siRNA沉默SIRT1基因对宫颈癌细胞HeLa增殖和凋亡的影响

化学合成靶向SIRT1基因的小干扰RNA,脂质体法转染人宫颈癌细胞株HeLa,观察小干扰RNA沉默SIRT1基因对HeLa增殖及细胞凋亡的影响。在优化siRNA SIRT1转染条件的基础上,应用RT-PCR和Western blot分别检测各组SIRT1 mRNA、SIRT1蛋白及凋亡相关蛋白的表达;CCK-8法检测细胞增殖抑制率;Hoechst荧光染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果表明,siRNA SIRT1转染细胞组SIRT1 mRNA水平和蛋白表达量明显低于对照组;siRNA SIRT1转染组细胞增殖受抑制,细胞凋亡率明显增加;凋亡相关蛋白P53、P21表达上调,Survivin表达下调。上述结果表明:siRNA SIRT1诱导的HeLa细胞凋亡与P53、P21、Survivin通路关系密切,但siRNA SIRT1诱导HeLa细胞凋亡的详尽机制有待进一步研究。     

SIRT1介导神经保护作用的研究进展

沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)能够调控炎症、氧化应激和凋亡等相关信号通路,在多种中枢神经系统疾病如脑卒中、阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)、帕金森病(Parkinson'sdisease,PD)和亨廷顿病(Huntingdon'...     

蛋白激酶对活性氧调节7721人肝癌细胞生长的影响

以有义和反义人锰型超氧化物歧化酶 (MnSOD)、蛋白激酶B (PKB)cDNA分别转染人 772 1肝癌细胞系建立高、低表达MnSOD和PKB的模型 ,通过改变细胞内、外源性活性氧和抗氧化水平及PKB的活性 ,研究活性氧调节肝癌细胞生长过程中与PKB信号转导途径的关系。结果表明 ,低浓度外源性活性氧过氧化氢 (1～ 10μmol/L)应激及MnSOD低表达细胞中内源性活性氧水平升高 ,都可促进肝癌细胞增殖 ,而抗氧化剂丹参素 (4 0mg/L)干预及MnSOD高表达使细胞内源性活性氧水平相对下降 ,都可一定程度抑制细胞的生长。采用3 2 P参入法检测细胞PKB酶活性 ,发现细胞内、外源性活性氧均能激活PKB ,而采用抗氧化干预 ,能明显抑制PKB的酶活性。采用RT PCR法检测AP 1转录因子组成成员c fos和c jun基因的mRNA表达 ,发现与PKB活性呈正比。说明活性氧在特定细胞内氧化 /还原环境下可通过激活PKB途径传递信号、调控转录因子AP 1表达、促进肝癌细胞生长     

沉默信息调节因子1在消化系统肿瘤中的作用

沉默信息调节因子1(SIRT1)是Sirtuin 家族中的一员,属于烟酰胺（NAD⁺）依赖的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶,能通过对多种非组蛋白及组蛋白赖氨酸残基进行去乙酰化修饰调节基因表达。近来的研究发现,SIRT1不仅能使肿瘤抑制因子去乙酰化,促进肿瘤发生,还能使肿瘤促进因子去乙酰化,抑制肿瘤发生。SIRT1与肿瘤的生物学特性密切相关,影响肿瘤分期及患者预后。在消化系统肿瘤中,SIRT1具有双面性,既可作为抑癌因子,也可发挥癌因子的作用。近年来,许多研究对SIRT1在肿瘤中的作用靶点及相关信号通路做了深入研究,关于SIRT1在肿瘤中作用机制的新研究不断出现。SIRT1已成为人们攻克肿瘤的一个研究热点。本文通过对SIRT1在肿瘤中的双重作用,尤其是在消化系统肿瘤中的不同作用靶点和参与的信号通路作一综述,希望为临床上治疗消化系统肿瘤提供更有说服力的证据。     

靶向性非病毒载体介导p21WAF-1基因对肝癌细胞的抑制作用

利用研制开发的靶向性非病毒载体GE7基因导入系统转导外源基因pCEP-p21WAF-1,检验其介导p21WAF-1基因进入肝癌细胞后,在体内外抑制肝癌细胞的生长的效率.体外实验证明,导入外源基因后,SMMC-7721和BEL-7402细胞的生长受到抑制,第8天抑制率分别达到56%和66.7%.而体内实验结果是,荷SMMC-7721裸鼠皮下瘤周注射该基因导入系统,转导pCEP-p21WAF-1 3周后,实验组肿瘤的重量(平均为(0.083 ± 0.043)g)与对照组(平均为(0.281± 0.173) g)相比明显减小,且在统计学上有显著差别(P<0.05).以上结果表明,GE7基因导入系统可以介导外源基因pCEP-p21WAF-1进入细胞内,并在体内外抑制肝癌细胞的生长.     

