麦芽糖的改性及其化学修饰胰蛋白酶的研究

目的:通过高碘酸钠氧化法以麦芽糖修饰胰蛋白酶,检验此方法是否能够改善胰蛋白酶的稳定性.方法:采用高碘酸钠改性麦芽糖,使其中具有能够与酶分子中氨基结合的醛基,从而在一定条件下化学修饰胰蛋白酶.结果:改性麦芽糖的最佳条件为,高碘酸钠浓度0.05g/mL,高碘酸钠与麦芽糖质量比1.1∶1,初始pH 1.0,反应时间3h,反应温度30℃;修饰胰蛋白酶的最佳条件为,pH6.0,改性麦芽糖与胰蛋白酶质量比1∶1,修饰温度4℃,修饰时间24h;在最佳条件下修饰酶后,pH在8.9～10.0时,原酶活力与修饰酶活力分别下降了其最高活力的15.8%和9.8%;将酶置于50℃ 2h后,原酶与修饰酶分别保留了其置于4℃ 2h后活力的88.7%和94.7%.结论:该方法能够提高胰蛋白酶的耐碱稳定性和热稳定性.     

青鱼腸胃道中蛋白酶的初步研究

(1)从淡水魚青魚腸胃道中提取出魚蛋白酶,酶制剂活力以酪蛋白作底物約为結晶胰蛋白酶的1/3。酶的前身有酶原存在,激活最适pH为8。(2)酶作用的pH偏于碱,水解酪蛋白和B-精-NH_2的最适pH都为9,酶和酶原对酸都不稳定,当pH低于4吋,酶活性和酶原激活的能力迅速丧失。(3)此酶对热很稳定,反应温度55度时,反应速度仍符合Arrhenius定律。測得水解酪蛋白和B-精-NH_2的活化能分别为14.6千卡/克分子及8.0千卡/克分子,較之胰蛋白酶水解此同一底物所需的活化能为低,尤以后者更显著,約相当于1/2值。(4)对小底物的水解以B-精-NH_2活力最高,K_m=3.3×10~(-3)M(40度pH8.7),为胰蛋白酶水解此同一底物所得K_m值的二分之一,对胰凝乳蛋白酶的底物B-酪-NH_2不作用,而对Cbz-甘-苯丙及白-NH_2却有較明显的活力。(5)半胱氨酸(10~(-3)M)和PCMB(10~(-4)M)对酶活力无影响,但能被DFP和胰蛋白酶抑制剂所抑制。DFP的抑剂随其与酶保温时間的增长而增大。lO~(-4)MDFP与酶液保溫10小时后能抑制酶活力达60%。胰蛋白酶抑制剂对此酶抑制的作用与抑制胰凝乳蛋白酶相类似。(6)从青魚腸胃道中找到有类胰蛋白酶抑制剂的存在。对魚本身蛋白酶有显著的抑制作用,对胰蛋白酶亦能抑制,但抑制能力較弱。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Ⅷ.两个活性碎片的拆分

1.绿豆胰蛋白酶抑制剂有二个活性中心,可以同时抑制两分子胰蛋白酶。用苯乙二醛及顺丁烯二酸酐分别进行化学修饰,都可使其活力降低至原有的50%左右,表明此两活性中心分别应为精氨酸残基及赖氨酸残基。2.绿豆抑制剂经胃蛋白酶酶解后,活力不丧失,在凝胶过滤中出现分子量为原抑制剂一半的新活力峰,经证实为两个不同活性中心的活力碎片。3.利用两活性中心残基赖氨酸和精氨酸侧链基团解离pK值的差异,在pH11.4的条件下通过固相胰蛋白酶亲和层析可将两活力碎片彼此分离。分离所得两碎片活力大致相等。4.以赖氨酸为活性中心的碎片能被顺丁烯二酸酐全部抑制失活,在pH3.5下保温却和原抑制剂一样能恢复其原有活力的90%以上。此活力碎片由两条肽链所组成,共含35个氨基酸残基,N-末端为丝氨酸和苯丙氨酸,两C-末端分别为亮氨酸及甲硫氨酸。5.以精氨酸为活性中心的碎片的活力能被苯乙二醛全部抑制,经鉴定为一条肽链,其含约27个氨基酸残基,N-末端为门冬酰胺,C-末端为门冬氨酸。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Ⅷ.两个活性碎片的拆分

