辛德毕斯病毒YN87448株与宿主细胞凋亡的研究

为了了解云南辛德毕斯病毒在BHK21细胞上的生长特性,并观察该病毒在BHK21细胞、3d龄和2周龄小白鼠中是否有凋亡反应出现.在接种后不同时间取样,检测病毒的滴度,电镜检测凋亡细胞,检测细胞的DNA阶梯.一步生长曲线结果表明病毒在出现CPE之前就有大量繁殖.秋水仙素对该病毒的成熟释放没有抑制作用.该病毒对BHK21、小白鼠均可产生细胞凋亡.     

鼻病毒非结构蛋白2B 诱导细胞发生内质网应激

为探讨鼻病毒非结构蛋白2B诱导内质网应激和细胞凋亡的机制,本研究构建了鼻病毒非结构蛋白2B的真核表达载体p2B‐GFP ,通过转染BHK‐21细胞检测相关标志蛋白的变化情况。结果显示,非结构蛋白2B定位表达于BHK‐21细胞内质网,诱导内质网应激标志蛋白Grp78、CHOP的表达增加,并使活化转录因子6（ATF6）的转录活性增加,还诱导BHK‐21细胞发生核浓缩而凋亡,使凋亡标志蛋白PARP发生降解而减少。结果提示,鼻病毒非结构蛋白2B可诱导细胞发生内质网应激,并经该途径诱导细胞凋亡。     

汉滩病毒诱导小鼠骨髓瘤SP2／0细胞凋亡的初步研究

为研究汉滩病毒对肿瘤细胞的诱导凋亡作用,以一定量病毒悬液感染体外培养的SP2／0细胞,接种后一定时间将细胞消化甩片行Gimsa染色观察凋亡细胞核的变化,制细胞悬液以流式细胞仪测细胞周期,并用免疫组化的方法检测凋亡分子Fas和FasL的表达。结果示经病毒诱导后细胞出现生长特性及形态学变化,Giemsa染色观察到典型凋亡细胞：流式细胞仪显示有凋亡峰出现;免疫组化检测出感染后SP2／0细胞中Fas和FasL表达明显升高。该结果表明汉滩病毒可诱导体外培养SP2／0细胞凋亡,其发生可能与凋亡分子Fas和FasL有关。     

汉滩病毒诱导小鼠骨髓瘤SP2/0细胞凋亡的初步研究

为研究汉滩病毒对肿瘤细胞的诱导凋亡作用,以一定量病毒悬液感染体外培养的SP2/0细胞,接种后定时间将细胞消化甩片行Gimsa染色观察凋亡细胞核的变化,制细胞悬液以流式细胞仪测细胞周期,并用免疫组化的方法检测凋亡分子Fas和FasL的表达.结果示经病毒诱导后细胞出现生长特性及形态学变化,Giemsa染色观察到典型凋亡细胞;流式细胞仪显示有凋亡峰出现;免疫组化检测出感染后SP2/0细胞中Fas和FasL表达明显升高.该结果表明汉滩病毒可诱导体外培养SP2/0细胞凋亡,其发生可能与凋亡分子Fas和FasL有关.     

五种虫媒病毒的细胞敏感性观察

对新引进 5种虫媒病毒 :马雅罗病毒 (MAY) ,西门利克病毒 (SFV) ,墨累谷脑炎病毒 (MVE) ,伊利乌斯病毒 (ILH)和布尼安姆韦拉病毒 (BUN)采取乳鼠脑内接种的方法传出 ;选择BHK2 1、LLC MK2 、A549和C6 / 36传代细胞 ,进行这 5种病毒的敏感性试验 ,观察病毒在细胞上的CPE出现时间、特点以及滴度。实验表明 ,BHK2 1细胞对 5种病毒CPE特征明显 ,出现时间较早 ,滴度较高 ,适用于 5种病毒的组织培养。     

