RT—PCR法检测我国东南沿海凡纳滨对虾的桃拉综合征病毒

桃拉综合征病毒（Taura syndrome virus,TSV）引致养殖及野生对虾急性传染病,14d至40d的幼虾极易感。该病毒属微RNA病毒科（Picornaviridae）,近年来研究者认为应归类为类蟋蟀麻痹病毒属（Cricket paralysis—like viruses）,因其基因组特征更接近于前所未分类的昆虫单股RNA病毒,如丙型果蝇病毒。     

RT-PCR法检测我国东南沿海凡纳滨对虾的桃拉综合征病毒

桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus,TSV)引致养殖及野生对虾急性传染病,14d至40d的幼虾极易感.该病毒属微RNA病毒科(Picornaviridae)[1],近年来研究者认为应归类为类蟋蟀麻痹病毒属(Cricket paralysis-like viruses),因其基因组特征更接近于前所未分类的昆虫单股RNA病毒,如丙型果蝇病毒[2].     

多重RT-PCR同时检测鉴别三种对虾病毒的研究与应用

根据基因库中对虾桃拉综合征病毒（TSV）、白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）的基因序列,分别设计了三对特异性引物,通过对多重RT—PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别TSV、WSSV和IHHNV的多重RT—PCR。该技术对同一样品中的TSV RNA、WSSV DNA和IHHNV DNA模板进行扩增,结果均同时得到3条大小与实验设计相符的231bp（TSV）、593bp（WSSV）和356bp（IHHNV）的特异性多重RT—PCR扩增带,对其它对虾病原核酸的扩增结果为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到10pgTSV RNA、100pg WSSV DNA和100pg IHHNV DNA。临床检测试验结果表明,该技术对TSV、WSSV和I—HHNV的检出率明显高于传统的临床症状观察和组织病理学检查,提示该技术适用于这三种病毒的临床快速检测和鉴别诊断。     

对虾白斑综合征病毒的细胞因子受体基因的分析与表达

在对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)的基因组中发现一个具有细胞因子受体特征的开放阅读框,该阅读框全长2022个核苷酸,编码674个氨基酸,蛋白质理论分子量为76kDa.该基因含有真核生物细胞因子gpl30受体特征序列.为了研究该基因的功能,采用PCR方法从病毒基因组中扩增出基因片段,克隆到pGEM-T Easy载体中,经BamH I和Sal I双酶切后插入pET28b表达载体中.重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳表明在76kDa处有目的蛋白表达.用冰浴超声波对诱导后的菌液进行处理以获得初步纯化的蛋白,作为抗原人工免疫实验兔子以获得含特异性抗体的抗血清.该基因的表达成功,为其功能的进一步深入研究奠定了基础.     

对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP110 N端结构特征、原核表达及检测

VP110为对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的囊膜蛋白。相似性分析发现,VP110与昆虫DNA病毒经口感染关键因子PIF2具同源性,且同源区主要位于N端150~600aa。同时两者均在N端前端含一个跨膜区。为了研究VP110 N端保守区的功能,将vp110 N端基因(Svp110,450~1 830 bp)克隆至p ET-16b及p GEX-4T1原核表达载体中,同时分别在大肠埃希菌BL21(DE3)、Rosetta 2菌株中优化表达条件,诱导VP110 N端蛋白(s VP110)表达。实验结果表明,重组质粒p ET-16b-Svp110在37℃1 mmol/L IPTG条件下可得到表达,但16℃下表达量很低。而重组质粒p GEX-4T1-Svp110则在16℃下得到较高表达。同时,Rosetta 2菌株的表达量高于BL21(DE3)。该研究表明Rosetta 2菌株更适合作为WSSV结构蛋白的表达,同时VP110在不同载体中的表达受温度的影响。VP110 N端蛋白的表达为VP110的功能研究打下了基础。     

对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP19的融合表达及其抗病毒感染作用

根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因vp 19的序列,设计并合成引物,PCR扩增得到vp19基因并克隆到pGEM‐T载体中,经过BamHⅠ/Hind Ⅲ酶切、连接并将vp19插入到pET32b表达载体中.用重组质粒pET32b-vp19转化大肠杆菌Origami(DE3)pLysS,在IPTG诱导下,融合蛋白Trx-VP19以可溶性的形式得到表达,经SDS-PAGE和Western-blot检测显示其分子量与预期的大小相符合.目的蛋白经Ni2+柱纯化并定量后分别直接注射鳌虾和包被饲料投喂鳌虾.实验结果表明注射Trx-VP19可以提高鳌虾个体抗WSSV感染力的作用.     

