限制内切酶EcoRI的纯化及其活性鉴定

本文叙述了一个较简便的EcoRI限制内切酶的提纯方法。从大肠杆菌HB101(PMB_4)中制备出高活性的EcoRI酶,并鉴定其生物活性。     

EcoRI限制性内切酶底物专一性的研究——具有核糖修饰的EcoRI底物类似物的合成

本文报道用化学和酶促相结合的方法合成了d-GGArATTCC和d-GGArATTC。酶促反应结果说明,当受体3′末端为核糖核苷时大大促进RNA连接酶的作用。产物的结构均经蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后的电泳-同系层析双向图谱鉴定得到证明。这两种类似物都能被EcoRI限制性内切酶识别并在专一位置上水解,结果说明EcoRI的识别顺序中第四位上d-A变为r-A并不显著影响酶的识别,而且证明了EcoRI的最小底物是含有识别顺序的七聚脱氧核苷酸。     

EcoRI限制性内切酶底物专一性的研究——具有核糖修饰的EcoRI底物类似物的合成

本文报道用化学和酶促相结合的方法合成了d-GGArATTCC和d-GGArATTC。酶促反应结果说明,当受体3'末端为核糖核苷时大大促进RNA 连接酶的作用。产物的结构均经蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后的电泳一同系层析双向图谱鉴定得到证明。这两种类似物都能被EcoRI 限制性内切酶识别并在专一位置上水解,结果说明EcoRI 的识别顺序中第四位上d-A 变为r-A 并不显著影响酶的识别,而且证阴了EcoRI 的最小底物是含有识别顺序的七聚脱氧核苷酸~*。     

C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆与表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了1．2kb的α毒素基因,将纯化的PCR产物与载体pGEM-T连接,转化至受体菌JM109中,经NcoI／EcoRI和BamHI／EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,重组质粒pXCPAl中含有α毒素全基因。随后用NcoI／EcoRI酶切质粒pXCPAl,回收α毒素基因片段,插入到事先经同样酶切处理的载体pET-28c中相应酶切位点,构建了表达质粒pETXAl,经NcoI／EcoRI和BamHI／EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,表达质粒含有α毒素基因且基因序列和阅读框架正确。重组菌株BL21(DE3)(pETXAl)表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别,其表达量占菌体总蛋白相对含量的16．28％。     

经柞蚕蛹连续继代的柞蚕核型多角体病毒酶解图谱分析

本研究对五株不同地域分离的柞蚕核型多角体病毒(Ap NPV)在柞蚕蛹体内继代后的产物进行EcoRI和SaII酶解图谱比较分析。观祭到经柞蚕蛹继代一次的五株病毒的EcoRI酶解图谱均相同;而SaII酶解图谱各有明显不同之处。其中二株病毒(ApNPV-3和Ap NPV-9)经柞蚕蛹继代1次与连续继代26次后的酶解图谱分析中,观察到,各样品的EcoRI酶解图谱仍相同,第1次与第26次的ApNPV-9的SaII酶解图谱也无明显差异。但第1次与第26次的ApNPV-3的SaII酶解图谱却有明显差异。结果提示:ApN     

线粒体基因组的研究 Ⅰ.猪肝线粒体基因组的限制性内切酶图谱

猪肝线粒体DNA经限制性内切酶BamHI、BglI、EcoRI和PstI水解分别切成5、3、3和4个片段,对这些片段的分子量进行了测定。EcoRI片段的顺序是以复制位移环(D-环)为基准通过部分水解产物的电泳和电镜分析确定的。BamHI、BglI和PstI的切割位点则根据双酶水解产物的分析,参照EcoRI位点进行定位,从而得到了由15个片段组成的物理图谱。猪肝线粒体DNA的分子量为10.40×10~6道尔顿,有15.76千碱基对。     

异源基因α1,3半乳糖转移酶与增强型绿色荧光蛋白融合对荧光蛋白表达的影响

目的 研究异源(猪)基因α1,3半乳糖转移酶(3GT)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因形成的融合蛋白对其荧光表达量的影响.方法 BamHI,EcoRI酶切pcDNA3.1-α1,3GT重组载体后,回收含α1,3GT的片段,与BamHI、EcoRI酶切回收的pEGFP-N1载体连接,并酶切、测序鉴定重组真核表达载体p...     

