利用大肠埃希菌生产N-糖基化重组蛋白研究进展

利用大肠埃希菌生产N-糖基化重组蛋白已经成为糖工程研究热点之一。由于真核生物系统生产N-糖基化蛋白普遍存在培养周期长、过程复杂及所需成本高的问题,因此遗传背景清晰、培养周期短、所需成本低的大肠埃希菌作为生产蛋白质药物的工具越来越受到关注,在生产治疗性N-糖基化蛋白方面具有很大的潜力。本文介绍了大肠埃希菌生产N-糖基化重组蛋白的机制,综述了利用大肠埃希菌生产N-糖基化重组蛋白及糖疫苗的研究进展,对值得进一步深入研究的问题进行总结和展望,以期为后续构建稳定高效的大肠埃希菌生产N-糖基化重组蛋白系统提供参考。     

红花石蒜苯丙氨酸解氨酶催化合成N-甲基-L-苯丙氨酸

[背景] N-甲基-L-苯丙氨酸是一种N-烷基化芳香氨基酸,是重要的手性合成单元/中间体/组成成分,在医药、农业、食品等领域有重要应用价值的代谢产物中广泛存在。N-烷基化芳香氨基酸的合成与制备仍具有巨大的挑战。[目的] 在研究加兰他敏的生物合成过程中,我们从产加兰他敏的红花石蒜中克隆并表征苯丙氨酸解氨酶LrPAL3。LrPAL3催化区域及对映选择性的氢胺化反应得到L-苯丙氨酸。通过生物信息学分析,推测LrPAL3可能催化反式-肉桂酸的一步N-甲基胺化反应得到N-甲基-L-苯丙氨酸。[方法] 将反式-肉桂酸与甲胺,以及表达LrPAL3的大肠杆菌全细胞一起孵育。HPLC-DAD及HRESIMS分析表明,上述反应产物为N-甲基-苯丙氨酸。为确定该产物的立体构型,将上述催化反应放大,通过分离纯化得到该酶催化反应产物。[结果] 该化合物的氢谱数据及比旋光数据与N-甲基-L-苯丙氨酸标准品的数据一致。由此说明,LrPAL3能够催化反式-肉桂酸和甲胺发生N-烷基胺化反应,区域和立体专一性地生成N-甲基-L-苯丙氨酸。[结论] 本研究为手性N-烷基氨基酸的不对称合成提供了一种全新的绿色、高效生物催化剂。通过对LrPAL3的蛋白质定向进化及代谢工程,将会进一步扩展LrPAL3的催化反应范围,以多种N-烷基胺类及取代的苯基丙烯酸为底物,实现手性N-烷基-芳基氨基酸的高效区域及立体选择性生物合成。     

枯草芽孢杆菌中高效响应N-乙酰神经氨酸生物传感器的构建

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是公认的食品安全菌株,目前已被用于多种高附加值产品的生物合成,包括被广泛用作营养化学品和药物中间体的N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid, NeuAc)。响应目标产物的生物传感器被广泛用于代谢工程中的动态调控和高通量筛选等方面,以提高生物合成效率。但是,枯草芽孢杆菌中缺乏可高效响应NeuAc的生物传感器。因此,本文首先测试和优化了能将胞外NeuAc转运进胞内的转运蛋白,获得了一系列具有不同转运能力的菌株,以用于后续响应NeuAc的生物传感器的验证;随后将响应NeuAc的转录因子Bbr_NanR的结合位点插入枯草芽孢杆菌组成型启动子的不同位置,筛选具有活性的杂合启动子;接下来,通过在具有NeuAc转运能力的枯草芽孢杆菌中表达Bbr_NanR,选择能响应NeuAc的杂合启动子,并进一步通过优化Bbr_NanR表达量获得了一系列动态范围广、激活倍数高的生物传感器,其中生物传感器P535-N2能灵敏地响应胞内NeuAc浓度的变化,具有最大的动态范围,为(180–20 245) AU/OD;P566-N2则具有最高的激活倍数,为122倍,是已报道的枯草芽孢杆菌中响应N-乙酰神经氨酸的生物传感器的2倍。本文构建的响应NeuAc的生物传感器可用于高产NeuAc的酶突变体和枯草芽孢杆菌菌株的筛选,为枯草芽孢杆菌生物合成NeuAc提供了高效、灵敏的分析和调控工具。     