沉默信息调节因子2同源蛋白1通过Akt/PKB通路抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡

沉默信息调节因子2同源蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1, SIRT1/sirtuin 1)是组蛋白去乙酰化酶,参与表观遗传修饰调节,促进多种细胞的生存,但目前对椎间盘髓核细胞的作用未见研究．为了阐明临床不同来源的椎间盘髓核手术标本SIRT1的表达变化,用免疫组化、定量RT-PCR、Western blot方法对中老年腰椎间盘突出症病人及青壮年腰椎骨折病人术中髓核标本进行研究,表明老年人髓核SIRT1的mRNA及蛋白质水平均显著低于青壮年的髓核．同时,用resveratrol(SIRT1激动剂)、烟碱(SIRT1抑制剂)、SIRT1-siRNA对培养的退变髓核细胞进行处理或转染后,用流式细胞仪检测凋亡率变化,结果表明resveratrol能显著促进退变髓核细胞生存,相反,当烟碱或SIRT1-siRNA转染后则显著促进髓核细胞凋亡．为了进一步分析SIRT1抑制退变髓核细胞凋亡的分子机制,应用Western blot及抑制剂方法研究表明,当SIRT1-siRNA转染髓核细胞后能降低磷酸化Akt蛋白的表达,而白藜芦醇处理则促进磷酸化Akt蛋白的表达,当用LY294002(PI3K抑制剂)或Akt-siRNA转染后显著抑制髓核细胞的生存率．研究结果表明,SIRT1通过Akt通路能显著抑制髓核细胞凋亡,为深入揭示退变性椎间盘疾病的病理生理及生物治疗提供新的思路和靶点．     

HPV-18 E7蛋白通过SIRT1对宫颈癌细胞增殖、凋亡和自噬的影响

该研究旨在探究HPV-18 E7蛋白通过SIRT1在HPV感染的宫颈癌细胞增殖、凋亡、自噬中的作用。利用HPV-18 E7靶向小干扰RNA(E7-siRNA)抑制HPV-18 E7的表达, CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪测定细胞凋亡情况, Western blot检测细胞自噬相关蛋白Beclin1和LC3表达水平, qRT-PCR和Western blot分别检测SIRT1的mRNA和蛋白表达水平。利用表达载体在HaCaT细胞表达HPV-18 E7蛋白,再分别通过qRT-PCR和Western blot检测SIRT1的mRNA和蛋白表达水平。最后,利用SIRT1激动剂(SRT1720)预处理细胞, CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪测定细胞凋亡情况, Western blot检测细胞自噬相关蛋白Beclin1和LC3表达水平。结果发现, E7-siRNA沉默HPV-18 E7的表达后,细胞增殖和自噬显著减弱,凋亡水平升高, SIRT1的mRNA和蛋白表达水平显著降低。在HaCaT细胞表达HPV-18 E7蛋白后,发现HPV-18 E7可促进SIRT1的表达。SIRT1激...     

靶向IRE1a干扰质粒构建及对ERS时细胞增殖及凋亡的影响

目的构建靶向人IRE1a的shRNA干扰质粒（pSUPER-IRE1a）并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖及凋亡的影响。方法设计并合成靶向IRE1a基因的两条shRNA,分别克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒pS1、pS2,依次转染入HeLa细胞和HepG2细胞中。采用RT—PCR检测pS1、pS2转染前后IRE1a在HeLa细胞和HepG2细胞中的mRNA水平,免疫印迹检测pS1、pS2转染前后IRE1a蛋白的表达;MTT比色法、BrdU／DAPI双免疫荧光法及流式细胞仪分别检测各重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖及凋亡的影响。结果干扰质粒（pSUPER-IRE1a）能有效抑制HeLa细胞和HepG2细胞中IRE1a基因的表达;成功转染后,细胞处于内质网应激（ER stress）状态时,各实验组细胞增殖率及凋亡率与对照组比较,差异均具有统计学意义P〈0．05）。结论成功构建靶向人IRE1a的shRNA真核表达载体pS1、pS2,有效抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中IRE1a的表达;细胞处于ERS状态时,IRE1a-shRNA有效促进HeLa、HepG2两种肿瘤细胞的增殖;抑制HeLa和HepG2细胞的凋亡。     

