草丁膦对转bar基因水稻GS酶活性和光合功能的影响

喷施草丁膦后,对草丁膦无抗性水稻Cypress(未转bar基因)叶片的谷氨酰胺合成酶(GS)活性先受到抑制,随后叶片内NH 4积累上升,叶绿素含量、PSⅡ原初光化学效率(Fv/Fm)、光能转化效率(ΦPSⅡ)和叶片叶绿素荧光的光化学猝灭系数(qp)下降,光合速率显著降低;最后引起植株死亡.另一方面,Cypress PB-6(转bar基因抗草丁膦水稻)的GS酶活性在喷施草丁膦后虽然先被抑制,但随后能恢复至正常水平,接着NH 4积累下降,草丁膦对叶绿素含量、荧光参数Fv/Fm、ΦPSⅡ、qp的影响被解除,光合速率恢复到正常水平,整个植株生长正常.     

盐藻对除草剂草丁膦的抗性研究

对分离出的单藻落盐藻进行除草剂草丁膦的抗性实验,液体培养结果显示,野生盐藻对除草剂草丁膦敏感,3.0mg/L剂量的草丁膦能完全抑制盐藻的生长和增殖。     

水稻Act1启动子融合的bar基因在转基因燕麦T3代中的表达

以微弹轰击法转化获得的含ｂａｒ基因燕Ｔ３代为材料，运用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ方法研究了ｂａｒ基因在燕麦的不同生育阶段、不同叶位、以及Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ（０．２％）处理后不同时间的叶片中ｍＲＮＡ水平的变化。结果表明，外源ｂａｒ基因在燕麦的不同生育阶段、不同叶位、以及除草剂处理后转录水平没有明显差异。由于除草剂喷涂后，植株体内氨含量的变化能够反映ｂａｒ基因编码的ＰＡＴ酶活性的变化，因而测定了Ｃｈａ     

抗草丁膦和抗草甘膦转基因油菜的抗性基因向野芥菜的流动

通过人工去雄授粉和田间隔行种植试验,研究了抗草丁膦和抗草甘膦转基因油菜(Brassica napus)中的bar基因和EPSPS基因向野芥菜(B. juncea var. gracilis)流动的可能性。结果表明在人工授粉的情况下,以野芥菜为母本,分别以两种转基因油菜为父本,亲和性指数都很高,达13以上,与野芥菜自交或开放授粉条件下的亲和性指数没有明显差异,说明两种转基因油菜和野芥菜的亲和性较好。经两次除草剂筛选,人工杂交获得的所有F₁对相应的除草剂都表现出了明显的抗性,且经PCR检测扩增出了各自的特异性条带,说明人工杂交获得的所有F₁都携带了相应的抗性基因。F₁的适合度研究表明,两种F₁种子萌发率和母本都没有明显差异,营养生长明显好于母本。但花粉活力和结实率明显下降,携带抗草丁膦基因F₁的花粉活力和每角果粒数分别是32.4%和0.59粒,携带抗草甘膦基因F₁的花粉活力和每角果粒数分别是35.1%和0.58粒。经两次除草剂筛选和PCR检测,表明野芥菜和抗草丁膦油菜或与抗草甘膦油菜田间隔行种植分别能产生0.02%和0.014%的携带抗性基因的F₁杂种。以上结果表明抗除草剂转基因油菜的抗性基因具有向野芥菜流动的可能性,且bar和EPSPS基因向野芥菜流动的可能性类似,但对其可能引起的环境后果需要做进一步地深入研究。     

Bar基因和转Bar基因作物的研究进展

概述了草丁膦的毒害机理和 Bar基因的抗性机理与表达情况。总结了转 Bar基因作物的来源、抗性遗传特点和其对环境安全性评价等方面的研究进展。展望了 Bar基因和转 Bar基因作物的应用前景。     