线粒体基因组的研究——Ⅰ.猪肝线粒体基因组的限制性内切酶图谱

猪肝线粒体DNA 经限制性内切酶BamHI、BglI、EcoRI 和PstI 水解分别切成5、3、3和4个片段,对这些片段的分子量进行了测定.EcoRI 片段的顺序是以复制位移环(D-环)为基准通过部分水解产物的电泳和电镜分析确定的。BamHI、BglI 和PstI 的切割位点则根据双酶水解产物的分析,参照EcoRI 位点进行定位,从而得到了由15个片段组成的物理图谱。猪肝线粒体DNA 的分子量为10.40×10~6道尔顿,有15.76千碱基对。     

大麦DNA单限制性酶切选择性扩增多态性技术及其优化

建立和优化了大麦DNA单限制性酶切选择性扩增多态性技术体系(SADF).分别用限制酶PstI、EcoRI和MseI酶切大麦基因组DNA,再与各自相应的人工接头连接,使用带三个选择碱基的引物进行选择性扩增.结果表明:采用分别优化建立的标准PCR扩增检测体系,六个识别碱基的PstI和EcoRI的SADF均能得到丰富稳定的带形,四个识别碱基的MseI不能得到明显谱带.SADF扩增产物片段大小范围为:PstI一般在200～2000bp,而EcoRI在200～1000bp;两者在不同大麦品种中均能检测到多态性,可用于不同大麦品种的检测,但PstI得到的带型明显优于EcoRI,在大麦中得到的片段具有范围宽、分布均匀、易于观察、多态性高等特点。 Abstract:A method named selective amplification DNA fragments (SADF) using single restrictive enzyme was established and optimized in barley.The barley genome DNA was first restricted into fragments of varied length with PstI,EcoRI and MseI respectively,then ligated with synthetic adapters.The ligated sets of fragments were used as templates for PCR amplification.Ideal amplification results could be obtained with different amplification procedure for PstI and EcoRI.Except MseI,both PstI and EcoRI could obtain abundant and reproducible bands,but SADF of PstI was more suitable for barley studies because of wider,more recognizable and polymorphic distribution of bands.     

鸡贫血病毒全基因组点突变体的体外构建及其在宿主细胞MSB1的转染研究

在已构建鸡贫血病毒（CAV）全基因组体外克隆（pCAV2.4)的基础上,设计一对特定引物,用CPR定向点突变方法扩增出含有完整的EcoRI位点的CAV全基因组（2.3kb）,并克隆入pUC18载体中,获得阳性克隆,命名为pCAVE^ 。经酶切鉴定和序列分析EcoRI位点两侧序列,原先不完整的EcoRI位点（－GACTTC－）已被定向点突变为完整的EcoRI位点（－GAATTC-)。对重组质粒pCAVE^ 以EcoRI酶切回收CAV全基因组DNA,在体外连接并经纯化后,经Effectene转染易感宿主细胞MSB1。将转染细胞培养上清连续传代8次以后,出现病毒复制（MSB1细胞培养基颜色不再变黄）。取此时细胞培养液感染无CAV的1日SPF小鸡,14天出现典型的鸡盆血症状和胸腺萎缩、骨髓脂肪变性等病变。获得了能在体外自主复制并组装成完整CAV病毒子的感染性核酸。     

多核苷酸合成的研究——ⅩⅣ.EcoRI 接头片段脱氧八核苷七磷酸的合成

本文采用化学方法和化学与酶促相结合的方法分别合成了自身互补的EcoRI 接头片段脱氧八核苷酸d-GpGpApApTpTpCpC。化学方法使用二酯法(4 4)的路线,各中间片段和最终产物用DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析纯化。酶促合成是用化学合成的两个片段d-GGAA和d-TTCC,借RNA 连接酶连接成脱氧八核苷酸。两种方法合成的八核苷酸都能被限制性内切酶EcoRI 识别并水解得到预期的产物,同时双向指纹图谱分析证明合成的产物具有正确的核苷酸排列顺序。     

多核苷酸合成的研究 ⅩⅣ.EcoRI接头片段脱氧八核苷七磷酸的合成

本文采用化学方法和化学与酶促相结合的方法分别合成了自身互补的EcoRI接头片段脱氧八核苷酸d-GpGpApApTpTpCpC。化学方法使用二酯法(4 4)的路线,各中间片段和最终产物用DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析纯化。酶促合成是用化学合成的两个片段d-GGAA和d-TTCC,借RNA连接酶连接成脱氧八核苷酸。两种方法合成的八核苷酸都能被限制性内切酶EcoRI识别并水解得到预期的产物,同时双向指纹图谱分析证明合成的产物具有正确的核苷酸排列顺序。     

氧化硫硫杆菌pTt54质粒的限制性酶切分析及其在大肠杆菌中的克隆

对pTt54质粒进行了限制性酶切分析,实验证明pTt54质粒上有一个EcoRI切点和一个Sau3Ai切点,无BamHI、BclI,BglII、HindIII,Sall、XhoI、Kpnl、PvuII、Pstl切点。绘出了该质粒的酶切图谱,分子量为2.14Kb。pTt54质粒分别通过EcoRI位点和BamHI位点与pBR 325质粒重组,得到了重组质粒pSDT541和pSDT542,这两个质粒均可作为氧化硫硫杆菌遗传信息转移系统的载体。     