Regioselective monoacylation of 2-O-α-d-glucopyranosyl-l-ascorbic acid by a polymer catalyst in N,N-dimethylformamide

6-O-Dodecanoyl-2-O-α-d-glucopyranosyl-l-ascorbic acid (6-sDode-AA-2G) was synthesized from 2-O-α-d-glucopyranosyl-l-ascorbic acid and lauric anhydride with a polymer catalyst, poly(4-vinylpyridine), in N,N-dimethylformamide without the introduction of protecting groups. The optimum reaction conditions enabled 6-sDode-AA-2G to be synthesized in a yield of 49.7%. The yield and the regioselectivity in this method were far superior to those in our previous method by using an enzyme. The polymer catalyst could be recycled more than five times without any significant activity loss.     

Detection and quantification of α-keto-δ-(N,N-dimethylguanidino)valeric acid: A metabolite of asymmetric dimethylarginine

Nitric oxide is an ubiquitary cell signaling substance. Its enzymatic production rate by nitric oxide synthase is regulated by the concentrations of the substrate l-arginine and the competitive inhibitor asymmetric dimethylarginine (ADMA). A newly recognized elimination pathway for ADMA is the transamination to α-keto-δ-(N^G,N^G-dimethylguanidino)valeric acid (DMGV) by the enzyme alanine-glyoxylate aminotransferase 2 (AGXT2). This pathway has been proven to be relevant for nitric oxide regulation, but up to now no method exists for the determination of DMGV in biological fluids. We have developed a liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) method for the quantification of DMGV. D₆-DMGV was used as internal standard. Samples were purified online by column switching, and separation was achieved on a porous graphitic carbon column. The calibration was linear over ranges of 10 to 200 nmol/L for plasma and 0.1 to 20 μmol/L for urine. The intra- and interday accuracies and precisions in plasma and urine were better than 10%. In plasma samples, DMGV was present in concentrations between 19.1 and 77.5 nmol/L. In urine samples, concentrations between 0.0114 and 1.03 μmol/mmol creatinine were found. This method can be used as a tool for the scientific investigation of the ADMA conversion to DMGV via the enzyme AGXT2.     

Two Critical Factors Affecting the Release of Mitochondrial Cytochrome c as Revealed by Studies Using N,N′-Dicyclohexylcarbodiimide as an Atypical Inducer of Permeability Transition

N,N′-dicyclohexylcarbodiimide (DCCD) was earlier reported to have stimulatory effects on mitochondrial respiration and to induce mitochondrial swelling, when it was added to mitochondrial suspensions. These data seem to imply that DCCD caused the mitochondrial permeability transition (PT), but this possibility had never been investigated. In the present study, effects of DCCD on the mitochondrial structure and function were studied in detail. DCCD was found to induce mitochondrial PT in a cyclosporine A-insensitive manner. Electron microscopic analysis also supported the induction of the mitochondrial PT by DCCD. However, different from many other PT inducers, DCCD failed to cause massive release of mitochondrial cytochrome c. To understand the relationship between the induction of mitochondrial PT and the release of mitochondrial cytochrome c, we compared the actions of DCCD on mitochondrial structure and function with those of Ca²⁺, known as an ordinary PT inducer. As a result, two parameters considered to be critical for controlling the release of mitochondrial cytochrome c on the induction of PT were mitochondrial volume and the velocity of mitochondrial oxygen consumption.     

