转录因子HBP1抑制骨肉瘤细胞增殖

转录因子HBP1(HMG-box containing protein 1, HBP1)属HMG家族,是1个含有513个氨基酸残基的多肽,可与RB蛋白结合,抑制许多癌基因的表达,从而抑制细胞的增殖. 本工作构建了HBP1慢病毒表达载体,病毒包装后感染骨肉瘤细胞U2OS细胞.Western印迹结果显示,感染细胞cyclin D1、c-Myc蛋白质水平降低 ,而p53蛋白质水平增加;Real-time PCR检测cyclin D1、c-Myc及p53 mRNA水平与蛋白质检测结果一致. HBP1表达载体（pEFBOS-HBP1）和报告基因载体（含 cyclin D1、c-Myc或p53 promoter）共转染U2OS细胞后的荧光素酶分析发现,HBP1可抑制cyclin D1、c-Myc启动子转录激活,促进p53启动子转录激活,并且这种抑制或激活作用具有HBP1剂量依赖性. 以细胞代龄群体倍增值PD （population doubling）为指标测试细胞生长结合软琼脂集落形成实验证明,HBP1慢病毒感染的U2OS细胞生长速度减缓、集落形成能力下降. 上述结果提示,HBP1可能通过调控细胞增殖相关基因的表达抑制骨肉瘤细胞的增殖.     

特定因子诱导多能干细胞

胚胎干细胞由于具有发育上的全能性,被认为是用于移植治疗的最佳来源。然而,由于人的胚胎干细胞直接运用引发免疫排斥以及触及伦理矛盾,人们一直在研发多能干细胞。2006年,多能干细胞的研究有了重大进展。首先,Yamanaka实验室构建用逆转录载体将候选因子导入成纤维细胞,而后检测多能性标志基因的表达。结果发现,四种因子Oct3/4、Sox2、c-Myc以及Klf4的组合产生了表达多能性标志基因才有的抗药性的克隆,意味着细胞获得了多能性。用这种方法筛选的细胞无论在形态和增殖分化能力方面均类似于干细胞,而且表达干细胞标志基因以及在体内外能向三个胚层的细胞类型分化,这种细胞被命名为诱导性多能干细胞(iPS细胞)。进一步,用更严格的筛选基因nanog得到的iPS能够嵌合到生殖系中。而后,运用改进的方法从人的成体成纤维细胞也可以得到iPS细胞。然而,这种方法得到的嵌合体小鼠存在肿瘤形成现象,可能是由于c-Myc逆转录病毒整合到了基因组。通过替代的方法,去掉c-Myc的iPS也能够获得。为了进一步降低肿瘤形成的几率,近来发展了一种不依赖于病毒的方法,用质粒载体作为介质。iPS进一步的研究热点在于安全性以及从更严格的医学角度提高诱导iPS的效率,其分子机理和相关的技术问题也有待解决和克服。     

慢病毒介导的大鼠肝BRL-3A 细胞Tmub1 基因沉默及稳定感染细胞 系的建立

目的:构建Tmub1基因慢病毒干扰载体,建立稳定转染细胞系,检测大鼠肝BRL-3A细胞中Tmub1基因表达的干扰效果。方法:设计并构建4对针对大鼠Tmub1基因的特异性shRNA干扰质粒,酶切鉴定、DNA测序所得质粒。将由pRSV-Rev、pMDLg-pRRE、pMD2G和pll3.7干扰质粒组成的包装系统共转染293T细胞,产生慢病毒。所得慢病毒感染大鼠正常肝细胞BRL-3A,Western Blot检测不同靶点RNAi后Tmub1蛋白表达情况,确定有效靶点。针对有效靶点大量包装慢病毒。测定病毒滴度并以最适感染复数(multiplicity of infection,MOI)感染BRL-3A细胞后,G418抗生素筛选稳定感染细胞系BRL-3A/256。RT-PCR和Western Blot检测各组细胞Tmub1 mRNA和蛋白质的表达差异。结果:结果显示Tmub1 RNAi慢病毒载体构建成功,C0020Sh2-Hops-256干扰靶点RNAi效果最强。成功包装Tmub1基因RNAi慢病毒,测定病毒滴度为2.3×108TU/ml,对293T细胞的最适感染复数为60。成功建立Tmub1 RNAi慢病毒载体稳定感染细胞系BRL-3A/256,且在该细胞系中Tmub1 mRNA和蛋白质表达明显降低。结论:成功构建Tmub1 RNAi慢病毒载体,有效干扰BRL-3A细胞中Tmub1 mRNA和蛋白表达;成功筛选出Tmub1RNAi慢病毒稳定感染细胞系BRL-3A/256。     