对虾白斑综合症病毒结构蛋白60B的原核表达和其基本氨基酸序列的初步分析

VP60B是对虾白斑综合症病毒(WSSV)中含量很少的一个结构蛋白。VP60B的一段序列与腺病毒纤维蛋白(Adenovirus type 5 fiber protein)的knob domain的一段序列具有同源性。本试验将VP60B基因克隆到原核表达系统中,在低温条件下,诱导了VP60B蛋白的表达。结果显示VP60B在该系统主要是以包含体的形式存在。原核表达的VP60B不能被鼠抗WSSV多克隆血清所识别,预示该蛋白的免疫原性较弱。通过对VP60B氨基酸序列的分析,发现有一个跨膜区,这预示着该蛋白可能位于WSSV病毒的囊膜上。     

抗对虾白斑综合症病毒的单链抗体A1的表达和生物化学特性

用噬菌体展示技术制备了抗对虾白斑综合症病毒(WSSV)的单链抗体A1。该抗体在30℃培养条件下诱导表达20h后,其蛋白表达量可达总菌体蛋白的3.67%。用亲和层析柱和SephadexG-100层析柱可将单链抗体A1纯化为一条单电泳条带,其分子量约为31.5kD。用等电聚焦电泳测定,其等电点为pH5.8。ELISA测定表明冻干的单链抗体A1在室温储藏4年后与WSSV结合仍具有较高的活力。       

对虾白斑综合征杆状病毒同源性比较的研究

比较我国沿海不同海域对虾白斑综合征杆状病毒三个分离株：即唐海分离株（渤海湾）、宁波分离株（东海）,深圳分离株（南海）的同源性。三个WSSV分离株基因组的限制笥内切酶（Sac Ⅰ,HindⅢ,PstⅠ）酶切多态（RFLP）以及病毒结构蛋白图谱完全一致,证实造成我国从南对北对虾爆发性流行病的对虾白斑杆状病毒为同一种病毒。利用高保真Taq酶,分别以报道的日本对虾杆状病毒（RV－PJ－PRDV）,斑节对虾白斑综合征杆状病毒（WSBV－PmNOBⅢ）基因组核酸片段特异性引物进行PCR扩增,结果均能从中国一杆状病毒（WSSV）基因组中扩增得到相应大小的PCR产物,扩增产物序列分析表明中国对虾白斑杆状病毒（WSSV）与斑节对虾白斑综合征杆状病毒（WSBV－PmNOBⅢ）,日本对虾相状RV-PJ=PRDV)同源率分别为100％与97％,其结果为证实亚洲及太平洋地区对虾白斑综合征杆状病毒为同一种病毒或同一种病毒的不同株系提供了依据。     

对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP19的融合表达及其抗病毒感染作用

根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因vp19的序列,设计并合成引物,PCR扩增得到vp19基因并克隆到pGEM‐T载体中,经过BamHⅠ/HindⅢ酶切、连接并将vp19插入到pET32b表达载体中。用重组质粒pET32b-vp19转化大肠杆菌Origam(iDE3)pLysS,在IPTG诱导下,融合蛋白Trx-VP19以可溶性的形式得到表达,经SDS-PAGE和Western-blot检测显示其分子量与预期的大小相符合。目的蛋白经Ni2 柱纯化并定量后分别直接注射鳌虾和包被饲料投喂鳌虾。实验结果表明注射Trx-VP19可以提高鳌虾个体抗WSSV感染力的作用。     

对虾白斑综合症病毒重组cDNA克隆的构建与分析

取经人工注射感染了对虾白班综合症病毒40-45h的凡纳对虾鳃组织,分离mRNA,以mRNA为模板合成双链cDNA,并克隆于PUC质粒的Not I/Sal I位点,构建了1000余株对虾感染后期鳃细胞的重组cDNA克隆,重组质粒经PCR鉴定插入片段,DNA斑点杂交分析目的片段,测定了20株对虾白斑综合症病毒的重组cDNA克隆的末端DNA序列,并对其进行了包含存在的开放阅读框架,启动区上游序列、编码产物的特性等分析。结果显示,PCR产物在0.3-1.6kb之间;大于1kb的克隆中有31.8%的克隆为白斑综合症病毒的重组cDNA克隆。已测序的不包含同源序列的13株克隆中含有14个开放阅读框,其中11个上游可检出启动子基序,4个可检出启动子调制元件,ORF转译产物的特性基序分析显示,有2个ORFs可检出锌指基序,3个ORFs可检出亮氮酸拉链基序,2个ORFs可检出NTP结合基序,未检定核定位信号基序。     

对虾白斑综合症病毒结构蛋白VP28的原核表达和性质研究

VP2 8是对虾白斑综合症病毒 (Whitespotsyndromevirus ,WSSV)的一个重要的囊膜蛋白。为了便于研究VP2 8在和宿主细胞相互作用过程中扮演的角色 ,将VP2 8基因克隆到一个原核表达系统 ,对原核表达的VP2 8的特性进行了研究 ,并制备了抗VP2 8的多克隆抗体和单链抗体 ,对原核表达的和天然病毒的VP2 8蛋白免疫原性进行了比较。结果表示 ,原核表达的VP2 8与天然蛋白具有相似的免疫原性。     