植物咖啡酸-O-甲基转移酶的研究进展

单木质素醇(H型、G型和S型)是构成植物木质素和木脂素的基本单元,其组成的不同直接决定木质素和木脂素的化学多样性和生物活性差异。咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeic acid O-methyltransferase, COMT)可催化苯丙素类化合物羟基上氧原子的甲基化,在不同类型单木质素醇的构成中起决定作用,是木质素和木脂素生物合成途径的关键酶。2010年的相关综述主要对COMT的基因特征和在木质素生物合成中的调控作用作了介绍,文中聚焦了近十多年来COMT的最新研究进展,从基因特征、表达特征、结构特征和调控作用几个方面进行全面综述,并对COMT的研究和应用前景进行展望。     

不同季节艾比湖湿地盐角草根际nirS-型与nirK-型反硝化细菌群落组成分析

旨在了解艾比湖湿地盐生植物盐角草根际与非根际中不同类型反硝化细菌的分布及其随季节变化情况,为温带干旱地区荒漠盐化生态系统的代表-艾比湖湿地在生态植被恢复过程中,由微生物推动的土壤氮素循环过程提供数据支撑。采集了艾比湖湿地夏、秋、春三个季节的盐角草根际和非根际土壤样本,通过高通量测序技术,比较分析了nirS-型和nirK-型两种类型的反硝化细菌的多样性和群落结构特点;利用RDA (redundancy analysis)探究了土壤理化因素对反硝化细菌多样性及群落结构的影响。艾比湖湿地盐角草根际与非根际中,nirS-型和nirK-型反硝化细菌多样性最高的为秋季根际土壤样本;各土壤样本中的反硝化细菌多样性均呈现根际>非根际。盐角草各土壤样本中的nirS-型反硝化细菌在门分类水平上隶属于变形菌门(Proteobacteria),厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria),而nirK-型反硝化细菌在门水平上分类仅包括了Proteobacteria和Firmicutes。Proteobacteria在各土壤样本中的占比均较高;其中Gamma-Proteobacteria的盐单胞菌属(Halomonas)和假单胞菌属(Pseudomonas)是各土壤样本所共有的nirS-型反硝化菌的优势菌属,但它们在每个土壤样本中的相对丰度各有差异。Alpha-Proteobacteria的根瘤菌属(Rhizobium)是盐角草各土壤样本中较为广泛存在的nirK-型反硝化细菌。艾比湖湿地盐角草各土壤样本中的反硝化细菌群落结构存在着一定的差异。RDA结果显示含水量、有机质、全氮和铵态氮等对各土壤样本中的nirS-型反硝化细菌的多样性影响较大,含水量、有机质、全氮、碱解氮等是nirK-型反硝化细菌多样性的主要影响因素。土壤电导率、全磷、全钾、全氮和碱解氮协同影响nirS-型反硝化细菌的群落结构,有机质、速效钾、速效磷、pH和硝态氮是nirK-型反硝化细菌群落结构组成的主要影响因素。艾比湖湿地反硝化细菌呈现季节性变化,nirS-型和nirK-型反硝化细菌以不同的主要菌属,共同推进湿地反硝化作用。而对于湿地生态系统的保护,则需要进行长期而广泛的土壤状态评估和土壤反硝化微生物菌群的动态监测。     

肺炎链球菌荚膜多糖O-乙酰化修饰的研究进展

肺炎链球菌表面覆盖着一层荚膜,由多糖组成,是肺炎链球菌关键的毒力因子和重要的抗原,也是细菌分型的依据。强毒血清型的荚膜多糖被制成糖疫苗在抗感染方面发挥了巨大作用。荚膜多糖结构复杂,经常被O-乙酰化修饰,这些多变的化学修饰扮演着重要的生物学角色。本文对肺炎链球菌荚膜多糖O-乙酰化修饰的研究进展进行了介绍,包括荚膜多糖的遗传基础、合成途径和血清学特征,荚膜多糖的O-乙酰化修饰的化学结构及其相应的O-乙酰基转移酶,O-乙酰化修饰的化学鉴定和生物学功能。同时,我们也总结了多糖O-乙酰化修饰在肺炎链球菌微进化中的作用和对糖疫苗的影响,并对今后的研究进行了展望。本综述旨在为研究荚膜多糖的O-乙酰化修饰的致病机制奠定基础,也为糖疫苗的设计提供指导。     

