detection of clones producing a 36 kDa porin from S. typhi. The gene is efficiently expressed in an E. coli porin-less mutant and the protein is exported to the outer membrane envelope. Two clones which markedly differ in their level of expression have been isolated.     

Molecular cloning of a xylanase gene from Bacteroides succinogenes and its expression in Escherichia coli.

A gene coding for xylanase synthesis in Bacteroides succinogenes was isolated by cloning, with Escherichia coli HB101 as the host. After partial digestion of B. succinogenes DNA with Sau3A, fragments were ligated into the BamHI site of pBR322 and transformed into E. coli HB101. Of 14,000 colonies screened, 4 produced clear halos on Remazol brilliant blue-xylan agar. Plasmids from two stable clones recovered exhibited identical restriction enzyme patterns, with the same 9.4-kilobase-pair (kbp) insert. The plasmid was designated pBX1. After subcloning of restriction enzyme fragments, a 3-kbp fragment was found to code for xylanase activity in either orientation when inserted into pUC18 and pUC19. The original clone possessed approximately 10-fold higher xylanase activity than did clones harboring the 3-kbp insert in pUC18, pUC19, or pBR322. The enzyme was partially secreted into the periplasmic space of E. coli. The periplasmic enzyme of the BX1 clone had 2% of the activity on carboxymethyl cellulose and less than 0.2% of the activity on p-nitrophenyl xyloside and a range of other substrates that it exhibited on xylan. The xylanase gene was not subject to catabolite repression by glucose or induction by either xylan or xylose. The xylanase activity migrated as a single broad band on nondenaturing polyacrylamide gels. The Km of the pBX1-encoded enzyme was 0.22% (wt/vol) of xylan, which was similar to that for the xylanase activity in an extracellular enzyme preparation from B. succinogenes. Based on these data it appears that the xylanase gene expressed in E. coli is fully functional and codes for an enzyme with properties similar to the B. succinogenes enzyme(s).