我国D2-43病毒株PrM-E基因的重组SFV的制备及生物学鉴定

 为构建含PrM E基因的重组SFV病毒 ,将含我国登革 2型病毒PrM E基因的SFV表达载体和辅助载体DNA线性化后 ,进行体外转录 .然后将获得的 2种RNA转录物共转染BHK2 1细胞 ,以RT PCR法证明转染后的细胞培养上清中含有重组SFV .进一步将该重组病毒经蛋白酶激活后可使BHK2 1细胞产生细胞病变 ,并且以间接免疫荧光法在感染细胞内可检测到登革 2型病毒所特有的蛋白 .含我国登革 2型病毒PrM E基因的重组SFV的获得 ,为进一步观察该重组病毒的免疫原性奠定了基础 ,从而为登革新型疫苗的研制提供新途径     

应用BHK21细胞检测汉坦病毒中和抗体方法的建立

本文报道应用汉坦病毒（HV）Ⅰ型76－118、Chen、J3、J5、J12,和Ⅱ型UR、R22、L99等8株病毒在BHK21细胞上培养和观察,发现病毒感染BHK21细胞后可规律出现病变,且可测出病毒滴度。分别应用BHK21细胞与Vero-E6细胞同时做空斑减少中和试验（PRNT）检测同批血清的抗体中和效价,结果一致,且稳定性特异性好,因此BHK21细胞可作为研究HV的另一个敏感实验细胞系,对研究HV的某些生物学特性及实验方法均有实用价值。     

登革3型病毒prM-E基因重组质粒DNA的构建和真核表达

构建登革 3型病毒 prM E基因的真核表达重组质粒 ,并进行体外表达 ,为登革DNA疫苗的研究奠定基础。用RT -PCR法获得 prM -E基因片段 ,然后将其克隆到真核表达载体中。用电穿孔法将重组质粒DNA转入BHK细胞 ,通过免疫荧光法检测外源基因在真核细胞中的表达。结果 ,通过酶切和序列测定证实了构建的重组质粒DNA含序列正确的 prM- E基因。用免疫荧光法检测到转染了重组质粒DNA的BHK细胞的胞浆中有登革 3型病毒特异蛋白的表达。说明含有登革 3型病毒prM -E基因的真核表达重组质粒可以在BHK细胞中表达 ,该结果为观察该重组质粒的免疫原性奠定了基础。     

IGF-1 基因转染对脂肪间充质干细胞活性的影响及机制研究

目的:探讨携带IGF-1基因慢病毒转染脂肪间充质干细胞(ADMSCs)的可行性,对其引起的细胞凋亡机制做出初步研究,并讨论其与PI3K/Akt通路的关系。方法:分离培养ADMSCs,利用脂质体将携带IGF-1基因的慢病毒载体转染入ADMSCs。实验分为Blank组,Lv-non和Lv-IGF-1三组,转染后用MTT法测定各组细胞的生长情况并绘制生长曲线,流式细胞术测定各组细胞凋亡,Western blot测定各组中IGF-1、Akt、p-Akt及凋亡相关蛋白的表达。结果:成功分离、培养了大鼠脂肪间充质干细胞;携带IGF-1慢病毒载体转染ADMSCs后,流式细胞术检测发现Lv-non和Blank组凋亡率明显高于Lv-IGF-1组(P0.05)。同时发现Lv-IGF-1组中促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9蛋白和Bax的表达水平显著下调(P0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2显著上调(P0.01)。MTT法结果显示Lv-IGF-1能促进细胞生长,在5到6天时显著高于其他两组(P0.05)。通过检测PI3K/Akt通路发现,Lv-IGF-1组PI3K和p-Akt水平显著高于Blank和Lv-non组(P0.05),通路被激活。结论:携带IGF-1基因慢病毒载体成功转染ADMSCs。在ADMSCs中过表达IGF-1蛋白可以促进细胞生长,同时抑制细胞凋亡,其机制可能与PI3K/Akt通路蛋白磷酸化相关。     