鼠mPC-1基因的克隆与特性分析

为深入研究人前列腺癌相关基因PC-1的生物功能和进化保守状况,从小鼠肾脏中克隆了全长cDNA序列,命名为mPC-1（GenBank Acc No.AY048852）.mPC-1基因cDNA全长为2 193 bp,主要定位于小鼠染色体3A1-A2区域.mPC-1基因最大开放阅读框编码的蛋白质由224个氨基酸组成,与人PC-1蛋白编码区存在82%的序列一致性,含有coiled-coil结构域和PEST结构域.生物信息学分析表明,由6个外显子组成的mPC-1基因与mD52高度同源,其中,第一外显子代表该基因的特异性序列,实验证据显示mPC-1基因具有自己的启动子,推测mPC-1与小鼠mD52可能是重叠基因.对小鼠20种组织器官和不同发育阶段的胚胎组织cDNA的RT-PCR检测证实,该基因主要在前列腺、肾和眼组织中表达,在胃和平滑肌中有少量表达,在其他组织中表达很弱或不表达.而mD52基因则几乎广泛存在于小鼠的各个组织器官中,因此,两个基因虽然序列上高度重叠却是独立调控的.综上所述,mPC-1基因可能是一个与人PC-1基因结构功能类似的新基因.     

辅因子S-腺苷-L-甲硫氨酸甲基类似物及其应用

甲基化在生物学过程中发挥着重要作用。S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM)作为一种广泛存在于生命体中的辅因子,是大多数生物甲基化反应的甲基供体。SAM依赖型甲基转移酶(methyltransferases, MTase)通过将甲基从SAM分子特异性转移到底物,从而改变底物分子的各种理化性质和生物活性。近年来,许多具有替代甲基取代基的SAM类似物被合成并应用于甲基转移酶,以将不同修饰的基团特异性地转移到甲基转移酶的底物上,从而引入标记官能团或者新的烷基修饰。本文主要综述了近年来该领域不同SAM甲基类似物在合成和应用方面取得的进展,并对这一领域未来的研究方向进行展望。     

一种高R-选择性水解R,S-甲霜灵的酯酶基因的克隆表达及表征

[目的] 将一种可以高选择性水解R-甲霜灵的新脂酶基因,在大肠杆菌中进行克隆和表达,并研究重组脂酶的性质。[方法] 根据已知的目标酯酶N端10个氨基酸序列,在已测序的Albibacters sp. zjut528基因组中找到相匹配的一个酯酶基因,它全长969 bp,编码322个氨基酸,将该基因命名为RMest。通过引物扩增得到该基因的DNA片段,将它与表达载体pET-28a（+）连接后,转化大肠杆菌BL21Gold（DE3）,构建重组菌,IPTG诱导表达该酯酶,并用Ni²⁺亲和层析介质进行纯化。[结果] 在重组菌RMest-pET-28a（+）-E.coli BL21 Gold（DE3）中成功表达了重组酯酶RMesterase,大小约为46 kDa。用胞内重组酶液催化水解R,S-甲霜灵,底物浓度10 g/L,反应6 h,底物转化率为49.8%,产物（甲霜灵酸）的ee_p为99.3%,对底物的对映体R-构型具有专一（选择）性。该酶最适温度和pH分别为40℃和pH 9.0。该酶的活性受到产物甲醇的抑制。通过Blast+在Uniprot KB数据库中搜寻与酯酶RMest同源的蛋白,采用邻近法构建该酶的蛋白系统发育树,结果显示它与某些Lysophospholipase、AB hydrolase-1 domain-containing protein和Esterase的同源性最高,但是与它们均存在较大的进化距离,表明该酶是一种相对独立进化的新酯酶。[结论] 在大肠杆菌中成功克隆和表达了一种新的脂酶基因RMest,重组酯酶RMesterase可以高手性选择性水解R,S-甲霜灵生成R-甲霜灵酸。     