1.绿豆胰蛋白酶抑制剂有二个活性中心,可以同时抑制两分子胰蛋白酶。用苯乙二醛及顺丁烯二酸酐分别进行化学修饰,都可使其活力降低至原有的50%左右,表明此两活性中心分别应为精氨酸残基及赖氨酸残基。2.绿豆抑制剂经胃蛋白酶酶解后,活力不丧失,在凝胶过滤中出现分子量为原抑制剂一半的新活力峰,经证实为两个不同活性中心的活力碎片。3.利用两活性中心残基赖氨酸和精氨酸侧链基团解离pK 值的差异,在pH11.4的条件下通过固相胰蛋白酶亲和层析可将两活力碎片彼此分离。分离所得两碎片活力大致相等。4.以赖氨酸为活性中心的碎片能被顺丁烯二酸酐全部抑制失活,在pH3.5下保温却和原抑制剂一样能恢复其原有活力的90%以上。此活力碎片由两条肽链所组成,共含35个氨基酸残基,N-末端为丝氨酸和苯丙氨酸,两C-末端分别为亮氨酸及甲硫氨酸。5.以精氨酸为活性中心的碎片的活力能被苯乙二醛全部抑制,经鉴定为一条肽链,其含约27个氨基酸残基,N-末端为门冬酰胺,C-末端为门冬氨酸。     

测序级胰蛋白酶的制备工艺与质量检测

目的:制备高纯度、酶解效率高、酶切位点专一的测序级胰蛋白酶,应用于蛋白组学研究的蛋白质鉴定与分析中。方法:取实验室自制的猪胰蛋白酶粗酶,经硼氢化钠、甲醛还原甲基化修饰抑制胰蛋白酶自水解,采用高效液相色谱仪15RPC反相柱纯化,收集对应的甲基化胰蛋白酶峰组分,冷冻干燥;甲基化修饰的胰蛋白酶进一步经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)修饰,以抑制糜蛋白酶等非特异性酶切活性,并经反相色谱柱再纯化,获得终产物即质谱测序级胰蛋白酶;自制的测序级胰蛋白酶经SDS-PAGE、HPLC反相色谱分析、酶比活力测定,并应用于胶内蛋白质酶切质谱鉴定氨基酸序列等,检测其纯度、酶水解效率及酶切位点特异性。结果:自制甲基化TPCK修饰的测序级胰蛋白酶纯度大于95%,酶比活力为200 U/mgP(TAME)以上,质谱分析酶切特异性好;且酶的制备工艺流程稳定,可应用于测序级胰蛋白酶产品的生产与开发中。结论:制备的测序级胰蛋白酶纯度高、酶解效率优、酶切特异性强,可广泛应用于实验室中蛋白质和肽段测序鉴定、HPLC肽段谱图分析等蛋白组学研究分析中。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究 Ⅶ.N-端活力碎片的研究

绿豆胰蛋白酶抑制剂经溴化氰及胃蛋白酶限止性裂解后经固相胰蛋白酶亲和层析及Sephadex G-50柱分离可得一活力碎片,能当量抑制胰蛋白酶,它是属于抑制剂中两个活性区域中近N端的一个,而近C端的活性区域经CNBr裂解后活力丧失。此活力碎片是由两条肽链所组成,通过两对二硫键相连结,它们分别含26及9个氨基酸残基,N末端分别为丝氨酸及苯丙氨酸,C末端分别为亮氨酸及高丝氨酸。活力碎片与牛胰蛋白酶当量结合后的络合物能获得片状或小颗粒晶体,在低pH下解离后的活力碎片可用Sephadex G-50柱分离提纯,其氨基酸组成与抑制活力特性都保持不变。在pH 3～12范围内不同温度下测定活力碎片的稳定性,当pH低于6时即使在100℃下加热10分钟也不失活,在较高pH下活力碎片的失活情况大致上与天然抑制剂相仿。活力碎片再同时经过量氨肽酶与羧肽酶进一步酶解后,氨基酸残基数虽降至27个左右,活力仍不丧失,是目前已知分子量最小而活力又全保留的抑制剂活力碎片。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Ⅶ.N-端活力碎片的研究

