草鱼生长激素单抗免疫亲和柱的制备及初步应用

用纯化的草鱼生长激素单克隆抗体联剂ＣＮＢｒ活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ凝胶上制成约１０ｍｌ的亲和层析柱,用该柱一步纯化了重组鲤鱼生长激素基因的表达产物。偶联有１３．６５ｍｇ单克隆抗体的亲和柱一次强纯化得到约０．７ｍｇ重组鲤鱼生长激素。酶联免疫受体测定表明它具有强烈的生物学活性,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明它为一蛋白带,分子量约为２２０００。     

抗牛生长激素单克隆抗体及其免疫亲和吸附柱的制备

我们用杂交瘤技术获得了分秘抗牛生长激素单克隆抗体的细胞系(4B-2)。接种此细胞于小鼠所产生腹水的抗体含量达10mg／ml。经免疫亲和层析方法纯化的单克隆抗体,属1BG1型。将单克隆抗体偶联到Sepharose 4B上,创成了免疫亲和吸附柱,可以从牛垂体匀浆中一步纯化牛生长激素。偶联有50mg单克隆抗体的亲和柱一次可结合3mg牛生长激素。经单克隆抗体亲和层析纯化的牛生长激豢,保持了与兔肝细胞膜受体结合的能力,及在去垂体大白鼠中促进胫骨生长板生长的功能。     

鲤鱼（Cyprinus carpio）血清生长激素变化的酶联免疫吸附测定

本研究的目标是纯化鲤（Cyprinus carpio）生长激素,用于制备抗鲤鱼生长激素的单克隆抗体,建立鲤鱼生长激素的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA）技术,并用所建立的技术检测不同环境下养殖的鲤鱼的血清生长激素水平的变化．利用柱纯化技术纯化酵母表达草（Ctenopharyngodon idella）生长激素,免疫新西兰白兔（Oryctolagus cuniculus）,获得抗草鱼生长激素多克隆抗体．摘取鲤鱼垂体,从中提取生长激素,经层析纯化后,以变性聚丙烯凝胶电泳判断其分子量和纯度,并利用抗草鱼生长激素多克隆抗体以Western blot验证．纯化并经鉴定的鲤鱼生长激素作为免疫原被用于B淋巴细胞杂交瘤技术．共建立14株能够稳定分泌抗鲤鱼生长激素单克隆抗体的杂交瘤细胞系（FMU-cGH1-FMU-cGH14）,其中8个克隆（FMU．cGH1～FMU-cGH6,FMU-cGH12和FMU-cGH13）成功用于Western blot分析,9个克隆（FMU-cGHl-FMU-cGH7,FMU-cGH9和FMU-cGH10）可用于荧光标记和免疫组织化学分析．利用竞争性ELISA进行表位分析,结果表明这些单克隆抗体能够识别5个不同的表位．利用其中的FMU-cGH12作为包被抗体,FMU-cGH6作酶标抗体,建立了能够检测鲤鱼生长激素含量的ELISA技术．这一检测系统被证明具有高度的稳定性和灵敏度,能够检测并定量低至70pg／mL的生长激素．利用这一检测技术,发现限制进食和网箱养殖的鲤鱼其生长激素含量都有明显提高,分别为对照的6．9和5．8倍,显示不同生长环境下鲤鱼生长激素水平具有不同的反应．     

草鱼生长激素非竞争式酶联免疫吸附测定法的建立及鉴定

应用草鱼生长激素（ｇｃＧＨ）单克隆抗体及多价兔抗血清建立了草鱼ＧＨ非竞争式酶’联免疫吸附测定ＥＬＩＳＡ系统。用正辛酸法对腹水单抗进行了分离纯化,获得了高纯度的单抗制备物。聚丙烯酸胺凝胶电泳表明纯化的单抗由分子量分别为５５ｋＤ和２５ｋＤ的两条蛋白带组成。用纯化单抗铺底,用兔抗血清作后续抗体建立了一种测定草鱼ＧＨ的非竞争式双抗夹心ＥＬＩＳＡ方法。交叉试验表明该测定系统只与草鱼ＧＨ和基因重组鲤生长激素（ｒｃＧＨ）具有剂量依存的结合反应,而与大马哈鱼生长激素（ｓＧＨ）、牛生长激素（ｂＧＨ）、大马哈鱼促性腺激素（ｓＧｔＨ）、及黑鲢促性腺激素（ｂｓｃＧｔＨ）等均无交叉反应。该 ＥＬＩＳＡ方法的灵敏度可达０．８ｎｇ／ｍｌ,组内变异系数为 ５．９ ％,组间变异系数为７．６％,回收率达９０％以上。初步应用表明,鲤和团头鲂垂体抽提液、草鱼血清、鲤血清及鲫血清在该测定系统中有剂量依存的反应曲线,而大口鲶、黄颡鱼、中华鲟及黄鳝鱼垂体抽提液及大口鲶、胡子鲶和罗非鱼血清在该测定系统中没有交叉反应。     

