铜绿假单胞菌多重耐药基因的筛选及鉴定

[目的]研究铜绿假单胞菌中与耐药性相关的基因.[方法]筛选转座突变体文库中对多种抗菌药物敏感的突变体,通过随机PCR、核苷酸测序及序列比对确定突变体中转座子的插入位点及其破坏的基因.[结果]筛选得到2株对多种抗菌药物敏感的突变体,其中被破坏的基因分别为功能未知的新基因PA2580和PA2800.[结论]PA2580和PA2800可能分别通过参与细胞氧化还原作用和细胞壁合成进而与铜绿假单胞菌耐药性相关.     

禽致病性大肠杆菌E058株毒力基因(aerobactin)与sit操纵子基因突变株的构建及其致病性

[目的]探究毒力基因aerobactin与sit操纵子与禽致病性大肠杆菌E058株致病作用的相关性.[方法]利用Red同源重组方法,构建APEC E058株aerobactin与sit操纵子基因缺失株E058Δvir,并通过一系列的体内及体外试验对其生物学特性进行研究.[结果]生长曲线测定、细菌侵袭试验及体外竞争等试验结果表明,突变株与亲本株差异不显著;体内动态分布试验结果显示,突变株E058Δvir在5个被检脏器中均极显著地低于亲本株(P＜0.001).[结论]aerobactin与sit操纵子与禽致病性大肠杆菌E058株的致病性相关,是其重要的致病因子.     

铜绿假单胞菌PA1550基因对泳动及蹭动的影响

[目的]:研究与铜绿假单胞菌运动能力相关的基因.[方法]:以一株临床分离的铜绿假单胞菌PA68做受体菌,应用人工Mu转座技术建立了库容为2000的突变子文库,从中筛选出泳动能力和蹭动能力丧失或减弱的突变子,通过基因克隆、测序,GenBankBLAST比对测序结果,互补基因表达确定与铜绿假单胞菌运动能力相关的基因.[结果]:突变子Y46在丧失了泳动运动能力的同时,蹭动能力也发生了减弱.在Y46突变子中,Mu转座子插入到功能完全未知的基因PA1550中.对极性效应及PA1550所在操纵子的分析表明,Mu转座子对插入点下游的基因的转录并不造成影响.[结论]:PA1550与铜绿假单胞菌的泳动及蹭动能力有关.     

苏云金芽胞杆菌HD-73菌株sigL基因突变体的特性分析

[目的]通过分析苏云金芽胞杆菌sigL基因突变体的特征,进一步明确sigL基因在苏云金芽胞杆菌中的功能.[方法]测定了苏云金芽胞杆菌HD-73菌株,sigL基因缺失突变菌株和互补菌株在不同营养成分的培养基中的生长曲线以及在不同氮源条件下的生长情况.分别将调控aco操纵子(编码3-羟基丁酮脱氢酶系统)的转录调节基因acoR和调控bkd操纵子(编码催化支链脂肪酸合成的酶系统)的转录调节基因bkdR的启动子与lacZ基因融合,并转入出发菌株和sigL突变体中,测定β-半乳糖苷酶的活性.[结果]sigL突变体不能利用精氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸为唯一的氮源;β-半乳糖苷酶的活性分析表明:在sigL突变体中acoR基因和bkdR基因的启动子活性降低.序列比对分析表明:Bt中的AcoR和BkdR的蛋白结构域与依赖于σL的转录调节因子的保守序列相似.[结论]苏云金芽胞杆菌中sigL基因的缺失可能阻碍了某些重要碳、氮源参与的代谢途径.在Bt中AcoR和BkdR是依赖于σL的转录调节因子.     

枯草芽孢杆菌核黄素操纵子与ribC基因的修饰与遗传效应

[目的]研究核黄素操纵子(rib)组成型高表达,以及ribC基因低水平表达对枯草芽孢杆菌过量合成核黄素的影响.[方法]在染色体原位修饰启动子,用mRNA稳定子替换mRNA前导区,使rib操纵子组成型高表达;修饰ribC基因的启动子,降低ribC基因的表达水平.采用qRT-PCR方法,表征基因的相对表达水平;通过摇瓶发酵,测定重组菌的生物量和核黄素产量,表征相关基因修饰所表现的遗传效应.[结果]用gsiB mRNA稳定子替换核黄素操纵子的mRNA前导区,使其相对表达水平提高了约1 500倍.ribC基因启动子-35区的首个碱基由“T”突变为“C”,使ribC基因的表达水平下降了97％以上.得到的重组菌株LX34在补加蔗糖20 g/L的LB培养基上摇瓶发酵36 h,可积累核黄素2.1 g/L,同时生物量没有明显下降.[结论]使用gsiB mRNA稳定子,能够有效地提高目标基因或操纵子的表达水平;启动子-35区首个碱基的点突变,能够有效降低ribC基因的表达水平;rib操纵子过量表达和ribC基因低水平表达,使细胞能够过量合成并积累核黄素.     