我国巴马小型猪SLA-2基因克隆及分子特征

为研究我国巴马小型猪SLA-Ⅰ分子特征,设计引物克隆了SLA-Ⅰ类分子SLA-2基因（SLA-2*bm）,并通过分子生物学软件分析其分子特征。经克隆及序列测定分析,SLA-2*bm为1119bp,其中3～1097为ORF区,共编码364个氨基酸,分别在第125、188、227和283位置出现半胱氨酸残基,含有两对链内二硫键。氨基酸同源性分析显示SLA-2*bm与其它SLA-2、 SLA-3和SLA-1序列的同源率分别为88.4%～96.4%、88.3%～90.5%和87.7%～92.7%。系统进化树显示SLA-2*bm与其它SLA-2等位基因在遗传关系上相对独立,进化程度较低;各功能区分析,SLA-2*bm与人HLA-A2和小鼠H-2K分子结构相似,且保留了人HLA-A2基因的部分功能位点。结果表明,SLA-2*bm属于一个新的等位基因,巴马小型猪是保留原始基因特征的品种。     

我国巴马小型猪SLA-2基因克隆及分子特征

为研究我国巴马小型猪SLA-Ⅰ分子特征,设计引物克隆了SLA-Ⅰ类分子SLA-2基因（SLA-2*bm）,并通过分子生物学软件分析其分子特征。经克隆及序列测定分析,SLA-2*bm为1119bp,其中3～1097为ORF区,共编码364个氨基酸,分别在第125、188、227和283位置出现半胱氨酸残基,含有两对链内二硫键。氨基酸同源性分析显示SLA-2*bm与其它SLA-2、 SLA-3和SLA-1序列的同源率分别为88.4%～96.4%、88.3%～90.5%和87.7%～92.7%。系统进化树显示SLA-2*bm与其它SLA-2等位基因在遗传关系上相对独立,进化程度较低;各功能区分析,SLA-2*bm与人HLA-A2和小鼠H-2K分子结构相似,且保留了人HLA-A2基因的部分功能位点。结果表明,SLA-2*bm属于一个新的等位基因,巴马小型猪是保留原始基因特征的品种。     

Isoforms of an N-acetyl-β-d-glucosaminidase from the Antarctic krill, Euphausia superba: purification and antibody production

Two forms of the chitinolytic enzyme N-acetyl-β- -glucosaminidase (NAGase, EC 3.2.1.52) have been isolated from the Antarctic krill, Euphausia superba, in order to study their potential role in temperature adaptation processes. A chromatographic protocol was developed that allowed complete separation of the two enzyme forms, named NAGase B and NAGase C. The latter was purified to homogeneity with 600-fold enrichment and a yield of 17%. The molecular mass was 150 kDa. NAGase B showed characteristics of a glycoprotein due to affinity towards concanavalin A sepharose, while NAGase C did not. Highly specific polyclonal antibodies to NAGase C [anti-(E. superba-NAGase C)-IgG] showed only negligible cross-reactivity with NAGase B isoforms. A comparison with the Northern krill, Meganyctiphanes norvegica, revealed a corresponding chromatographic pattern with two main activity peaks, for differentiation named NAGase II and NAGase III. Application of the antibody on M. norvegica revealed a high specificity toward NAGase III and a low cross-reactivity with NAGase II. First indication is given that the two forms are no isoenzymes in a strict sense but instead may have different functions in the metabolism of krill.     

甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-3的ISSR分子标记

以甜瓜抗病资源PI511890和感病自交系‘白皮脆’及其F1、BC1P1、BC1P2、F2群体为材料,苗期接种蔓枯病菌(Did ymella bryoniae)进行遗传分析.结果表明:(1)对甜瓜苗期蔓枯病菌接种鉴定结果显示,抗源PI511890的抗病基因Gsb-3由显性单基因控制.(2)利用集团分离分析及ISSR分析技术,引物ISSR-100扩增出的多态性条带与Gsb-3表现连锁关系,该多态性片段大小为900 bp.(3)统计ISSR-100在182个F2单株上的多态性,并用JoinMap 4.0软件分析结果显示,ISSR-100与Gsb-3遗传连锁距离为8.3 cM,定名为ISSR-100900.研究认为,ISSR100900可作为甜瓜抗蔓枯病分子育种的备选分子标记.     