骨形成蛋白7基因诱导人肝癌细胞的凋亡

目的 构建表达重组人骨形成蛋白7 （bone morphogenic protein 7, BMP7）基因的重组逆转录病毒,观察其对人肝癌细胞HepG2的凋亡诱导活性,并探讨其作用机制。方法 克隆BMP7基因,以loxP同源重组法构成逆转录病毒载体pLP-LNCX-BMP7（pLLBMP7）,转染包装细胞PT67进行病毒包装并测定病毒滴度;将逆转录病毒感染人成骨细胞,MTT法检测细胞生长变化,琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡;Western blotting检测BMP7,caspase-3和bcl-2蛋白表达。结果 重组逆转录病毒载体pLLBMP7经鉴定连接正确,转染PT67细胞后上清液中可得到病毒,滴度达1×109pfu;MTT检测见pLLBMP7病毒组48和72h细胞抑制率高于对照组（35.1% vs. 5.3%,68.5% vs.18.3%,均p<0.05）,48h可见BMP7蛋白高表达。琼脂糖凝胶电泳出现典型梯形条带;流式细胞仪检测出现凋亡峰,于转染48h后达最高峰,其凋亡百分率高达14.42%;BMP7蛋白高表达时caspase-3蛋白的表达亦有显著升高,但bcl-2蛋白未见表达差异。结论 构建了BMP7逆转录病毒,在体外能够有效地诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡,其可能是通过激活caspase-3而发生作用。     

云南辛德毕斯病毒的生物学性状研究

本文对云南首次分离到的Sindbis病毒进行了滤过试验,耐酸耐醚试验、致细胞病变、动物敏感性试验、血压 凝特性、空斑和毒力等试验研究,结果符合披膜病毒科的病毒特性。交 因抑试验和免疫荧光试验,以及空斑减小中和试验进一步证实为甲病毒属的Sindbis病毒,其空斑纯化株的生物学特性也与原株相符,纯化株的制备为该株病毒分子生物学研究的准确性和一致性提供了条件。云南Sindbis病毒的首次分离具有重要的流行病学意义,其生物学特性研究结果对我省该病的诊断和防治具有重要的指导意义。     

云南辛德毕斯病毒的生物学性状研究

本文对云南首次分离到的Sindbis病毒进行了滤过试验、耐酸耐醚试验、致细胞病变、动物敏感性试验、血凝特性、空斑和毒力等试验研究,结果符合披膜病毒科的病毒特性。交叉血抑试验和免疫荧光试验,以及空斑减少中和试验进一步证实为甲病毒属的Sindbis病毒。其空斑纯化株的生物学特性也与原株相符,纯化株的制备为该株病毒分子生物学研究的准确性和一致性提供了条件。云南Sindbis病毒的首次分离具有重要的流行病学意义,其生物学特性研究结果对我省该病的诊断和防治具有重要的指导意义。     

Interaction of E2 Glycoprotein with Heparan Sulfate Is Crucial for Cellular Infection of Sindbis Virus

Cell culture-adapted strains of Sindbis virus (SINV) initially attach to cells by the ability to interact with heparan sulfate (HS) through selective mutation for positively charged amino acid (aa) scattered in E2 glycoprotein (W. B. Klimstra, K. D. Ryman, and R. E. Johnston, J. Virol. 72: 7357–7366, 1998). Here we have further confirmed that interaction of E2 protein with HS is crucial for cellular infection of SINV based on the reverse genetic system of XJ-160 virus, a Sindbis-like virus (SINLV). Both SINV YN87448 and SINLV XJ-160 displayed similar infectivity on BHK-21, Vero, or C6/36 cells, but XJ-160 failed to infect mouse embryonic fibroblast (MEF) cells. The molecular mechanisms underlying the selective infectivity of XJ-160 were approached by substituting the E1, E2, or both genes of XJ-160 with that of YN87448, and the chimeric virus was denominated as XJ-160/E1, XJ-160/E2, or XJ-160/E1E2, respectively. In contrast to the parental XJ-160, all chimeric viruses became infectious to wild-type MEF cells (MEF-wt). While MEF-Ext ^−/− cells, producing shortened HS chains, were resistant not only to XJ-160, but also to YN87448 as well as the chimeric viruses, indicating that the inability of XJ-160 to infect MEF-wt cells likely due to its incompetent discrimination of cellular HS. Treatment with heparin or HS-degrading enzyme resulted in a substantial decrease in plaque formation by YN87448, XJ-160/E2, and XJ-160/E1E2, but had marginal effect on XJ-160 and XJ-160/E1, suggesting that E2 glycoprotein from YN87448 plays a more important role than does E1 in mediating cellular HS-related cell infection. In addition, the peptide containing 145–150 aa from E2 gene of YN87448 specifically bound to heparin, while the corresponding peptide from the E2 gene of XJ-160 essentially showed no binding to heparin. As a new dataset, these results clearly confirm an essential role of E2 glycoprotein, especially the domain of 145–150 aa, in SINV cellular infection through the interaction with HS.     