一种筛选对虾白斑综合症病毒中和抗体的新方法

用对虾淋巴组织的原代培养细胞与对虾白斑综合症病毒进行相互作用,洗去不能结合的病毒,然后用甲醛固定,再用ELISA法检测所吸附的病毒。当病毒与抗血清保温后,抑制病毒与细胞的吸附能力的抗血清中应含有中和抗体。此方法可以在缺少细胞的情况下,简便地筛选到中和抗体。     

抗对虾白斑综合症病毒单链抗体A1基因在酵母中表达及其与抗原结合活性

通过PCR从噬菌粒载体上扩增一种抗对虾白斑综合症病毒 (WSSV)的单链抗体A1(ScFvA1)基因 ,并构建于大肠杆菌 酵母穿梭质粒载体pPIC9K上。经PCR ,酶切 ,测序鉴定重组克隆 ,发现重组成功。将重组质粒pPIC9K ScF vA1转化毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115中 ,利用甲醇诱导 ,将单链抗体A1在酵母中进行了初步表达。经SDS PAGE电泳 ,发现其大小约为 32KD ,通过ELISA实验 ,证明表达上清液中的单链抗体具有很高的WSSV结合活性。     

枯草芽孢杆菌表达的VP28 对南美白对虾免疫力和抗病毒感染的影响

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红螯光壳螯虾白斑综合症血液病理学研究

采用Wright-Geimsa染色法和电镜技术对人工感染的红螯光壳螯虾(Cherax quadricarinatus)白斑综合症(White spot syndrome,WSS)血液病理学进行了研究。结果显示:患病螯虾血细胞总数、透明细胞(AH)数量极显著减少(P<0.01),大颗粒细胞(LGH)极显著增加(P<0.01);病毒感染后3种血细胞大小均有增加趋势,透明细胞和大颗粒细胞的核质比(NP)较感染病毒前极显著下降(P<0.01)。显微病理学变化主要表现为血涂片中血细胞明显减少,病变、破损或解体的细胞增多,至濒死期螯虾血液呈典型的溶血状态。超微病理学变化表现为血细胞受到了损伤。高尔基体变形、线粒体结构模糊破损;核膜变形核固缩、细胞核高度异染色质化;濒临死亡的螯虾血细胞细胞器和染色质溶解,胞浆水肿,细胞溶解坏死。在患病螯虾的血细胞核中清晰可见WSSV粒子。     

大豆花叶病毒种子传毒率测定方法的比较

用苗期症状观察和酶联免疫吸附试验(ELISA)两种方法检查了大豆种子内的大豆花叶病毒(sMV)的传毒率及带毒率,并对两种方法所得的结果进行了比较。带毒大豆种子产生的病苗,其症状主要有花叶、卷叶、叶脉束状、叶脉坏死、凸斑和单叶扭曲等类型。苗期症状观察得到的种子传毒率,与用ELISA法检查去种皮大豆种子的带毒率高度吻合,相关系数r=0.92(n=31),说明此两种方法检查种子传(带)毒率具有相同的生物学和病理学意义。 本文提出了种子“群体病毒浓度”的概念。“群体病毒浓度”=群体内病毒总量/群体内种子总数。38个处理组合和3,591粒种子逐粒用ELISA法检查表明,“群体病毒浓度”与该群体的种子传毒率呈正相关,r=0.93(n=38)。将种子群体作为一个整体用ELISA法检查的结果也证明,“群体病毒浓度”与种子传毒率呈直线相关。因此认为可以用ELISA法对种子群体直接进行测定来估计种子的传毒率。     

应用PCR扩增对分枝杆菌分类鉴定及标本检测的研究

用对结核分枝杆菌特异性很强的引物 b对 2 1种分枝杆菌和 13种非分枝杆菌进行 PCR扩增 ,并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果表明 :受试菌种用引物 b在退火温度 6 1℃时 ,扩增的敏感性为 50 fg,且只能扩出结核分枝杆菌、胃分枝杆菌 ,且他们扩增片段的分子量也不相同。可见 ,用引物 b,必要时辅以引物a,对分枝杆菌 16 S～ 2 3S r DNA间隔区序列进行扩增 ,可以快速有效地鉴定分枝杆菌临床分离株 ,是分枝杆菌鉴定的一种新方法。     

辐照白酒对其理化指标影响的研究

利用（６０）Ｃｏ─γ射线辐照市售散装白洒（６０°）,处理剂量为０．８ｋＧｙ、２．０ｋＧｙ、４．０ｋＧｙ,剂量率为３．３３Ｇｙ／ｍｉｎ,在贮存不同时间后,检验其理化及感官指标。结果表明,经γ射线辐照的白洒,总酸、总酯等有益成分均有不同程度增加,其感官指标也比对照组好,尤其以辐照剂量２．０ｋＧｙ的处理组最佳,且辐照后贮存一定时间,其陈化效果更好。