一种改进的cDNA文库固相构建法

本文介绍一种新的cDNA文库固相构建法。文库构建过程中,cDNA的合成和修饰全部在固相介质――磁珠上完成,简便、迅速、文库质量高,能满足不同目的的cDNA文库构建,是一种值得借鉴和应用的好方法。 Abstract：A method for cDNA library construction was introduced.All enzymatic steps of library synthesis were performed on a solid support-magnetic beads.Therefore it combines fast speed and convenient with high quality library,making it ideally suited for most purposes.It is a good method and worth learning and utilization.     

固定化胰蛋白酶活力的测定方法探讨

对自制的固定化胰蛋白酶(Immobilization Trypsin,ITP)分别经过冷冻干燥、真空干燥后定量测定其酶活力,与由湿态直接定量法(DQA)测定的活力进行比较。试验表明,直接定量方法测定的酶活力比前两者高,而且操作简单。     

一种固相~(125)I标记抗球蛋白的技术

近十年来,广泛应用放射免疫技术的同时,也建立了免疫放射的分析方法(Mi-les and Hales,1968),利用标记抗体先直接和一特定抗原相结合,再在反应系统中,加入联结于吸附剂上的该抗原,结合剩余的游离抗体,分离后者,从而了解待测抗原的含量。但标记特异性抗体的免疫放射法,和放射免疫法中标记抗原一样,在研究不同实验系统时,需标记不同的抗体,在使用上不便。免疫放射分析技术中的标记     

萌发绿豆种子中的一种大豆胰蛋白酶抑制剂钝化酶

通过 30 %～ 6 0 % (NH4 ) 2 SO4 分级沉淀、DEAE_SepharoseCL_6B离子交换层析、SephacrylS_2 0 0凝胶过滤层析和WatersAP_1离子交换层析 ,从萌发的绿豆 (Vignarabiata (L .)Wilczek)种子中分离纯化出一种可降解大豆胰蛋白酶抑制剂 (STI)的蛋白酶。SDS_PAGE测定该酶的分子量为 2 9.8kD。该酶催化降解STI的Km 值为 76 9.2BAEE/mL ,Vmax为 115 .3BAEE·mL-1·min-1。该酶在 5 0℃、pH 8.0、相对酶活力 5 0 0 0BAEE/mL和 4h的反应时间时可将脱脂大豆粉中的STI活性钝化 90 .91%。该酶在温度低于 5 0℃及pH 6 .5～ 8.5时能保持其活性。     

固相RNasin亲和层析RNase

大鼠肝RNasin与溴化氰活化的Sepharose 4B反应制备了固相大鼠肝RNasin。用固相大鼠肝RNasin亲和层析大鼠肝中性RNase,可以将其分为两部分。固相大鼠肝RNasin可以亲和层析牛胰RNase的结果说明,牛胰和大鼠肝RNase在二级和三级结构上都非常相似。这为大鼠肝RNase来源于胰脏的观点提供了一个新证据。固相RNasin可以亲和吸附大肠杆菌RNase说明原核细胞RNase与真核细胞RNase在分子起源方面有一定的亲缘关系。固相RNasin柱层析为纯化RNase提供了一个简便的新方法。     

纤维素固相化木瓜蛋白酶

 本文用叠氮法制备了纤维素固相化木瓜蛋白酶(简称CMCP)。与相应酶液水解酪蛋白的反应相比,它表现出较低的酶活性,较高的最适pH值和较高的稳定性。CMCP的比活回收率约为24％,最适pH值向碱性范围移动约为0.5个单位。CMCP经60℃热处理,持续3h活性无明显下降,在4℃下保存127天,活性只下降了40％左右。对这些参数,本文都根据CMCP的结构特点进行了分析。 CMCP柱还表现出明显的对啤酒的防浊能力。过柱的啤酒,氨基酸的含量大大增加。     

血清中甲_2巨球蛋白对胰蛋白酶抑制活力测定

甲_2巨球蛋白(简称α_2M)是存在于人和动物血清中一种广谱蛋白酶抑制剂。实验利用α_2M对蛋白酶的特殊抑制原理:α_2M通过包陷蛋白酶去抑制蛋白酶对天然蛋白质的水解作用,但不破坏蛋白酶活化中心,因而仍保留对小分子合成底物的水解,释放显色基团,在分光光度计上比色,达到测定目的。本实验用人和大鼠正常混合血清作样品,对实验方法和测定系统中选择样品和试剂量作较详细介绍。方法灵敏,血清量少。为实验室和临床检验提供测试方法。     