苏云金芽胞杆菌spoⅢD基因缺失突变株的特点

微镜观察和芽胞计数分析显示,突变株基本丧失了形成芽胞的能力,但依然形成晶体.SDS-PAGE结果显示,在SSM培养基中,突变株对伴胞晶体蛋白的形成量影响并不显著;在营养较富集的Luria-Bertani培养基中,突变株中伴胞晶体蛋白的形成量较野生型和互补株明显降低.利用载体pHT315携带spoⅢD操纵子互补突变株,互补株恢复了产生晶体和芽胞的能力.[结论]本研究证明spoⅢD基因是苏云金芽胞杆菌芽胞形成所必需,同时与晶体蛋白的表达相关.     

斯氏假单胞菌A1501固氮新基因PSTl305的功能分析

[目的]研究斯氏假单胞菌A1501基因组"固氮岛"中PST1305基因在A1501生物固氮过程中所起的作用.[方法]利用同源重组与三亲接合的方法构建PST1305的非极性突变株.乙炔还原法测定固氮酶活.RT.PCR分析PST1305基因与其周围基因转录单元的关系,Real-Time PCR比较PST1305在最佳固氮与非固氮条件下表达水平的差异.[结果]突变株np1305的固氮酶活显著降低,功能互补菌株np1305Comp能基本恢复细胞的固氮作用.PST1305与其上游的nifB、fdxN、下游的nifQ等基因位于同一个转录单元,组成一个操纵子.基因芯片表明,PST1305基因在固氮比非固氮条件下表达量显著上调(约38.7倍),Real-Time PCR验证支持这一结果.[结论]PST1305基因参与固氮过程,其突变会影响固氮酶的活性,该基因可能通过参与A1501固氮酶电子传递或者固氮酶的氧保护过程影响固氮效率.     

苏云金芽胞杆菌G03 spoIVF操纵子敲除对芽胞和晶体形成的影响

spoIVF是一个普遍存在于芽胞杆菌中的操纵子。在枯草芽胞杆菌中,它编码的两个蛋白是芽胞形成所必需的。采用基因重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌G03菌株中的spoIVF操纵子,构建了spoIVF缺失株G03(spoIVF-)。研究表明:该突变株丧失了形成芽胞和晶体的能力。lacZ基因与cry1Aa基因的启动子融合表达分析发现:突变株中的cry1Aa基因的活性严重降低。利用载体pSTK携带spoIVF操纵子在突变株中的表达,使突变株部分恢复了产胞和形成杀虫晶体蛋白的能力。这说明spoIVF操纵子是所必需的,同时该操纵子还影响σE因子控制的cry1Aa基因表达。     

基因atpA、purHD和ndh的过量表达对大肠杆菌DH5α生长的影响

[目的]理解大肠杆菌DH5α及其耐乙酸突变株DA19在基本培养基中生长和乙酸积累差异的机理.[方法]根据前期针对两个菌株蛋白质组和培养中物料及能量平衡的分析,通过PCR分别扩增大肠杆菌DH5α及DA19的atpIBEFHAGDC基因、purHD基因和与NADH氧化代谢相关ndh基因及其各自的调节区,以及NADH脱氢酶Ⅰ基因(nuoA-N)的调节区.将atpA、purHD和ndh基因分别克隆到载体pTrc99a中,转化DH5α,研究基因过量表达对生长的影响.[结果]测序结果表明两个菌株的这些DNA序列与公布的大肠杆菌K-12的相应序列完全一致,在DH5α菌株中分别过量表达atpA、purHD或ndh基因可以在一定程度上改善菌体的生长.[结论]过量表达purHD或ndh基因比过量表达atpA基因的效果更好,但与DA19的生长相比仍然存在较大差距,反映了代谢全局调节的重要性.     

铜绿假单胞菌全局调控因子RsmA的缺失影响2个吩嗪基因簇的表达

[目的]为了研究铜绿假单胞菌全局调控因子RsmA对两个吩嗪(Phenazine)合成基因簇phz1和phz2的调控方式与机制.[方法]采用基因缺失和抗性基因(gentamycin resistance cassette,aacC1)插入相结合的策略构建了rsmA基因缺失突变株PA-RG ;通过构建互补表达载体和过表达载体,进一步确认RsmA对绿脓菌素的调控作用 ;采用电转化方法将构建的翻译融合表达载体pMEZ1(phz1'-'lacZ)和pMEZ2(phz2'-'lacZ)分别导入铜绿假单胞菌突变株PA-RG和野生株PAO1,采用Miller法测定融合β-半乳糖苷酶活性.[结果]在GA培养基中,互补分析和过表达分析表明,RsmA抑制绿脓菌素的合成.此外,pMEZ1在突变株PA-RG中的表达增强,为野生株的2-3倍 ;而pMEZ2在突变株PA-RG中的表达降低,野生株是突变株的2倍.[结论]由此初步判定,铜绿假单胞菌全局调控因子RsmA对两个不同吩嗪合成基因簇的调控作用具有特异性,在一定程度上RsmA负调控phz1,正调控phz2.     