分泌型重组人生长激素工程菌发酵及其产物纯化

在 5L发酵罐中将工程菌pET-ompA3-hGH/BL21(DE3)进行补料式发酵 ,诱导表达分泌型重组人生长激素。通过对发酵培养基成分、补料成分、补料体积、补料时机和滴加流速的选择 ,分泌表达rhGH的量可达到 250mg/L ,占周质蛋白的 44%～ 54% ,发酵周期缩短为8h。用rhGH纯蛋白免疫动物制备的多克隆抗体制成的抗体亲和层析柱 ,一步纯化大肠杆菌周质中分泌表达的rhGH ,产物纯度达到96%以上 ,纯化产物在分子质量大小、免疫活性和二硫键的形成与天然生长激素相一致 。     

杆状病毒重组蛋白金鱼生长激素I的纯化

利用放射免疫分析（ＲＩＡ）证实了含金鱼生长激素Ｉ ｃＤＮＡ的重组病毒在感染细胞９６ｈ后所表达的生长激素达到最高水平,平均每１０＾５个细胞可分泌金鱼生长激素Ｉ最高达２８８．０７ｎｇ;平均每克干虫可产生金鱼生长激素Ｉ９２５．３μｇ。从感染重组病毒的无血清细胞培养基中纯化生长激素Ｉ,平均每毫升培养基可纯化具免疫活性纯度９５％以上的金鱼生长激素Ｉ达６６４．２２４ｎｇ。纯化后蛋白的Ｎ－末端首２０个氨基酸序列     

猪生长激素及其单克隆抗体的制备与纯化

本文介绍一种简便快捷提纯猪生长激素的方法。通过杂交瘤技术,首次获得抗猪生长激素的单克隆抗体,并讨论和比较从腹水纯化单克隆抗体的各种方法。     

饥饿状态下转基因鲤鱼和对照鲤鱼血清生长激素的表达研究

研究采用酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)技术,比较分析了转GH基因鲤鱼和对照鲤鱼在饥饿和饱食状态下血清生长激素水平的变化规律,并探讨其可能机制.实验结果表明,在投喂实验中,转基因鲤鱼和对照鲤鱼血清生长激素水平均无明显变化,但转基因鲤鱼血清生长激素远高于对照鲤鱼,分别为(142.0±4.9)ng/mL和(1.6±0.2)ng/mL,转基因鲤鱼体重增长速率显著高于对照鱼.在饥饿实验中,转基因鲤鱼的血清生长激素迅速下降,从(142.0±4.9)ng/mL降至(46.0±3.2)ng/mL,而后稳定在这一较低水平;对照鲤鱼血清生长激素持续卜升,从(1.6±0.2)ng/mL升至(10.9±1.4)ng/mL,体重负增长速率没有显著差异.研究结果提示,转GH基因鲤鱼血清生长激素的调控机制与对照鲤鱼的不同,其表达水平不受脑垂体反馈抑制调控机制的影响,而与重组GH基因中β-actin基因启动子的调控模式相关.     