绿豆胰蛋白酶抑制剂经溴化氰及胃蛋白酶限止性裂解后经固相胰蛋白酶亲和层析及Sephadex G-50柱分离可得一活力碎片,能当量抑制胰蛋白酶,它是属于抑制剂中两个活性区域中近N 端的一个,而近C 端的活性区域经CNBr 裂解后活力丧失。此活力碎片是由两条肽链所组成,通过两对二硫键相连结,它们分别含26及9个氨基酸残基,N 末端分别为丝氨酸及苯丙氨酸,C 末端分别为亮氨酸及高丝氨酸。活力碎片与牛胰蛋白酶当量结合后的络合物能获得片状或小颗粒晶体,在低pH 下解离后的活力碎片可用Sephadex G-50柱分离提纯,其氨基酸组成与抑制活力特性都保持不变。在pH 3～12范围内不同温度下测定活力碎片的稳定性,当pH 低于6时即使在100℃下加热10分钟也不失活,在较高pH 下活力碎片的失活情况大致上与天然抑制剂相仿。活力碎片再同时经过量氨肽酶与羧肽酶进一步酶解后,氨基酸残基数虽降至27个左右,活力仍不丧失,是目前已知分子量最小而活力又全保留的抑制剂活力碎片。     

测序级胰蛋白酶的制备工艺与质量检测简

目的：制备高纯度、酶解效率高、酶切位点专一的测序级胰蛋白酶,应用于蛋白组学研究的蛋白质鉴定与分析中。方法：取实验室自制的猪胰蛋白酶粗酶,经硼氢化钠、甲醛还原甲基化修饰抑制胰蛋白酶自水解,采用高效液相色谱仪15RPC反相柱纯化,收集对应的甲基化胰蛋白酶峰组分,冷冻干燥;甲基化修饰的胰蛋白酶进一步经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）修饰,以抑制糜蛋白酶等非特异性酶切活性,并经反相色谱柱再纯化,获得终产物即质谱测序级胰蛋白酶;自制的测序级胰蛋白酶经SDS-PAGE、HPLC反相色谱分析、酶比活力测定,并应用于胶内蛋白质酶切质谱鉴定氨基酸序列等,检测其纯度、酶水解效率及酶切位点特异性。结果：自制甲基化TPCK修饰的测序级胰蛋白酶纯度大于95％,酶比活力为200U/mgP（TAME）以上,质谱分析酶切特异性好;且酶的制备工艺流程稳定,可应用于测序级胰蛋白酶产品的生产与开发中。结论：制备的测序级胰蛋白酶纯度高、酶解效率优、酶切特异性强,可广泛应用于实验室中蛋白质和肽段测序鉴定、HPLC肽段谱图分析等蛋白组学研究分析中。     

蛋白质功能基团的改变与其生物活力的关系 Ⅱ.胰蛋白酶的必需硫硫键数目

在防止硫硫鍵交換的条件下,用亚硫酸鈉作用于胰蛋白酶的硫硫鍵,于测定硫硫鍵破坏数目的同时,以血紅蛋白、苯甲酰精氨酰胺,对甲苯磺酰精氨酰甲酯測定剩余酶活力的結果用前文提出的判断方法作图表明胰蛋白酶六个硫硫鍵中的三个是必需的。     