SIRT1 过表达慢病毒稳转细胞系的构建及其对脂肪合成的影响

目的：通过油红O 及BODIPY染色选取脂肪代谢理想的细胞模型,并运用高内涵仪器检测SIRT1 高表达细胞系中脂肪的 变化。方法：在L-02、HepG2、Huh7 细胞中进行油红O 和BODIPY 染色,观察在不同油酸浓度下脂滴的生成情况;将构建成功的 SIRT1 过表达慢病毒载体GV166-SIRT1 及空载体病毒GV166-Control 感染L-02 细胞,qPCR 及Western-Blot 检测感染细胞中 SIRT1 的表达水平;高内涵系统检测L-02 SIRT1 和L-02 control细胞系产生的脂滴荧光强度,以确定油酸诱导的最佳浓度及最佳 刺激时间。结果：通过油红O 及BODIPY染色发现L-02 细胞更适宜作为脂肪代谢的细胞模型;成功构建SIRT1 过表达慢病毒载 体GV166-SIRT1 及空载体病毒GV166-Control,qPCR 及Western-Blot检测显示转染病毒后SIRT1 在细胞中的表达水平明显升 高;在油酸刺激浓度0.4mM、诱导时间12h 时,L-02 SIRT1细胞中脂滴的荧光强度明显较L-02 control 为低,且这种差异达到最大 化。结论：成功建立SIRT1过表达稳定转染细胞系,并证明高表达SIRT1 能够抑制脂肪合成。     

TFPI-2对人肝癌细胞生长增殖、凋亡及AFP合成的影响

目的: 探讨TFPI-2基因对人肝癌细胞Hep3B生长增殖、凋亡及甲胎蛋白AFP表达的影响。 方法: 将重组质粒PCDNA3.1-TFPI-2转染Hep3B细胞并经G418稳定筛选后,RT-PCR和Western blot检测转染前后TFPI-2 mRNA和蛋白表达水平,采用CCK-8法、生长曲线观察TFPI-2对人肝癌细胞Hep3B生长增殖的影响,通过平板克隆形成实验观察单个细胞的增殖能力,RT-PCR检测AFP mRNA的表达,并用电化学发光法测定培养上清液中甲胎蛋白AFP含量,流式细胞仪检测细胞早晚期凋亡情况。 结果: 转染成功的Hep3B细胞检测到TFPI-2 mRNA和蛋白的表达;与转染空载体及未转染的细胞相比,转染TFPI-2的细胞生长增殖能力明显减弱;AFP mRNA表达抑制率为16.51%,AFP蛋白分泌明显低于对照组(P<0.01);流式细胞术检测转染TFPI-2的Hep3B细胞早期凋亡率明显增加(24.03%±7.28% vs 8.77%±3.66%)。 结论: TFPI-2表达可显著抑制肝癌细胞生长和AFP的表达,同时还能诱导细胞早期凋亡。为进一步探讨靶向TFPI-2的肝癌基因治疗提供了实验依据。     

去乙酰化酶1基因对牛前体脂肪细胞凋亡影响的研究

去乙酰化酶1(sirtuin type1,SIRTl)是一个新的脂肪细胞调控因子,通过与其靶基因叉头转录因子1(the forkhead box O family1,FoxO1)相互作用,参与细胞增殖、分化、衰老、凋亡和代谢过程.利用吖啶橙(acridine orange,AO)染色、流式细胞仪、荧光定量PCR(quantitative real-timePCR,qPCR)等技术方法,研究SIRT1的抑制剂———烟酸胺(nicotinamide,NAM)处理后对鲁西黄牛皮下前体脂肪细胞(bovine subcutaneous preadipocytes,BSP)和肌内前体脂肪细胞(bovine intramuscular preadipocytes,BIP)凋亡的影响.观察了BSP和BIP的凋亡形态;比较了SIRT1基因抑制后,相关基因如FoxO1等在两种细胞之间的表达差异.结果表明,NAM对BSP和BIP细胞表现出相同的生长抑制作用,处理组的BSP和BIP细胞的凋亡率均显著高于对照组,其作用可能通过抑制SIRT1,激活FoxO1凋亡通路实现.SIRT1及其相关基因对BSP和BIP的调控存在不同途径.     

SIRT1与肝细胞癌

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最常见的癌症之一.然而,就目前现状而言,HCC的治疗效果还很有限.作为一个依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的去乙酰化酶, SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog 1 )参与了代谢、应激反应、衰老以及肿瘤的演进等许多重要的生物学进程.临床研究显示,SIRT1在HCC患者中异常高表达,并可预测其不良预后;进一步的研究表明,SIRT1在HCC演进中发挥了关键作用,且作用范围广泛,分子机制复杂.这提示,SIRT1有望成为新的HCC治疗靶点和诊断、预后标志物.本文拟对SIRT1在HCC的演进和预后中的具体作用及其潜在分子机制作一总结,并就SIRT1作为肝癌治疗靶点和诊断、预后标志物的可行性做出探讨.     