鲤鱼生长激素基因在鲫鱼中的基因转移及PCR检测

鲫鱼群体内,个体之间的生长速度差别不大,遗传保守性较强,用常规育种方法很难获得生长速度快、个体差异较大的后代。通过基因转移技术,将外源基因如鱼的生长激素基因导入鱼的受精卵中,而获得转基因鱼是钱定向育种的一条有效途径。已有报道,在虹鳟鱼生长激素cDNA上游连结一个病毒启动子构建成表达质粒,由此获得的转基因鲤鱼比对照生长速度快20％。但是未见有将鲤鱼生长激素基因导入鲫鱼受精卵的报导。我们克隆了鲤鱼生长激素基因,并用它构建了含有病毒启动子（F.1,插入0．8Kb,位于XbaI和PstI之间)的表达质粒（Fig.2,命名为pCMV－TK－CGH）。用该质粒对鲫鱼受精卵进行注射,注射了1000粒卵,获得了转基因实验鲫鱼480尾。孵化率为48％。将其中100尾幼鱼于水簇箱中进行放养。选择其中个体较大的50尾进行PCR检测。其中8条鱼的基因组DNA有0．6Kb的PCR扩增产物（Fig.3),表明其上整合有外源的鲤鱼生长激素基因,其整合率为16％。其中最大的一条体重4．2g,体和6cm,比对照（0．7g,4cm）体重增加5倍,体长增加2cm(Fig.4)。我们构建的是高效表达质粒,其上含有巨细胞病毒增强子和人单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子（属强启动子）,对鲤鱼生长激素基因有较强的启动作用。鲤鱼和鲫鱼在分类上属同科不同属,考虑到两者生长激素基因有较强的启动作用。鲤鱼和鲫鱼在分类上属同科不同属,考虑到两者生长激素基因的同源性,对转基因鲫鱼的PCR检测参照了加拿大学者Du所用引物的设计、使注射的外源基因与其本身的内源生长激素基因相区别。我们的转基因整合率（16％）与Zhang(10%)、Grass和Hackett等报道的接近。转基因鲫鱼生长速度增加的倍数（5倍）与Du等人的结果（2－6）接近。但是,这一生长速度快的优势能否遗传给后代,有待进一步观察。     

人工合成草鱼生长激素cDNA在大肠杆菌中的表达

经密码子优化的人工合成草鱼生长激素cDNA与表达载体pET-28a( )重组,构建重组表达质粒PET－GH。转化在肠杆菌BL21（DE3）,筛选阳性克隆,IPTG诱导表达,12．5％的SDS－PAGE分析显示,大肠杆菌表达产物中含有与草鱼生长激素分子量一致的新增蛋白带,激光密度扫描,其产量约占菌体总蛋白的40％,金属离子螯合层析柱亲和纯化,获得电泳纯的重组蛋白。Western-blotting和酶联免疫吸附受体法检测证实,重组蛋白与抗草鱼生长激素的多克隆抗体发生特异性结合;复性合的重组蛋白有与天然草鱼生长激素一致的生物学活性。     

青鱼生长激素的重组表达及其多克隆抗体的制备

以含有的青鱼生长激素编码区cDNA的重组质粒pbcGHc为模板,高保真PCR扩增青鱼生长激素（GH）成熟肽cDNA序列,定向插入原核表达载体pET-28a,构建青鱼GH原核表达质粒pET-bcGH。将pET-bcGH转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导青鱼GH基因在大肠杆菌中的融合表达,SDS-PAGE凝胶电泳结果显示一条23 kDa的诱导表达重组青鱼GH带。以草鱼GH多克隆抗体为一抗,Western Blot证明,该重组青鱼GH具有免疫学活性。将经过亲和层析、透析纯化后的重组青鱼GH作为抗原,采用改进的方法对家兔进行皮下免疫注射,获得青鱼GH多克隆抗血清。以该多抗为一抗,Western Blot 可以检测出4 ng的抗原量;并且在青鱼垂体组织抽提液中和血清中检测到一种能与该抗血清作用的大小为21 kDa的蛋白质。这些结果表明本研究得到的青鱼GH多克隆抗血清具有较好的免疫特性。     

Some biological activities of recombinant DNA-derived growth hormone on plasma metabolite concentrations in domestic fowl

The biological activity of recombinant-DNA-derived chicken growth hormone (rcGH) has been examined in young broiler cockerels, by determining its effects on plasma concentrations of glucose, free fatty acids and alpha-amino nitrogen. A single injection of rcGH increased plasma glucose, which remained high for several hours, whereas daily treatment with rcGH for 1 week had no effect on basal plasma glucose concentrations but blunted the glucose response to a further rcGH challenge. Plasma free fatty acids were also promptly increased following acute rcGH treatment, and chronic exposure to rcGH again attenuated this response. The effects of rcGH on plasma alpha-amino nitrogen were more variable. The stress of repeated blood sampling tended to reduce alpha-amino nitrogen, and after rcGH, an increase relative to vehicle-injected controls was seen in both acute and chronically-treated birds. These data suggest that rcGH has both hyperglycaemic and lipolytic activity in chickens, and may also increase amino acid availability.     