应用单引物差异RT-PCR法鉴定我国分离的甲病毒(YN87448病毒)

甲病毒指披膜病毒科(Togavirdae)甲病毒属(Alphavirus),以蚊虫等吸血昆虫为传播媒介,可引起如辛德毕斯热、基孔肯雅热、东方马脑炎、西方马脑炎等多种人畜共患性传染病[1,2],是医学上重要的虫媒病毒.甲病毒世界性分布,全世界已发现28种甲病毒,其中13种与人畜疾病有关,至少7种甲病毒发生过不同程度流行,造成巨大的经济损失,成为严重的公共卫生问题.张海林等(中国媒介生物学及控制杂志,1992,3(特7):419－421)从云南傣族一位发热病人血中分离到一株病毒,命名为YN87448病毒.经血清学鉴定该病毒符合披膜病毒科甲病毒属病毒特征.由于缺乏标准诊断血清,无法对它作进一步鉴定.该病毒直接分离自发热病人血清,病人主要症状为发热,寒颤,腰疼痛和全身酸痛.由于该病毒直接分离自病人血清,病毒鉴定对解释该病人的发病原因,甚至对于解释我国部分地区流行的"无名热"的病因均具有重要意义.     

云南基孔肯雅病毒生物学性状的研究

本文对分离自云南的基孔肯雅病毒进行了生物学特性研究。实验证明基孔肯雅病毒对乳鼠有强而稳定的致病性,对C6/36,BHK21及Vero细胞有致病变作用,能与鹅和鸽红细胞凝集,最适pH5.75。电镜观察病毒呈圆形,有膜,外径66.8nm,内径47.7nm。交互血凝抑制及中和试验表明,云南毒株之间或与国外原株在抗原性上无明显差别,为同一血清型,并与同亚组病毒反应较弱,与其它虫媒病毒无交叉。本文还讨论了云南株与国外原株在某些生物学特性方面的异同。     

Hexokinase activity as marker to assess time of harvest of foot-and-mouth disease virus in BHK21 Cl13 cell cultures

Hexokinase (B.C. 2.7.1.1) activity as a marker enzyme during FMD viral infection has been observed spectrophotometrically in a system coupled with glucose-6-phosphate dehydrogenase, in supernatants of BHK(21)Cl(13) suspension as well as anchored cell culture at a minimum of 10(4) infective virus particles/ml. Specific activity increased with virus concentration in culture supernatants and abruptly decreased with a fall in virus titer, as has been noted by TCID/50,146 S concentration, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) readings.     

The apparent infection of NA-C1300 cell cultures by nucleocapsid material of the Canadian Arctic strain of rabies virus

Murine neuroblastoma (NA-C1300) and baby hamster kidney (BHK-21/C13) cell cultures were infected with the Canadian Arctic strain of rabies virus. Subcultures were passed following incubation for 3 to 4 days at 35 degrees C. The supernatant fluids from the BHK cultures demonstrated increasing infectivity in both NA and BHK cells concomitantly with an increase in the number of parent cells staining with an anti-glycoprotein stain. On the other hand, the supernatant fluids from the NA cultures initially showed higher infectivity in NA cells than in BHK cells. This feature was related to a low production of glycoprotein-staining cells in the parent NA cultures. The reduction of infectivity in NA cells of some NA supernatant fluids (and brain suspensions) by anti-nucleoprotein antibodies suggests that nucleocapsid material is, in some manner, capable of infecting NA cells. Infectivity of this virus strain in experimental mice is also related to the production of glycoprotein and may not be correlated with the degree of infection in NA cell cultures.     

Effects of rabies infection on the metabolism of the host-cell: does inhibition of cellular RNA synthesis take place?

Acute infection of cloned BHK21 cells with rabies virus (CVS strain) resulted in a reduction in the amount of cellular RNA, not so rapid and pronounced as with another rhabdovirus, vesicular stomatitis virus (VSV). This decrease in the amount of cellular RNA was shown to be caused by a differential membrane permeability of infected and uninfected BHK21 cells to [3H]-uridine and by a real inhibition of cellular RNA synthesis.