地高辛标记探针Southern印迹杂交技术要点及改进

Southern印迹杂交技术是检测特定DNA片段的常规方法之一,其操作程序繁琐,对基因组DNA的提取、纯化、酶切等均有较高要求,要获得理想杂交结果需要反复摸索.总结地高辛标记探针Southern印迹杂交的技术要点,并结合具体操作提出改良方案.     

基于地高辛标记对小麦进行Southern杂交分析主要影响因素的优化和验证

以转基因小麦和野生型小麦DNA为材料,对利用地高辛标记对小麦基因组DNA进行Southern杂交分析的影响因素进行了优化研究,包括探针制备与纯化、样品DNA量、酶切体系、真空转印条件、杂交条件、免疫检测方法等。结果表明,对随机引物标记的模板和标记后的探针进行纯化可明显提高探针的标记效率,10μg高质量的DNA样品在80μl的体系中,酶切8～12h可获得良好的效果;真空转膜时使用碱性液比中性液获得的转膜效果更干净;试剂纯度、杂交温度及杂交炉转速等均对杂交效果产生重要影响;配合改进的CSPD涂布方法,使用化学发光检测系统比单纯使用X光片显像更易操作,背景更干净;本研究所优化的地高辛标记的小麦Southern杂交分析显示出较高的灵敏度和信噪比,结果稳定,可克服同位素标记对实验条件、设备及实验人员身体状况等限制,在普通实验室推广应用。     

地高辛标记探针用于人白细胞基因定位

用地高辛标记探针在人染色体上进行了基因定位。使用了酶显色和荧光显色,两者得到了相同的定位结果,特异区阳性率分别为11.6％和19.8％’荧光显色特异性较高,说明基因定位效果受显示系统效率的影响,地高辛标记探针用于基因定位有比放射性探针、生物素探针更多的优越性。又讨论了几个影响效果的因素,提出以SDC代替甲酰胺洗涤;紫外照射于杂交前R显带方法能取得较好的基因定位效果。     

热启动PCR快速制备地高辛标记探针

介绍了一种在热启动PCR中,以Dig-11-dUTP部分代替dTTP,从少量基因组DNA中快速制备大量的地高辛标记的探针的方法,此探针灵敏度达0.03pg,并只和相关的DNA特异杂交.     

转基因甘蔗植株Southern杂交体系的优化北大核心CSCD

对甘蔗Southern杂交体系的优化,旨为转基因甘蔗Southern杂交鉴定分析提供参考。以转基因甘蔗为材料,就探针不同标记方法的比较、甘蔗基因组DNA的提取、基因组DNA酶切量、酶切时间及杂交过程等方面,对地高辛标记的Southern杂交技术进行了优化研究。结果表明,改良的CTAB法提取的甘蔗DNA能满足后期实验的要求;PCR法标记探针的效率较随机引物法标记探针的效率高,更适合用于Southern杂交;40μg的DNA在400μL酶切体系中,酶切10 h可获得良好的酶切效果;杂交温度40℃,杂交18 h,可获得清晰的杂交条带。     

地高辛标记探针检测生物制品中残余DNA含量

用地高辛标记探针检测由传代细胞系生产的人用精制狂犬病疫苗,重组（CHO细胞）乙肝疫苗,出血热疫苗及痢疾多糖结合疫苗原液中残余DNA含量。结果表明,该方法特异性强,灵敏度高,可用于上述生物制品中残余DNA含量的检测。     

PCR法制备地高辛标记探针改良PCR-Select Differential Screening试剂盒

目的:探讨采用地高辛(digoxin,DIG)标记探针替代PCR-Select differential screening试剂盒中同位素标记探针的方法.方法:抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)所分离的差异表达序列转移至硝酸纤维素膜,以PCR法掺入DIG-11-dUTP制备探针,按DIG标记探针常规操作进行杂交显色,杂交阳性结果采用reverseNorthern blot再度杂交验证.结果:应用DIG标记探针改良PCR-Select Differential Screening试剂盒所得到的阳性结果经reverse Northern blot验证符合率达到90%.结论:DIG标记探针改良PCR-Select differential screening试剂盒在避免了放射污染同时具备很高的特异性,完全可以替代同位素标记探针.     