Function of SIRT1 in physiology

Sirtuins were originally defined as a family of oxidized nicotinamide adenine nucleotide (NAD⁺)-dependent enzymes that deacetylate lysine residues on various proteins. The sirtuins are remarkably conserved throughout evolution from archae to eukaryotes. They were named after their homology to the Saccharomyces cerevisiae gene silent information regulator 2 (Sir2). The mammalian sirtuins, SIRT1-7, are implicated in a variety of cellular functions ranging from gene silencing, control of the cell cycle and apoptosis, and energy homeostasis. As SIRT1 is a nuclear protein and is the mammalian homolog most highly related to Sir2, it has been the focus of a large number of recent studies. Here we review some of the current data related to SIRT1 and discuss its mode of action and biological role in cellular and organismal models. Published in Russian in Biokhimiya, 2009, Vol. 74, No. 7, pp. 869–876.     

缺氧微环境SIRT1亚细胞定位对结直肠癌细胞凋亡的影响及其机制研究

目的:探究缺氧微环境SIRT1亚细胞定位对结直肠癌细胞凋亡的影响及其分子机制。方法:将编码过表达野生型SIRT1以及核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)突变型SIRT1(SIRT1NLSmt)的慢病毒载体转染人类结肠癌HCT116细胞株,经嘌呤霉素筛选获得稳定过表达野生型SIRT1细胞株(LV-SIRT1细胞)和细胞质定位的NLS突变型SIRT1细胞株(LV-SIRT1NLSmt细胞),通过观察慢病毒载体编码的SIRT1-GFP融合蛋白的荧光定位,明确稳定转染细胞中外源性SIRT1的亚细胞定位。利用real-time PCR、Western blot法对分离提取的核-质蛋白进行检测,证实外源性SIRT1的表达和亚细胞定位情况。利用CCK-8细胞毒性实验、流式细胞术检测和TUNEL染色比较缺氧(1%O2)处理前后LV-SIRT1和LV-SIRT1NLSmt细胞存活或凋亡情况,Western blot法检测凋亡相关蛋白p53、ac-p53(K382)、Bcl-2、Bax、caspase-3和cleaved caspase-3表达水平。结果:Western blot、real-time PCR和免疫荧光染色结果显示稳定转染细胞均存在外源性SIRT1的过表达,NLS突变可导致SIRT1NLSmt富集于细胞质中;与亲本细胞HCT116和LV-SIRT1NLSmt细胞相比,LV-SIRT1细胞对缺氧的耐受能力最差、细胞凋亡水平最高,凋亡相关蛋白p53、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3表达水平显著升高,ac-p53(K382)和Bcl-2表达水平显著下降,且LV-SIRT1细胞的胞核ac-p53下降最为显著。结论:在缺氧微环境中,细胞核定位的SIRT1通过影响p53的去乙酰化水平促进结直肠癌细胞凋亡。     

过表达微小RNA miR-125b抑制肝癌细胞上皮-间质转换及促进细胞凋亡

微小RNA-125b（miR-125b）在许多恶性肿瘤的增殖、分化和凋亡等过程中具有很重要的作用,但miR-125b是否涉及肝癌的上皮 间质转换过程（EMT）还有待进一步研究。本研究通过构建过表达miR-125b的肝癌稳转细胞株,初步检测miR-125b对于肝癌的EMT过程和相关的TGF-β信号通路的影响,以及对于肝癌细胞凋亡的影响。以慢病毒载体pHRS-1cla EGFP 构建过表达miR-125b的载体质粒(pHRS-1cla-miR125b-CMV-EGFP),并对上述载体进行NheⅠ、XbaⅠ双酶切和测序鉴定,鉴定正确后,在293T细胞中进行慢病毒包装,浓缩病毒后,对MHCC97-H进行慢病毒感染并采用流式分选GFP阳性的细胞。实时定量PCR检测表明肝癌细胞稳转株MHCC97-H-PHRS-miR-125b-EGFP的miR-125b表达量是空载体转染组的6倍。Western印迹检测发现,与空载体对照组相比,MHCC97-H-PHRS-miR-125b-EGFP细胞中间质细胞标志α-SMA表达显著下调,上皮细胞标志E-cadherin表达显著上调,同样的,用Western印迹检测也发现MHCC97-H-PHRS-miR-125b-EGFP细胞中TGF-β信号通路关键下游分子Smad2和Smad4的表达显著下调,细胞凋亡检测结果表明,与对照组相比,过表达miR-125b的稳转株凋亡率增加到19.66%,加入TGF-β1后,过表达miR-125b的稳转株凋亡率进一步增加到74.7%。同样的,在体内治疗实验中,我们采用商品化的体内核酸转染试剂,在皮下肿瘤组织中过表达miR-125b mimics,结果表明miR-125b的过表达与肿瘤组织的凋亡成正相关性（r=0.83463,P < 0.01）,且免疫组化结果也表明,miR-125b过表达后,E-cadherin表达显著上调,α-SMA及Smad2和Smad4的表达显著下调。上述结果表明,我们成功构建了过表达miR-125b的肝癌细胞稳转株,并成功建立了肿瘤组织中过表达miR-125b mimics的动物模型,在体内外均观察到过表达miR-125b后对肝癌细胞EMT过程的抑制作用和对细胞凋亡的促进作用。相关研究结果加深了我们对miR-125b在肝癌中抑制肝癌发展作用机制的理解,及其作为潜在的治疗肝癌的新靶点的重要性。     