SIRT6基因沉默对人肝癌细胞凋亡的影响及其机制研究

该文旨在探讨慢病毒介导的沉默信息调节因子6(silent information regulator 6,SIRT6)基因沉默对人肝癌细胞凋亡的影响及其机制。逆转录PCR(RT-PCR)和Western blot分别检测人肝癌细胞系(SK-Hep-1、Huh-7、PLC/PRF/5、Hep G2)和永生化肝细胞系(MIHA)中SIRT6基因的表达水平;利用慢病毒介导的sh RNA干扰技术靶向沉默SIRT6的表达,并通过RT-PCR和Western blot验证其沉默效率;流式细胞术检测SIRT6基因沉默对人肝癌细胞凋亡的影响,进一步应用RT-PCR和Western blot检测SIRT6基因沉默对凋亡抑制蛋白基因(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)家族m RNA和蛋白质水平的影响;最后,应用流式细胞术分析X连锁凋亡抑制蛋白基因(X-linked inhibitor of apoptosis protein gene,XIAP)在SIRT6基因沉默诱导的肝癌细胞凋亡中的作用。结果显示,SIRT6基因在人肝癌细胞系中表达上调;慢病毒介导的sh RNA能抑制人肝癌细胞中SIRT6基因的表达;沉默SIRT6基因的表达能诱导人肝癌细胞凋亡,并降低XIAP的m RNA和蛋白质水平;过表达XIAP能逆转SIRT6基因沉默所诱导的人肝癌细胞凋亡。该研究结果提示,SIRT6基因沉默可能通过调节XIAP的表达从而诱导人肝癌细胞凋亡。     

共表达外源OCT4/SOX2能够激活人胚肾细胞中内源NANOG的转录

自2006年诱导多能干细胞（iPS）技术诞生以来,采用病毒等载体进行的诱导方法已取得了成功,但是其致瘤性的影响限制了病毒载体的推广与应用,而采用非病毒载体诱导iPS细胞成为研究的热点. 本研究通过两个启动子的独立启动,构建了带有绿色荧光标记的OCT4/SOX2共表达诱导载体(pOct4/Sox2-EGFP). 将该载体转染HEK 293FT 细胞后,阳性克隆明显表达绿色荧光,并通过RT-PCR,免疫荧光等方法证明其中的转录因子OCT4和SOX2能在转染细胞中高效表达,同时诱导受体细胞中内源NANOG的转录表达. 本研究说明OCT4/SOX2共表达载体能激活NANOG基因的内源表达,暗示着非病毒不整合载体pOct4/Sox2-EGFP本身或与其它转录因子和小分子结合可用于诱导成体细胞的重编程. 因此,本研究为下一步应用质粒载体诱导体细胞重编程为iPS细胞的研究奠定了工作基础.     

血红素加氧酶-1对肝癌细胞细胞周期调控因子的影响

目的观察血红素加氧酶-1（heme oxygenase 1,HO-1）对人肝癌细胞HepG2细胞周期调控因子的影响。方法构建含有野生型和突变型HO-1基因的重组载体pcDNA3．1（＋）-wtHO-1和pcDNA3．1（＋）-mHO-1G143H。利用脂质体介导的方法将构建好的重组载体转染肝癌细胞系HepG2,以空载体转染作为对照组。通过G418筛选建立稳定表达野生型和突变型HO-1的HepG2肝癌细胞系。经半定量RT—PCR、Western印迹检测转染细胞系中HO-1 mRNA和蛋白的表达水平。在HO-1表达改变的稳转细胞系中,利用Western印迹检测转染细胞系中P21、P27蛋白表达水平。结果成功实现了野生型和突变型HO-1在HepG2细胞中的过表达;野生型和突变型HO-1过表达均能诱导抑癌基因p21和p27的表达。结论HO．1过表达诱导抑癌基因p21和p27的表达与血红素分解产物无关。HO-1可能通过其它机制调节p21和p27的表达。     

无饲养层和动物源蛋白的β-地中海贫血诱导多能干细胞系的建立

β-地中海贫血患者因无合适的造血干细胞供体来源从而不得不靠输血维持生命。诱导多能干细胞(iPS)技术为获得患者自身遗传背景的干细胞进行临床治疗开拓了新途径。目前,建立iPS细胞系的过程需要使用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层和动物源的蛋白成分,因此建立的iPS细胞系存在病原体和动物源蛋白污染的可能性,不能应用于临床。采用目前商品化的TeSRTM2和StemAdhereTMDefined Matrix限定培养体系,利用Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 4个转录因子组装在同一表达载体的可切除的慢病毒感染人β-地中海贫血成纤维细胞,建立了5株无饲养层和动物源蛋白的β-地中海贫血iPS细胞系,这些iPS细胞系具有人胚胎干细胞典型的特征,表达人胚胎干细胞的多能性分子标记,如Oct4、Nanog、Tra-1-60等。在体外分化能够形成拟胚体,在体内分化能够形成含有3个胚层类型细胞的畸胎瘤。     