水稻Act1启动子融合的bar基因在转基因燕麦T_3代中的表达

以微弹轰击法转化获得的含bar基因燕麦T3代为材料 ,运用Northernblot方法研究了bar基因在燕麦的不同生育阶段、不同叶位、以及Challenge(0 .2 0 % )处理后不同时间的叶片中mRNA水平的变化。结果表明 ,外源bar基因在燕麦的不同生育阶段、不同叶位、以及除草剂处理后转录水平没有明显差异。由于除草剂喷涂后 ,植株体内氨含量的变化能够反映bar基因编码的PAT酶活性的变化 ,因而测定了Challenge处理后不同时间、不同部位的叶片中氨含量的变化情况。结果发现 ,含bar基因的燕麦植株体内氨含量在除草剂处理后不同时间和不同部位都没有显著的变化 ,而对照植株体内氨的含量在除草剂处理后能迅速上升。这表明 ,含bar基因的燕麦植株体内由于PAT酶的稳定表达 ,而使氨的含量维持在较低水平。从转录和翻译两个层次上反映了水稻Act1启动子融合的bar基因在转基因燕麦T3 中能够稳定表达 ,且表达水平不受叶位和除草剂的影响     

草苷膦抗性新基因的克隆、序列分析及其蛋白高级结构预测

利用错误倾向PCR（error-prone PCR）突变技术,以可变盐单胞菌（Halomonas variabilis）HTG7的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶基因为模板进行随机PCR扩增,得到目的基因片段（约1.35 kb）.将该基因片段与pACYC184载体连接后转化EPSP合酶缺陷型菌株大肠杆菌ER2799.利用功能互补筛选法得到了2株不具有草苷膦抗性的EPSP合酶阳性克隆突变株,记为Pmu1和Pmu2.序列分析表明,突变体Pum1的EPSP合酶编码区与突变前基因相比,核苷酸有2处发生突变,导致氨基酸残基1处发生了改变;突变体Pmu2的EPSP合酶编码区与突变前基因相比,核苷酸有5处发生突变,导致氨基酸残基2处发生了改变.对突变前后EPSP合酶进行比较预测发现,其三级结构及蛋白中心骨架是大致相同的,但突变前后氨基酸位点肽平面和Cα相连的N键之间形成的扭转角度存在一定的差别.这些结果表明,酶的功能主要由蛋白的构象决定,二肽链形成后肽平面和N键之间角度的变化,造成高级结构构象细微的差别,致使草苷膦抗性功能丢失.     

水稻Act1启动子融合的bar基因在转基因燕麦T3代中的表达

以微弹轰击法转化获得的含bar基因燕麦T3代为材料,运用Northernblot方法研究了bar基因在燕麦的不同生育阶段、不同叶位、以及Challenge(0.20%)处理后不同时间的叶片中mRNA水平的变化。结果表明,外源bar基因在燕麦的不同生育阶段、不同叶位、以及除草剂处理后转录水平没有明显差异。由于除草剂喷涂后,植株体内氨含量的变化能够反映bar基因编码的PAT酶活性的变化,因而测定了Challenge处理后不同时间、不同部位的叶片中氨含量的变化情况。结果发现,含bar基因的燕麦植株体内氨含量在除草剂处理后不同时间和不同部位都没有显著的变化,而对照植株体内氨的含量在除草剂处理后能迅速上升。这表明,含bar基因的燕麦植株体内由于PAT酶的稳定表达,而使氨的含量维持在较低水平。从转录和翻译两个层次上反映了水稻Actl启动子融合的bar基因在转基因燕麦T3中能够稳定表达,且表达水平不受叶位和除草剂的影响。     

除草剂草铵膦对转基因抗草铵膦棉花生长发育的影响

【背景】草铵膦是继草甘膦之后又一种高效、广谱、低毒的非选择性除草剂,有望成为我国转基因抗除草剂棉花的主要靶标之一。目前,在抗草铵膦棉花的不同生育期使用草铵膦是否影响棉花生长发育尚不清楚。【方法】分别在抗草铵膦棉花子叶期、3~4片真叶期、现蕾期、盛花期喷施草铵膦,单次施药量分别为900和1800 g·hm-2,每个处理小区面积25.6 m2。分析草铵膦对花粉育性、棉花生长、产量及纤维品质的影响。【结果】喷施草铵膦对棉花盛花期的花粉活力、株高、茎直径、产量因子、纤维品质等各项参数均无显著性影响,在子叶期使用1800 g·hm-2的高剂量浓度处理时,籽指水平显著低于空白对照处理。【结论与意义】转基因抗草铵膦棉花对900、1800g·hm-2的草铵膦具有较好的耐受性。本研究为转基因抗草铵膦棉花的环境安全性评价提供了依据。     