人βNGFDNA地高辛标记探针的制备及在小鼠颌下腺中的基因表达

本研究在国内首先制备非放射性地高辛标记的人βＮＧＦＤＮＡ（ｄｉｇ－ｈ－βＮＧＦＤＮＡ）探针,并应用原位杂交技术结合计算机图像分析,对ＮＧＦｍＲＮＡ在ＩＣＲ雄性小鼠颌下腺中的分布进行了观察。实验结果显示ＮＧＦｍＲＮＡ主要分布于颌下腺纹状管（ＳＳＴ）和颗粒曲管（ＧＣＴ）的上皮细胞,其细胞基底部胞质呈杂交反应强阳性,细胞顶部呈弱阳性,图像分析显示二者具有显著性差异。本实验制备的ｄｉｇ－ｈ－βＮＧＦＤＮＡ探针灵敏度高达０．１ｐｇ／ｍｌ,并且特异性强,分辨力高,重复性好,是研究ＮＧＦｍＲＮＡ基因表达和调控的有力工具。     

Digoxigenin标记核酸探针分子杂交技术探讨

Dig标记和检测试剂盒中的封阻试剂配制成0.05%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%六种浓度,65～68℃温度时,溶解时间分别为10、15、20、35、40、45分钟;预杂交,在免疫测定中进行封阻,背景反应最小,其次是不预杂交,在免疫测定中进行封阻,再次是预杂交,在免疫测定中不封阻;标记探针保存在-20℃,至少可稳定18个月,同一探针重复使用三次可获得满意效果.以上结果表明,DigDNA标记和检测系统将代替~(32)p标记及其检测系统.     

生物素标记DNA探针杂交条件探讨

DNA探针技术正越来越广泛地应用于医学基础研究和临床检测.生物素标记探针已在某些领域部分取代同位素标记探针而发挥作用。杂交是DNA探针技术中重要一环.各种杂交条件的变化均会对杂交结果并最终对检测结果产生影响。文献中关于杂交条     

地高辛标记探针电镜原位杂交技术探讨

应用ＬｏｗｉｃｒｙｌＫ４Ｍ低温包埋,Ｄｉｇ标记ｃ－ｆｏｓｃＤＮＡ探针对人肝癌组织进行原位杂交,用金标抗Ｄｉｇ抗体进行检测,银增强放大信号处理。电镜观察表明,免疫胶体金颗粒特异性地标记在肝癌细胞胞浆及核内,呈散在分布,金颗粒大小基本一致,背景清晰。     

地高辛配基标记探针在流行性出血热尸检组织中原位分子杂交技术的应用和探讨

将地高辛配基(Dig)标记的探针应用于流行性出血热(EHF)尸检组织的石蜡切片中,进行原位分子杂交四例。方法要点:(1)采用Dig标记的探针及碱性磷酸酶系统、提高其敏感性;(2)为达到被检核酸的暴露彻底、准确,选择合适的消化酶;(3)选择适当的杂交温度和时间,防止了非特异性背景,并避免了组织脱片。结果表明此方法操作简便、安全、快速、敏感。     

地高辛精标记酪氨酸羟化酶RNA探针的制备研究

为制备用地高辛精（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ,Ｄｉｇ）标记的酶氨酸羟化酶（ＴｙｒｏｓｉｎｅＨｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ,ＴＨ）ＲＮＡ探针,本研究用分子生物学技术重组质粒ＰＧＥＭＴＨＩ,即分别将携带Ｔ７和Ｓｐ６启动子的ＰＧＥＭ－３ｚｆ质粒和携带ＴＨ基因的ＰＫＳＴＨ质粒用限制性内切酶消化并行分离纯化,得到带Ｔ７和ｓｐ６启动子的ＤＮＡ片段和ＴＨ基因片段;经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接后转入大肠杆菌,得到ｐＧＥＭＴＨ１重组克隆。经小量提取质粒井用酶切分析检测,证实其确有ＴＨ基因且方向正确。将此质粒再经限制性内切酶消化则得到线状ＤＮＡ片段,用Ｔ７ＲＮＡ聚合酶转录合成带有Ｄｉｇ标记的高比活度的单链ＲＮＡ探针;经斑点杂交试验证实该探针具有较高的可靠性。这将为基因治疗帕金森氏病动物模型的疗效检测提供有效手段。     