Recombinant-derived chicken growth hormone used for radioimmunoassay

The use of recombinant-derived chicken growth hormone (rcGH) in an avian growth hormone (GH) radioimmunoassay (RIA) procedure is described. Antiserum to turkey GH bound 125I-labeled rcGH, and unlabeled rcGH or turkey GH displaced binding in a dose-related manner. The dose-response curves of sera and pituitary extract from chickens and turkeys were parallel to the rcGH standard curve. Sera from hypophysectomized (hypox) chickens and turkeys produced no dose-response and did not inhibit binding of labeled rcGH. Recovery of rcGH added to hypox sera was quantitative. Modification of the homologous turkey GH RIA protocol of Proudman and Wentworth (1) to use rcGH made possible either an increase in assay sensitivity or a 3-day reduction in incubation time.     

鲤鱼（Cyprinus carpio）生长激素基因的亚克隆及其序列分析

本文对ＰＣＲ扩增的６６８ｂｐ的ＤＮＡ片段进行了亚克隆,然后以Ｓａｎｇｅｒ双脱氧中止法为原理,利用美国ＡＢＩ公司３７０Ａ自动核酸序列分析仪,确定了６６８ｂｐ的核苷酸序列。序列分析表明鲤鱼生长激素基因的开放读框含有６３０ｂｐ,并推测其中包括２２个氨基酸的信号肽和１８８个氨基酸的成熟多肽。鲤鱼生长激素基因的酶切图谱和序列分析的结果都证明我们已获得了全长的鲤鱼生长激素基因。     

Carp growth hormone: molecular cloning and sequencing of cDNA

cDNA clones of the fish Cyprinus carpio growth hormone (GH) mRNA have been isolated from a cDNA library prepared from carp pituitary gland poly(A)+RNA. The nucleotide sequence of one of the carp GH cDNA clones containing an insert of 1164 nucleotides (nt) was determined. The cDNA sequence was found to encode a polypeptide of 210 amino acids (aa) including a signal peptide of 22 aa and to contain 5' and 3' untranslated regions of the mRNA of 36 and 498 nt, respectively. The carp GH presents a 63% amino acid sequence homology with the salmon GH, has structural features common with other GH polypeptides of mammalian or avian origin and contains domains of conserved sequence near the N- and C-terminal regions. Southern blot hybridization of carp genomic DNA with GH cDNA probes shows the presence of at least two GH-coding sequences in the fish genome.     

鲤鱼(Cyprinus carpio)生长激素基因克隆及原核表达

采用逆转录—聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法,从鲤鱼脑垂体总ＲＮＡ中扩增出编码鲤鱼生长激素（ＧＨ）成熟肽基因序列．定向克隆至质粒ｐＵＣ１８,克隆的鲤鱼ＧＨｃＤＮＡ不含信号肽序列并以新的起始密码子ＡＴＧ取代鲤鱼ＧＨｃＤＮＡ第１个密码子ＴＣＡ．序列分析表明,与Ｋｏｒｅｎ报道的鲤鱼ＧＨｃＤＮＡ相比有两个碱基差异,但推断的氨基酸序列完全一致．将鲤鱼ＧＨｃＤＮＡ定向克隆至原核表达载体ｐＢＶ２２０,构建成重组鲤鱼ＧＨ基因表达载体ｐＢＶｃＧＨ８．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层扫描分析表明：经４２℃诱导,ｐＢＶｃＧＨ８在大肠杆菌中可表达一分子量约２２０００的特异蛋白,表达量占细胞总蛋白的２９．２％．该基因重组的鲤鱼ＧＨ添加到饲料中投喂罗非鱼,证实有明显的促进生长作用     

白鲢鱼与黄鳝血清转铁蛋白的分离纯化及其结构和性质的比较

1.白鲢鱼与黄鳝血清转铁蛋白在分离纯化上的差异。2.用SDS-PAGE测定分子量,白鲢鱼血清转铁蛋白有两个组份,分子量分别为77kD和70kD;黄鳝血清转铁蛋白为单一组份,分子量为68.1 kD。3.白鲢鱼与黄鳝血清转铁蛋白都含糖,但都不与ConA-Sepharose柱结合。4.白鲢鱼与黄鳝血清转铁蛋白氨基酸组成的测定和比较。5.白鲢鱼与黄鳝血清转铁蛋白用胰蛋白酶在相同条件下进行酶解,白鲢鱼能得到分子量在37kD左右的二个片段,而黄鳝则几乎不能被胰蛋白酶酶解。6.白鲢鱼血清转铁蛋白在404.5nm处有一特异吸收峰,而黄鳝则在407.5nm处。