PAT蛋白抑制饥饿诱导的脂滴快速融合

目的:脂滴快速融合是增大脂滴直径的方式之一,但其研究相对少。本研究旨在建立脂滴快速融合的细胞模型,以便对其进行深入的生物学研究。方法:本研究使用大鼠肾成纤维细胞系NRK和小鼠前脂肪细胞系3T3-L1两种细胞系,先用油酸诱导细胞内产生大量脂滴,再使用饥饿缓冲液培养细胞,利用显微镜实时观测技术跟踪脂滴动态变化,建立脂滴快速融合的模型。而后在此模型中,加入自噬抑制剂或者以过表达CCT为阳性对照,过表达PAT蛋白(PLIN1、ADRP和TIP47),来探究它们在调控脂滴快速融合方面的功能。结果:饥饿缓冲液处理约3小时可诱导细胞发生脂滴快速融合,其融合速率很快,从脂滴接触到融合完成可发生在20秒内,显然不同于CIDE蛋白调控的缓慢脂滴融合过程。自噬抑制剂可以抑制自噬,但是并没有显著影响脂滴快速融合,说明饥饿诱导的脂滴快速融合不依赖于自噬。另发现,与过表达GFP相比,过表达定位于脂滴的GFP-CCT、GFP-PLIN1、GFP-ADRP或GFP-TIP47均能显著性抑制快速融合导致的脂滴变大的现象。结论:本研究建立了饥饿缓冲液诱导脂滴发生快速融合的细胞模型,并证明PAT蛋白(PLIN1、ADRP、TIP47)能抑制脂滴快速融合。     

PAT proteins,an ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid stores

The PAT family of lipid droplet proteins includes 5 members in mammals: perilipin, adipose differentiation-related protein (ADRP), tail-interacting protein of 47 kDa (TIP47), S3–12, and OXPAT. Members of this family are also present in evolutionarily distant organisms, including insects, slime molds and fungi. All PAT proteins share sequence similarity and the ability to bind intracellular lipid droplets, either constitutively or in response to metabolic stimuli, such as increased lipid flux into or out of lipid droplets. Positioned at the lipid droplet surface, PAT proteins manage access of other proteins (lipases) to the lipid esters within the lipid droplet core and can interact with cellular machinery important for lipid droplet biogenesis. Genetic variations in the gene for the best-characterized of the mammalian PAT proteins, perilipin, have been associated with metabolic phenotypes, including type 2 diabetes mellitus and obesity. In this review, we discuss how the PAT proteins regulate cellular lipid metabolism both in mammals and in model organisms.     

Introduction and constitutive expression of a rice chitinase gene in bread wheat using biolistic bombardment and the bar gene as a selectable marker

 Our long-term goal is to control wheat diseases through the enhancement of host plant resistance. The constitutive expression of plant defense genes to control fungal diseases can be engineered by genetic transformation. Our experimental strategy was to biolistically transform wheat with a vector DNA containing a rice chitinase gene under the control of the CaMV 35 S promoter and the bar gene under control of the ubiquitin promoter as a selectable marker. Immature embryos of wheat cv ‘Bobwhite’ were bombarded with plasmid pAHG11 containing the rice chitinase gene chi11 and the bar gene. The embryos were subcultured on MS2 medium containing the herbicide bialaphos. Calli were then transferred to a regeneration medium, also containing bialaphos. Seventeen herbicide-resistant putative transformants (T₀) were selected after spraying with 0.2% Liberty, of which 16 showed bar gene expression as determined by the phosphinothricin acetyltransferase (PAT) assay. Of the 17 plants, 12 showed the expected 35-kDa rice chitinase as revealed by Western blot analysis. The majority of transgenic plants were morphologically normal and self-fertile. The integration, inheritance and expression of the chi11 and bar genes were confirmed by Southern hybridization, PAT and Western blot analysis of T₀ and T₁ transgenic plants. Mendelian segregation of herbicide resistance was observed in some T₁ progenies. Interestingly, a majority of the T₁ progeny had very little or no chitinase expression even though the chitinase transgene was intact. Because PAT gene expression under control of the ubiquitin promoter was unaffected, we conclude that the CaMV 35 S promoter is selectively inactivated in T₁ transgenic wheat plants. Received: 12 May 1998 / Accepted: 15 May 1998     

Structure,tissue expression pattern,and function of the amino acid transporter rat PAT2