一种插入116个氨基酸的亮氨酰—tRNA合成酶具有高酶活力

大肠杆菌亮氨酰 tRNA合成酶 (LeuRS)是第 1类氨基酰 tRNA合成酶 ,由 860个氨基酸残基组成 ,催化亮氨酸tRNA的亮氨酰化。研究发现 ,在它的CP1结构域内 3 68和 3 69间的肽键间插入 2 5 3～ 3 68的肽段 ,该插入变种的酶仍具有酶活力 ,取名为LeuRS C。由于这一插入变种的不稳定性 ,构建了His6 LeuRS C的表达质粒 ,用Ni NTA柱亲和层析的方法进行纯化。发现His6 LeuRS C虽然插入了 116个氨基酸残基 ,但仍具有全部的天然LeuRS的活力。测定了His6 LeuRS C的酶学动力学常数 ,比较了它与天然LeuRS的从CD光谱得到的二级结构和热稳定性     

一种简便、快捷的胰蛋白酶抑制剂基因的分离与克隆方法

从 3个豇豆品种幼嫩叶片中分离出核基因组 DNA,参照已知的几种 Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂基因序列 ,设计合成了 2 7bp,且含有 Bam H I位点的寡核苷酸引物 ,分别以 3种豇豆核基因组 DNA为模板 ,PCR扩增 ,均得到长度约为 3 40 bp的 DNA片段。产物 DNA片段经 DNA序列分析 ,结果表明三者的碱基序列相同 ,与报道的胰蛋白酶抑制剂基因相比 ,同源性为 1 0 0 %和 99.7%。     

一种用于蛋白质相似性分析的新的相对距离

本文论述了一种新的相对距离,用于分析不同蛋白质序列的相似性分析和构造进化树．此种距离基于Lempel-Zip复杂度,不需要进行序列比对和复杂性算法．为了说明这种距离的合理性,本文对8个物种进行了相似性分析并构造了其进化树．     

cDNA文库固相构建法

本文介绍一种cDNA文库的固相构建法。文库构建过程cDNA的合成和修饰全部在固相介质—磁珠上完成,简便、迅速、文库质量高,能满足不同目的的cDNA文库构建,是一种值得借鉴和应用的好方法。     

植物细胞固相培养研究进展

模仿植物体内的代谢环境及微生物的发酵培养而建立的植物细胞固相培养技术在有效次生产物,如:药品、香料、甜味剂和食品色素等的商业化生产中有着重大意义. 由于固相培养技术有以下优点,因而在本世纪八十年代取得了迅速发展. (1)固相细胞内紧密接触及细胞的多样性可形成同一结构组织,从而促进合成途径的表达. (2)固相细胞生长在有浓度梯度的营     

植物细胞固相培养研究进展

模拟植物体内的代谢环境及微生物的发酵培养而建立的植物细胞固相培养技术在有用的次生产物,如:药品、香料、甜味剂和食品色素等的商业化生产中有着重大意义。 由于固相培养技术有以下优点,因而在本世纪八十年代已得到了迅速发展。 (1)固相细胞间紧密接触及细胞的拟组织化可形成同一结构组织,从而促进合成途径的表达。     

cDNA文库固相构建法

本文介绍一种ｃＤＮＡ文库的固相构建法。文库构建过程ｃＤＮＡ的合成和修饰全部在固相介质－磁珠上完成,简便、迅速、文库质量高,能满足不同目的的ｃＤＮＡ文库构建,是一种植得借鉴和应用的好办法。     

两种树脂对固相法合成丙型肝炎疫苗多肽的影响

本实验采用固相法合成丙型肝炎疫苗多肽,比较Wang树脂和二氯三苯甲基树脂（以下简称二氯树脂）作为载体时的连接率以及目标肽的产率和纯度。通过质谱鉴定分析所得目标多肽的分子量,用茚三酮法对两种树脂与氨基酸的连接率进行比较,用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行粗肽的分析和纯化。结果显示以二氯树脂作载体,第一个氨基酸的连接率,以及目标肽的纯度和产率都要明显高于Wang树脂,因此二氯树脂作载体合成丙型肝炎疫苗多肽更适合大规模工业化生产的要求。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究 Ⅶ.N-端活力碎片的研究

绿豆胰蛋白酶抑制剂经溴化氰及胃蛋白酶限止性裂解后经固相胰蛋白酶亲和层析及Sephadex G-50柱分离可得一活力碎片,能当量抑制胰蛋白酶,它是属于抑制剂中两个活性区域中近N端的一个,而近C端的活性区域经CNBr裂解后活力丧失。此活力碎片是由两条肽链所组成,通过两对二硫键相连结,它们分别含26及9个氨基酸残基,N末端分别为丝氨酸及苯丙氨酸,C末端分别为亮氨酸及高丝氨酸。活力碎片与牛胰蛋白酶当量结合后的络合物能获得片状或小颗粒晶体,在低pH下解离后的活力碎片可用Sephadex G-50柱分离提纯,其氨基酸组成与抑制活力特性都保持不变。在pH 3～12范围内不同温度下测定活力碎片的稳定性,当pH低于6时即使在100℃下加热10分钟也不失活,在较高pH下活力碎片的失活情况大致上与天然抑制剂相仿。活力碎片再同时经过量氨肽酶与羧肽酶进一步酶解后,氨基酸残基数虽降至27个左右,活力仍不丧失,是目前已知分子量最小而活力又全保留的抑制剂活力碎片。