麦迪霉素产生菌生米卡链霉菌1748的质粒Psmyi及其特性的研究

从大环内酯类抗生索麦迪霉素的产生菌生米卡链霉菌1748(Streptomyces,mycarofa-ciens1748)中首次分离到质粒pSMYl DNA,通过琼脂糖凝胶电泳和电镜观察,测定pSMYl的分子量为7．17×10⁶道尔顿。用限制性内切酶EcoRI、PstI、XhoI、SalI和BamHl酶切该质粒DNA,构成了pSMYl的限制性内切酶酶切图谱。EcoRI、Pstl对该质粒均只有一个切点。pSMYI能转化到变青链霉菌1326(S.lividansl326)菌株中能稳定地存在,且具有形成麻点(pock)的特性。     

用于DNA无性繁殖的EcoRI接头的化学合成

利用二酯法化学合成了一个脱氧八核苷酸(d-G-G-A-A-T-T-C-C)。此八核苷酸片段自身互补形成双链DNA片段,能被限制性内切酶EcoRI酶解。利用双向同系层析测定了它的核苷酸序列,证明这一片段的序列符合实验设计要求。     

2,5-DKG还原酶Ⅱ基因的克隆和在大肠杆菌中的表达*

参照文献上的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸（简称2,5-DKG）还原酶II基因序列,合成两个引物序列并在两端加上EcoRI和BamHI两个酶切位点,抽提棒状杆菌SCB3058菌株的染色体为模板进行PCR反应,克隆得到2,5-DKG还原酶II基因,酶切验证与预期的结果相符合。将此片段克隆到pGEM-T载体上保存．将2,5-DKG还原酶II基因用EcoRI和BamHI内切酶切下,连接到pBV220载体上,构建成表达载体。42℃诱导不能得到稳定的蛋白表达条带和酶活力,测序发现基因的3’末端的原PCR引物外少合了一     

两株蓖麻蚕核型多角体病毒DNA同源性的研究

两株不同来源的蓖麻蚕核型多角体病毒(ArscsNPV和ArNPV)经提纯后,使用SDS—苯酚抽提病毒核酸,并使用限制性内切酶EcoRI,BamHI酶解后,用分子杂交方法与缺口平移标记的ArscsNPV-DNA探针杂交,分析了两株蓖麻蚕NPV病毒核酸的同源性。EcoRI酶解的ArNPV-DNA产生8个片段,其中5个片段能与ArscsNPV-DNA探针杂交。BamHI酶解ArNPV-DNA产生7个片段,其中6个片段能与ArscsNPV-DNA探针杂交。结果表明:两株蓖麻蚕NPV之间病毒核酸具有很高的同源性。使用斑点杂交方法分析了ArscsNPV与ArNPV,柞蚕NPV及家蚕NPV之间的核酸同源性,结果表明:ArscsNPV与ArNPV,柞蚕NPV具有同源性。而与家蚕NPV无核酸同源性。     

南芥菜花叶病毒卫星RNA及其核酶的结构分析

以提纯的南芥菜花叶病毒(Arabis Mosaic Virus,ArMV)卫星RNA(sArMV)为模板,以合成的DNA寡核苷酸为引物,经过反转录—PCR扩增合成全长的dscDNA。Ds cDNA的两端连接EcoRI Adaptors插入到经EcoRI酶解的脱磷酸化的pUC 9质粒中,转化E．Coli JM83。用32P标记的sArMV为探针进行菌落原位杂交和EcoRI酶解分析,筛选出含有全长cDNA片段的克隆。用Taq TrackRsequcingSystems。脚的序列分析表明：克隆的sAxMV cDNA由300bp脱氧核糖核苷酸组成,与其RNA序列分析的结果相同,含有一个首尾相连的由54个核苷酸组成的核酶,具有完整的垂头状结构及能自我切割5'GUC↓3'的生物功能。     

基因工程研究用酶的市场予测

基因工程研究用酶的种类在不断增加。在市场上,已经细分成了许多种酶和许多产生菌。美国的制造商正逐渐增加,以欧洲和日本的产品为竞争对手。 目前出售的限制酶约有一百多种,其数量还在增加。可是其中的5种酶:BamH,EcoRI,HindIII,PstI,salI价格比较便宜,占美国市场的30％。修饰性酶则是:连接     

C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆与表达*

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了1.2kb的α毒素基因,将纯化的PCR产物与载体pGEM-T连接,转化至受体菌JM109中,经NcoI/EcoRI和BamHI/EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,重组质粒pXCPA1中含有α毒素全基因。随后用NcoI/EcoRI酶切质粒pXCPA1,回收α毒素基因片段,插入到事先经同样酶切处理的载体pET28c中相应酶切位点,构建了表达质粒pETXA1,经NcoI/EcoRI和BamHI/E