兔Oct4启动子驱动RFP基因表达载体的构建及验证

转录因子OCT4在维持和调控胚胎干细胞的多能性中发挥着重要的作用。Oct4基因启动子驱动标志蛋白的表达对研究胚胎干细胞多能性和建立iPs细胞有重要意义。由于GFP在慢病毒转染过程中常用作转染标记,计划构建兔Oct4基因启动子（rOct4）驱动红色荧光蛋白表达的载体,这将有利于兔ES细胞和iPS细胞制备的研究。通过PCR方法扩增rOct4,构建了rOct4驱动RFP基因的表达载体rOct4-RFP。经转染小鼠ES细胞验证正确后,将rOct4-RFP质粒转染兔成纤维细胞系获得rOct4-RFP成纤维细胞系。经过酶切和测序验证,证明rOct4-RFP构建成功,而且能够在小鼠Es细胞系E14中表达细胞红色荧光蛋白,并受细胞分化状态的调控。通过脂质体介导的基因转移、抗性筛选和PCR鉴定建立了rOct4-RFP转基因成纤维细胞系。     

CXCR4慢病毒载体的构建及其在人脐带血间充质干细胞的表达

目的：构建趋化因子CXC亚族CXCR4的慢病毒表达载体并观察其转染人脐带间充质干细胞后的表达。方法：用逆转录PCR方法获取CXCR4基因编码区片段,将构建的慢病毒载体质粒pLVTHM-EGFP-CXCR4与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2．G共转染293T细胞,包装生产慢病毒。用相同滴度的慢病毒转导等量间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell,MSCs）,后采用Real time PCR检测CXCR4 mRNA、Western Blot方法检测蛋白质的表达。结果：PCR、酶切和测序结果表明成功的构建了CXCR4基因重组慢病毒载体。同时用该慢病毒载体转染MSCs后可有效地增加MSCs中CXCR4的表达。结论：成功构建了CXCR4的慢病毒表达载体并能在MSCs中表达,为进一步研究其在干细胞移植中的应用奠定基础。’     

诱导多能干细胞研究进展

用4个外源基因从完全分化的人成纤维细胞诱导获得了具有胚胎干细胞特性的诱导多能干细胞(iPS细胞),成功逆转了细胞单向发育的规则,取得了细胞重编程和干细胞研究中的重大突破.围绕c-Myc基因和基因载体、诱导效率和外源基因替代因子等方面的研究内容,综述了自2007年人iPS细胞构建至今,国内外在改进iPS细胞诱导方法上的主要研究进展.     

Integration-free Methods for Generating Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem （iPS） cells by exogenous expression of four factors, Oct4, can be generated from mouse or human fibroblasts Sox2, Klf4 and c-Myc, and hold great potential for transplantation therapies and regenerative medicine. However, use of retroviral vectors during iPS cell generation has limited the techniques clinical application due to the potential risks resulting from genome integration of transgenes, including insertional mutations and altered differentiation potentials of the target cells, which may lead to pathologies such as tumorigenesis. Here we review recent progress in generating safer transgene-free or integration-free iPS cells, including the use of non-integrating vectors, excision of vectors after integration, DNA-free delivery of factors and chemical induction of pluripotency.     

c-Myc对诱导性多能干细胞的诱导效率及全能性影响的研究

该研究探讨转录因子c—Myc对多能诱导干细胞（inducedpluripotentstemcells,iPS）诱导效率及形成的iPS克隆全能性的影响。将Yam,dnaka四因子（Oct4、Sox2、Klf4和C—Myc,OSKM）和不舍C。Myc的三因子（OSK）病毒分别感染OG2小鼠成纤维细胞（mouseembryofibroblast,MEF）,诱导成为iPSN胞,通过计数iPS克隆形成数目和流式细胞仪分析iPS克隆的绿色荧光蛋白（GFP）阳性比例。比较OSKM和OSK诱导iPS的效率。分别挑取三株OSK和OSKM诱导的iPS克隆,采用荧光定量PCR法、碱性磷酸酶fAP）染色法和免疫荧光法检测iPS克隆的干性相关蛋白的表达;采用畸胎瘤实验、嵌合体形成实验和四倍体补偿实验检测iPS克隆的全能性。结果显示：在该实验室诱导体系里,OSK病毒感染MEF后形成的iPS克隆数目明显增多,GFP阳性克隆的比例增加。OSK和OSKM诱导iPS克隆的干细胞基本特征,包括形态、AP染色、干细胞特异性基因表达、三胚层形成均没有明显差异。然而,OSK诱导iPS克隆在形成嵌合体小鼠的全能性评估实验中的阳性比例高于OSKM克隆,且只有OSK克隆株能够获得生殖系传递小鼠和四倍体补偿小鼠。该研究表明,在实验诱导体系里去除C—Myc的三因子OSK诱导iPS的效率显著高于OSKM四因子,且三因子诱导iPS克隆具有更好的全能性。