对异硫氰基苯磺酰乙基纤维素的制备及其与碱性磷酸单酯酶的键合

以ABSE-纤维素为原料,用硫光气的二氧六环溶液处理,使氨基转变为异硫氰基,然后与碱性磷酸单酯酶键合。反应最适pH为7.2,不溶酶的相对活力为70%左右,以潮湿状态保存于15℃,45天内活力不变。与对-重氮基苯磺酰乙基纤维素为载体作比较,从键合酶量、相对活力来看均无显著区别。用葡聚糖凝胶G200作支持物,以相同的方法制成含异硫氰基的载体,与碱性磷酸单酯酶键合后,键合酶量和相对活力均与对-异硫氰基苯磺酰乙基纤维素-碱性磷酸单酯酶相同。     

共价法固定化胰蛋白酶的研究

碳二亚胺、环氧等方法研究了胰蛋白酶的共价固定化,测定了这些方法的固定化酶蛋白回收、固定化酶活力回收和固定化酶的相对比活力。实验结果表明前三种方法效果较好,蛋白回收分别为59%、93％和28％,活力回收为53％、38％和20％,考察了这三种固定化胰蛋白酶的最适温度、最适pH、表观米氏常数和工作稳定性。此外,本文对上述三种不同的固定化方法引起酶对大分子底物(偶氮酪蛋白)和小分子底物(BAPNA)的活力的影响也作了初步的探讨。     

醛縮酶的研究——I.底物对醛縮酶被胰蛋白酶消化时的保护作用

(一)天然醛縮酶受胰蛋白酶消化迅速失活,但底物的存在有明显的保护作用。在实驗的条件下,如有底物的存在,醛縮酶被胰蛋白酶消化20分钟时就釋放出三个肽段(舍27个氨基酸殘基)保留約原活力的60％,而无底物保护的酶則完全失活。 (二)在底物存在下,醛縮酶受胰蛋白酶消化得到的殘余酶蛋白基本上是均一的,具有和天然醛縮酶若干相似的性质。 (三)在底物保护下,醛縮酶受胰蛋白酶消化釋放肽的位置可能在醛縮酶B鏈的N端部分。 (四)底物的可能保护机制是FDP与酶形成相对稳定的酶-底物絡合物,FDP的6-磷酸部分与酶蛋白肽鏈C端酪氨酸或其附近的某个基团相連,二羥丙酮磷酸部分的磷酸則与活性中心賴氨酸附近的氨基酸相結合,使賴氨酸的ε-氨基处于易与底物的酮基結合形成Schiff碱的地位。 (五)磷酸緩冲液也具有对抗胰蛋白酶消化醛縮酶的保护作用,但其机制可能与FDP不同。     

东亚三角涡虫胰蛋白酶Djtry的表达和酶活分析

通过对东亚三角涡虫胰蛋白酶Djtry氨基酸序列比对分析,发现保守的催化三联体结构中第一位的His被Lys所取代。为了探究这种突变是否会对胰蛋白酶的活性有影响,文章构建了原核表达重组质粒pET-28a-Djtry,转化到E.coli BL21中,利用IPTG诱导表达,对表达的重组蛋白进行变性、复性、纯化以及Westernblotting鉴定,获得成分均一的活性蛋白。利用牛胰蛋白酶为标准品,胰蛋白酶特异性底物BAEE,检测Djtry酶活力与比活力。SDS-PAGE电泳表明诱导表达的融合蛋白为包涵体,分子量约为26 kDa,Western blotting结果显示为目的蛋白,对复性纯化的目的蛋白进行酶活检测发现,突变型胰蛋白酶Djtry仍然保持了胰蛋白酶催化性质,但是催化活性相对较弱。     

东亚三角涡虫胰蛋白酶Djtry的表达和酶活分析

通过对东亚三角涡虫胰蛋白酶Djtry氨基酸序列比对分析, 发现保守的催化三联体结构中第一位的His被Lys所取代。为了探究这种突变是否会对胰蛋白酶的活性有影响, 文章构建了原核表达重组质粒pET-28a- Djtry, 转化到E.coli BL21中, 利用IPTG诱导表达, 对表达的重组蛋白进行变性、复性、纯化以及Western blotting鉴定, 获得成分均一的活性蛋白。利用牛胰蛋白酶为标准品, 胰蛋白酶特异性底物BAEE, 检测Djtry酶活力与比活力。SDS-PAGE电泳表明诱导表达的融合蛋白为包涵体, 分子量约为26 kDa, Western blotting结果显示为目的蛋白, 对复性纯化的目的蛋白进行酶活检测发现, 突变型胰蛋白酶Djtry仍然保持了胰蛋白酶催化性质, 但是催化活性相对较弱。     