The second member of the PAT (proton-coupled amino acid transporter) family of H(+)-coupled, pH-dependent, Na(+)-independent amino acid transporters was isolated from a rat lung cDNA library. The cDNA for rat PAT2 is 2396bp in length, including 70bp of 5'UTR and a poly(A) tail. The transporter gene, consisting of 10 exons, is located on rat chromosome 10q22. The cDNA codes for a protein of 481 amino acids with 72% identity (over 449 amino acids) with rat PAT1. Tissue expression studies demonstrate that mRNA abundance is generally low with highest levels being detected in lung and spleen, with lower levels in the brain, heart, kidney, and skeletal muscle. Functional expression in either mammalian cells or Xenopus laevis oocytes demonstrates that rat PAT2 mediates pH-dependent, Na(+)-independent uptake of glycine, proline, and alpha(methyl)aminoisobutyric acid (MeAIB). In conclusion PAT2 has a limited tissue distribution, higher affinity (Michaelis-Menten constant for glycine uptake between 0.49 and 0.69mM), and distinct substrate specificity compared to PAT1.     

hpt与bar基因作为水稻转基因筛选标记的比较研究

标记基因的选择是影响植物遗传转化和转基因后代筛选成败的关键因素。hpt与bar作为两种常用的水稻转化筛选标记被广泛应用于水稻的转化。为比较两者在实际应用中的效果, 文章首先对比了在潮霉素和除草剂(Bialaphos)两种筛选剂下水稻遗传转化的情况。研究表明, hpt基因的转化筛选体系相对于bar基因在转化效率上提高近两倍, 转化周期提前至少10 d, 且插入基因拷贝数更低。随后, 文章分析了利用潮霉素浸种法在田间筛选转基因水稻的可行性, 研究显示当潮霉素浓度大于167 mg/L时, 可以对以水稻品种kitaake为亲本的转基因材料进行有效筛选, 达到常规除草剂的筛选效果。但与除草剂相比较, 潮霉素的田间筛选成本却处于劣势。文章研究和讨论了hpt和bar基因在遗传转化和后代田间筛选中的优缺点, 并提供了一种利用潮霉素浸种法筛选转基因后代阳性植株的手段, 为将来在水稻转基因研究工作中根据实际需求选择合适的遗传转化、筛选体系提供参考。     

基于PAT的PCV2 VLPs生产过程优化与控制研究

昆虫细胞-杆状病毒载体表达系统(baculovirus expression vector system,BEVS)是病毒样颗粒亚单位疫苗(virus like particles,VLPs)的理想生产平台。动物细胞培养过程分析技术(process analytical technology,PAT)研究的重点在于更多地获取与细胞生理状态相关的过程参数,以及实现过程敏感参数的在线表征和过程控制关键时间节点的在线判定,从而指导过程优化和控制。通过昆虫Sf9细胞的分批和补料悬浮培养,发现细胞代谢活性与在线特征频率(fc)之间存在相关性。以fc作为细胞代谢活性的在线指征,在细胞代谢活性下降之前补料,使得Sf9细胞在代谢活性明显增强的基础上,最高活细胞密度提高1.75倍。通过分批培养与补料分批培养过程细胞生理特性参数的相关性分析,发现比电容增长速率(με)与培养体系S-期细胞比例之间存在相关性,με作为细胞增殖活性状态的在线指征参数,可以作为最佳接毒时间的判定依据。此外,研究还发现在线检测参数电容(ε)与最高疫苗产量之间存在相关性,可以作为疫苗最佳收获时间的在线表征参数。以在线fc值作为补料时间指征,以在线με值作为病毒感染时间指征,以在线ε值作为病毒收获时间指征,实现了猪圆环病毒2型(PCV2)VLPs的高效生产。相比于批培养,基于PAT的生产工艺疫苗单位体积产量提高76%,生产周期缩短了24h,为PCV2病毒样颗粒亚单位疫苗大规模生产提供了一种新的高效生产模式。     

基因工程植物的安全性问题

转基因植物的研究进展很迅速,但基因工程植物是否安全一直争论不休,主要表现在转基因食品的安全性及生态安全性问题上.转基因食品的安全性涉及这些食品的过敏性、毒性以及抗生素标记基因的安全性几个方面.转基因植物的生态安全性包括基因漂流、是否能诱发昆虫产生Bt抗性和对生物多样性的影响等.本文针对这些问题,对转基因植物潜在危害以及国际上现有的评价作简要综述.