生物素标记核酸探针的分子杂交技术及其应用

核酸分子杂交是基于核酸链间互补碱基对的特异性结合,测定核酸碱基顺序同源性的一种现代技术,是基因工程、分子遗传及医学诊断中常用的方法。该法较常规诊断法灵敏度高、特异性强,目前,已广泛应用于重组DNA的筛选、基因分祈、染色体基因定位及病毒病诊断等方面。     

地高辛标记法检测人源细胞系端粒长度

目的:建立一种灵敏的、非同位素标记的端粒长度检测方法,并用于人源细胞系的肿瘤研究。方法:以地高辛标记寡核苷酸(TTAGGG)3为探针,对基因组DNA进行Southern印迹检测,经CDP-Star显色后与DNA标准分子量比较,利用图像分析系统计算端粒长度。结果:通过严格控制探针的工作浓度(1∶3000稀释)、DNA上样量(1.5～2.5μg)、杂交温度(42±1℃)等主要影响因素,获得了比较好的杂交条带。结论:建立了一种稳定、可靠、低背景的地高辛标记检测端粒长度的方法;对正常细胞、永生化细胞和肿瘤细胞进行了端粒长度的检测和对比分析。     

橡胶树转基因植株Southern杂交体系的优化

以地高辛标记的Southern杂交技术已广泛应用于多个物种中。选择橡胶树为材料,就基因组DNA的提取、探针标记方法的选择以及具体的杂交操作过程等方面对该体系进行了优化。结果表明,至少40μg高质量的DNA在300μL的大酶切体系中,酶切12 h可获得良好效果;PCR法标记的探针杂交条带清晰、背景浅,其效率明显强于随机引物法标记的探针。本研究优化的体系信号强、背景浅和灵敏度高,为橡胶树Southern杂交鉴定分析提供参考。     

地高辛标记探针检测Vero细胞狂犬病疫苗残余Vero细胞DNA含量

地高辛标记Vero细胞DNA,并制备成DNA探针,以此探针进行点杂交,确定探针的工作浓度,特异性及灵敏度,并用此法监测Vero细胞狂犬病疫苗浓缩原液纯化工艺的Vero细胞DNA去除率,测定精制Vero细胞狂犬病疫苗成品中残余Vero细胞DNA含量,结果明显,该法特异性强,重复性好,快速简便,灵敏度高,检测值可达5pg/剂量,可用于精制ero细胞狂犬病疫苗纯化工艺的质量控制和半成品检定。     

生物素标记核酸探针技术

通过缺口移位反应和多种化学标记方法合成生物素化核酸探针,并配以酶化学检测手段的新技术,可以代替放射性同位素标记探针作各种探测和分析。它具有灵敏,快速和安全、简便、经济的特点。     

应用DIG标记探针杂交检测IBDV

本试验用地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ,ＤＩＧ）标记的探针建立了核酸杂交检测传染性法氏囊病病毒（ＩＢ－ＤＶ）的方法,并在敏感性方面同琼脂扩散试验进行了比较。探针来源于ＩＢＤＶＳＴＣ－ｌｌ９和ＳＴＣ－２４３ｃＤＮＡ。杂交方法的敏感性试验表明,核酸杂交可以检测到０．１ｐｇ的ＩＢＤＶＲＮＡ;与多个毒株核酸的杂交则显示出标记的探针可以作为通用试剂用于ＩＢＤＶ早期感染的诊断;而同琼脂扩散试验的比较则说明,杂交方法比常规的免疫沉淀反应敏感１０４倍以上。除此之外,由于杂交方法特异以及非放射性探针操作方便,因而具有很大的应用前景。