磷脂对乙酰胆碱酯酶的稳定性及磷酸化作用的影响

采用重组的方法,磷脂能显著地提高纯化的黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶在水溶液中保存的稳定性。牛脑磷脂酰丝氨酸及牛脑磷脂酰胆碱重组酶,在4℃条件下保存,皆有比对照更高的稳定性。酶与牛脑磷脂酰胆碱重组后,再分别于室温及37℃放置50天,其活力不下降。而对照的活力分别下降为重组前活力的1/2及1/4。在某些稀释条件下,牛脑及牛脊髓磷脂酰丝氨酸重组酶的活性迅速下降。稀释液中钙离子的存在,能阻止这种磷脂对酶的抑制作用。而磷脂酰胆碱重组酶及对照酶皆无此种在稀释条件下的活力迅速下降的现象。牛脑磷脂酰胆碱与酶的重组还能提高对氧磷与酶的反应活性。该重组酶与对氧磷反应的双分子速度常数高达9.0×10~8M~(-1)分~(-1)。因此,此种磷脂酰胆碱重组酶是酶分析法测定极低浓度有机磷化合物的一种较好的酶源。     

胰蛋白酶与底物在尿素溶液中的结合

胰蛋白酶的专一性底物,对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯,对酶在236mμ的尿素差吸收峰有熄灭作用;不同量的对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯对胰蛋白酶236mμ的尿素差吸收值的影响形成一滴定曲线。在8M尿素溶液中对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯和胰蛋白酶的旋光不具有加和性。这些事实说明在尿素溶液中胰蛋白酶能够和底物结合。二异丙磷酰胰蛋白酶的236mμ尿素差吸收峰亦能被对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯熄灭,指出二异丙磷酰胰蛋白酶仍然具有和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯结合的能力。用N-溴代琥珀酰亚胺氧化胰蛋白酶的色氨酸残基后,酶的尿素差示光谱消失以及酶的pH差示光谱中反映了一个pK2.8的解离基团,说明色氨酸残基和羧基可能直接或间接与236mμ左右的差示光谱有关。从底物存在下胰蛋白酶在pH1.6—3.6范围内不再呈现pH差示光谱看来,羧基可能参与底物的结合。     

磷脂对乙酰胆碱酯酶的稳定性及磷酸化作用的影响

采用重组的方法,磷脂能显著地提高纯化的黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶在水溶液中保存的稳定性。牛脑磷脂酰丝氨酸及牛脑磷脂酰胆碱重组酶,在4℃条件下保存,皆有比对照更高的稳定性。酶与牛脑磷脂酰胆碱重组后,再分别于室温及37℃放置50天,其活力不下降。而对照的活力分别下降为重组前活力的1/2及1/4。在某些稀释条件下,牛脑及牛脊髓磷脂酰丝氨酸重组酶的活性迅速下降。稀释液中钙离子的存在,能阻止这种磷脂对酶的抑制作用。而磷脂酰胆碱重组酶及对照酶皆无此种在稀释条件下的活力迅速下降的现象。牛脑磷脂酰胆碱与酶的重组还能提高对氧磷与酶的反应活性。该重组酶与对氧磷反应的双分子速度常数高达9.0×10~8M~(-1)分~(-1)。因此,此种磷脂酰胆碱重组酶是酶分析法测定极低浓度有机磷化合物的一种较好的酶源。     