Long Non-coding RNA URHC Regulates Cell Proliferation and Apoptosis via ZAK through the ERK/MAPK Signaling Pathway in Hepatocellular Carcinoma

Long non-coding RNAs (lncRNAs) have previously been implicated in human disease states, especially cancer. Although the aberrant expression of lncRNAs has been observed in cancer, the biological functions and molecular mechanisms underlying aberrantly expressed lncRNAs in hepatocellular carcinoma (HCC) have not been widely established. In the present study, we investigated a novel lncRNA, termed URHC (up-regulated in hepatocellular carcinoma), and evaluated its role in the progression of HCC. Expression profiling using a lncRNA microarray revealed that URHC was highly expressed in 3 HCC cell lines compared to normal hepatocytes. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) analyses confirmed that URHC expression was increased in hepatoma cells and HCC tissues. Moreover, using qRT-PCR, we confirmed that URHC expression was up-regulated in 30 HCC cases (57.7%) and that its higher expression was correlated with poor overall survival. We further demonstrated that URHC inhibition reduced cell proliferation and promoted apoptosis. We hypothesize that URHC may function by regulating the sterile alpha motif and leucine zipper containing kinase AZK (ZAK) gene, which is located near URHC on the same chromosome. We found that ZAK mRNA levels were down-regulated in HCC tissues and the expression levels of ZAK were negatively correlated with those of URHC in the above HCC tissues. Next, we confirmed that URHC down-regulated ZAK, which is involved in URHC-mediated cell proliferation and apoptosis. Furthermore, ERK/MAPK pathway inactivation partially accounted for URHC-ZAK-induced cell growth and apoptosis. Thus, we concluded that high URHC expression can promote cell proliferation and inhibit apoptosis by repressing ZAK expression through inactivation of the ERK/MAPK pathway. These findings may provide a novel mechanism and therapeutic targets for the treatment of HCC.     

华蟾素对子宫内膜癌HEC-1-B细胞株凋亡和增殖的影响

目的：探讨华蟾素对体外培养子宫内膜癌HEC-1-B细胞凋亡、增殖以及侵袭能力的影响。方法：体外培养HEC-1-B细胞,经不同浓度华蟾素（0．2mg／ml、2mg／ml和20mg／m1）干预24h后,采用MTT法观察细胞生长情况,流式细胞术分析细胞凋亡,Transwell小室检测细胞体外侵袭能力。结果：华蟾素能有效抑制HEC．1．B细胞生长,诱导细胞凋亡。未经华蟾素处理的细胞凋亡率仅为2．5％,经0．2mg／ml、2mg／ml、20mg／ml的华蟾素作用24h后,细胞凋亡率分别为7．4％、44．3％和78．5％。趋势卡方检验x^2=165．4983,P〈0．0001。HEC-1-B细胞经华蟾素作用后,细胞侵袭能力降低。在高浓度时,华蟾素有可能存在细胞毒作用。结论：华蟾素能通过诱导HEC-1-B细胞凋亡,从而抑制HEC-1-B细胞生长,并且降低细胞的侵袭能力。     

去乙酰化酶SIRT1的表达及活性调控机制

SIRT1是哺乳动物中重要的NAD+依赖性去乙酰化酶,参与许多重要的生理和病理过程,如衰老、细胞死亡和肿瘤发生。如何精确调节SIRT1的表达和活性对SIRT1执行其生物学功能至关重要。文章以基因表达的不同阶段为切入点,对调控SIRT1表达及活性的机制进行了论述。