Synthesis and transporter binding properties of (R)-2β,3β- and (R)-2α,3α-diaryltropanes

(R)-2-Aryl-2-tropinone (9) was synthesized from (R)-2-carbomethoxy-3-tropinone (5) and was used as the key intermediate for the synthesis of (R)-2β,3β- and (R)-2α,3α-diaryltropanes. Inhibition of radioligand binding studies at the dopamine, serotonin, and norepinephrine transporters showed that the (R)-3β-(4-methylphenyl)-2β-phenyltropane (3b, RTI-422) possessed an IC₅₀ value of 1.96 nM at the dopamine transporter and was highly selective for this transporter relative to the serotonin and norepinephrine transporters.     

Biochemical and Immunological Relationships Between Endo-β-1,4-Glucanases from Cockroaches

The cellulase from Geoscapheus dilatatus consisted of two major and four minor endo-β-1,4-glucanase components. Two major and one minor component were purified to homogeneity. The major endo-β-1,4-glucanase components, named GD1 and GD2, were similar to EG1 and EG2 from Panesthia cribrata in terms of M_r and kinetic properties. The purified minor component, named GD3, was distinct from GD1 and GD2 because of a lower M_r and a lower specific activity. Polyclonal antibodies raised against the two major endo-β-1,4-glucanase components, EG1 and EG2, of the cellulase from P. cribrata cross-reacted with each other and with pure GD1 and GD2 from the foregut and midgut of the related cockroach G. dilatatus but did not cross-react with GD3. Endo-β-1,4-glucanase components were partially purified from the foregut and midgut of four other cockroaches. These comprised three other Australian cockroaches also from the superfamily Blaberoidea and one American cockroach, Cryptocercus punctulatus, from the superfamily Blattoidea. The endogenous cellulases from all cockroaches examined consisted of either two or three major endo-β-1,4-glucanase components. The amino acid sequence of the N-terminus region of the two major endo-β-1,4-glucanase components from P. cribrata were determined and are homologous with those belonging to glycosyl hydrolase family 9 (cellulase family E).     

腺病毒载体介导PDX-1在骨髓间充质干细胞中的表达

为研究PDX-1基因在骨髓间充质干细胞中的表达情况及生物学功能的发挥,构建了含PDX-1基因的重组腺病毒载体. 酶切PDX-1基因并连入穿梭质粒pAdTrack-CMV.用电穿孔法使穿梭质粒pAdTrack-CMV-PDX-1与病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组.利用脂质体介导重组腺病毒载体转染293细胞,包装出完整的腺病毒.分离、培养、扩增骨髓间充质干细胞.用重组腺病毒感染间充质干细胞.用荧光显微镜、RT-PCR、免疫荧光染色等方法检测PDX-1、胰岛素基因及蛋白质的表达,用放射免疫分析法检测转基因细胞分泌胰岛素情况.结果表明:通过测序、PCR、酶切等鉴定PDX-1基因已正确插入穿梭质粒中,并与病毒骨架质粒重组.重组腺病毒滴度为6.3×10⁷ PFU/ml.通过荧光显微镜观察证实重组腺病毒可高效感染骨髓间充质干细胞,经RT-PCR、免疫荧光染色证实转染pAd-PDX-1后培养7天的细胞中有PDX-1及胰岛素基因的表达.这些转基因的细胞向胞外分泌的胰岛素量为(15.21±3.50) mIU/L.     

甜茶的化学成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

为探究甜茶(Rubus suavissimus)中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的次级代谢产物,该文利用多种现代色谱分离技术对其干燥叶进行提取分离纯化,综合运用质谱、核磁共振波谱分析方法确定了单体化合物的结构,并对分离得到的化合物进行了α-葡萄糖苷酶抑制活性的测试。结果表明:(1)从甜茶的干燥叶中分离鉴定出10个化合物,分别为甜茶苷(1)、山奈酚-3-O-洋槐糖苷(2)、没食子酸(3)、二聚松柏醇(4)、5-甲氧基二聚松柏醇(5)、云实酸(6)、斯替维单糖苷(7)、斯替维醇(8)、16α,17-二羟基对映贝壳杉烷(9)、槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷(10),其中化合物2、4、5、9均为首次从甜茶中分离得到。(2)α-葡萄糖苷酶抑制活性测试结果显示,化合物2、3、5、6、10具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。该研究结果丰富了甜茶中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物,并为降血糖相关产品的开发提供了理论依据。