慈菇中两种结晶的多功能蛋白酶抑制剂的研究

由于蛋白酶抑制剂在生理、生化、病理、药理上都占有很重要的地位,特别是具有多功能的蛋白酶抑制剂被广泛应用于临床,近年来愈来愈受到各方面的重视。本文报道了从慈菇中提取两种结晶的多功能蛋白酶抑制剂,它们都具有两个活力相等的活性中心,这与其他已知的同类型植物蛋白酶抑制剂不同,有它的特殊性。(1)慈菇蛋白酶抑制剂A、B,除能抑制胰蛋白酶外,还能抑制胰凝乳蛋白酶及猪颌下腺的舒缓激肽释放酶。用酰胺、酯及蛋白等不同底物分别求出抑制剂A、B对胰蛋白酶的当量抑制比值及对胰凝乳蛋白酶的半抑制比值。两者对胰蛋白酶的抑制常数在10~(-9)～10~(-10)的范围内,抑制剂B对胰蛋白酶较之A有更大的结合力,但抑制剂A对胰凝乳蛋白酶及舒缓激肽释放酶较之B却有更明显的抑制活力。(2)用葡聚糖凝胶过滤及聚丙烯酰胺凝胶电泳分别测定抑制剂A、B的分子量均在17000左右。从抑制剂A、B对胰蛋白酶的当量抑制比值求得分子量为8500。这说明每一抑制剂分子中具有两个活力相等的活性中心。(3)测定了抑制剂A、B的氨基酸组成,二者除碱性氨基酸及天冬氨酸含量略有差异外其余皆相同,各含有两对二硫键,非极性氨基酸含量较高约占60%左右。由氨基酸组成求得最小分子量约16500。(4)用二硝基氟苯,二甲基氨基萘磺酰氯及氨肽酶M测定抑制剂A、B的N末端,都证实是天冬氨酸。     

酶原激活机制

在1957年联合座谈会上评论了酶原激活机制这个课题。在那时,和现在一样,此过程的突出特征表现为在酶原分子中某一独特位置上肽键的酶促水解。就胰腺的酶原来说激活酶是胰蛋白酶,把它的作用指向和限制于最能接近和最易受影响的肽键。图1说明了四种胰腺酶原(即牛和猪的胰蛋白酶原、牛糜蛋白酶原A和B)的这种激活作用。这些新旧资料主要来自Desnuelle 及其同事以及我们在Seattle 实验室的工作。赖氨酰-异亮氨酸键的水解是牛和猪的胰蛋白酶原激活过程中的基本的化学变化,结果释放出一种氨基末端的六肽或八肽。同样地,牛糜蛋白酶原A和B的激活的第一步是精氨酰-异亮氨酸键被水解,但由于有一氨基末端胱氨酸残基,所以在此反应中没胰蛋白酶原     

棉铃虫幼虫中肠主要蛋白酶活性的鉴定

根据棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)中肠酶液对蛋白酶专性底物在不同pH下的水解作用,棉铃虫中肠的3种丝氨酸蛋白酶得到鉴定。它们是：强碱性类胰蛋白酶,水 解a-N-苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基苯胺的最适pH在10.50以上;弱碱性类胰蛋白酶,水解p-甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯的最适pH为8.50～9.00;类胰凝乳蛋白酶, 水解N一苯甲酰-L-酪氨酸乙酯的最适pH亦为8.50-9.00。中肠总蛋白酶活性用偶 氮酪蛋白测定,最适pH亦在10.50以上。Ca²⁺对昆虫蛋白酶无影响,Mg²⁺仅对弱碱性类胰蛋白酶有激活作用。对苯甲基磺酰氟和甲基磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮对弱碱性类胰蛋白酶的抑制作用较强,而对强碱性类胰蛋白酶的抑制作用较弱。甲基磺酰-L苯丙氨酸氯甲基酮除能抑制类胰凝乳蛋白酶外,还能激活弱碱性类胰蛋白酶。对牛胰蛋白酶有强抑制作用的卵粘蛋白抑制剂对昆虫蛋白酶却无抑制作用。大豆胰蛋白酶抑制剂对该虫的3种丝氨酸蛋白酶均有强的抑制作用。