霍乱弧菌中调控aphB 的基因筛选及其功能

【目的】筛选霍乱弧菌C6706-中调控LysR家族蛋白AphB表达的基因。【方法】将霍乱弧菌埃尔托型菌株C6706-aphB启动子区克隆到2个报告质粒pBBRLux和pKP302上,并将其导入霍乱弧菌C6706-中,以此作为出发菌株。利用出发菌株与转座子pSC123接合构建LZV630-302转座子随机突变文库,通过测定化学发光强度检测aphB启动子的表达水平,筛选aphB表达受影响的突变株。利用随机PCR方法检测转座子插入位点,并测序比对分析基因。【结果】从7个转座子库中(共约4万个突变株)得到能影响aphB表达(均导致下降)的2株突变株T1和T2。测序比对发现T1中转座子插入在vc1585读码框内,T2中转座子插入在距vc1602基因末端7 bp处。【结论】获得aphB表达改变的突变株,基因vc1585和vc1602可能直接或间接影响aphB表达,为进一步研究aphB表达调控影响因素奠定了基础。     

中华根瘤菌自体诱导物合成酶基因的筛选及其在大肠杆菌中的表达

通过携带有mariner转座子的质粒pJZ290随机插入诱变中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)建立突变子文库,并从中筛选到自体诱导物(autoinducer,AI)部分缺失突变株YW1。Arbitrary PCR扩增、DNA测序得到YW1基因组DNA中mariner转座子两端侧翼序列,经DNA序列拼接在GenBank上进行同源性分析后获得一个621bp的完整的开放阅读框(ORF),该ORF编码的酶具有206个氨基酸,与草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)WSM419的LuxI类自体诱导物合成酶(autoinducer synthase)TraI的同源性高达99%。因此,也将该基因命名为traⅠ。将该基因克隆到广宿主范围表达载体pYC12并在大肠杆菌Escherichia coli DH5α中成功表达,C18反相薄层层析(TLC)在阳性重组子培养上清中检测到四种自体诱导物分子,其中的两种正是AI缺失突变株YW1所缺失的AI,这些结果表明该traⅠ基因在苜蓿中华根瘤菌负责合成两种自体诱导物分子,为进一步研究其群体感应系统奠定了理论基础。     

The YebC family protein PA0964 negatively regulates the Pseudomonas aeruginosa quinolone signal system and pyocyanin production

Bacterial pathogenicity is often manifested by the expression of various cell-associated and secreted virulence factors, such as exoenzymes, protease, and toxins. In Pseudomonas aeruginosa, the expression of virulence genes is coordinately controlled by the global regulatory quorum-sensing systems, which includes the las and rhl systems as well as the Pseudomonas quinolone signal (PQS) system. Phenazine compounds are among the virulence factors under the control of both the rhl and PQS systems. In this study, regulation of the phzA1B1C1D1E1 (phzA1) operon, which is involved in phenazine synthesis, was investigated. In an initial study of inducing conditions, we observed that phzA1 was induced by subinhibitory concentrations of tetracycline. Screening of 13,000 mutants revealed 32 genes that altered phzA1 expression in the presence of subinhibitory tetracycline concentrations. Among them, the gene PA0964, designated pmpR (pqsR-mediated PQS regulator), has been identified as a novel regulator of the PQS system. It belongs to a large group of widespread conserved hypothetical proteins with unknown function, the YebC protein family (Pfam family DUF28). It negatively regulates the quorum-sensing response regulator pqsR of the PQS system by binding at its promoter region. Alongside phzA1 expression and phenazine and pyocyanin production, a set of virulence factors genes controlled by both rhl and the PQS were shown to be modulated by PmpR. Swarming motility and biofilm formation were also significantly affected. The results added another layer of regulation in the rather complex quorum-sensing systems in P. aeruginosa and demonstrated a clear functional clue for the YebC family proteins.     

GacA对假单胞菌株M18两个phz基因簇和菌群传感的调控

摘要:【目的】假单胞菌株M18（Pseudomonas sp. M18）是从甜瓜根际土壤中分离获得的一株对多种植物病原菌具有显著拮抗作用的菌株,在菌群传感（quorum sensing）系统的调控下,能分泌吩嗪-1-羧酸（PCA）以及多种吩嗪（phz）类衍生物的抗真菌物质。全局性因子GacA是M18菌株吩嗪类物质的合成与菌群传感系统的重要调控因子,本文将就GacA对上述两者的调控做进一步研究。【方法】PCR基因扩增和测序研究M18菌株中PCA合成基因簇,运用RT-PCR及构建phzA-lacZ转录融合手段     

铜绿假单胞菌PAO1中c-di-GMP代谢相关基因PA0575对表型的影响

【背景】铜绿假单胞菌PAO1中存在与环鸟苷二磷酸(cyclic-di-guanosine monophosphate,c-di-GMP)代谢相关基因PA0575。【目的】探讨铜绿假单胞菌PAO1中环鸟苷二磷酸代谢相关基因PA0575对运动能力及生物膜的影响。【方法】通过PCR对菌株遗传背景进行确认;利用刚果红结合实验及电转PcdrA-gfp质粒间接测量胞内c-di-GMP水平;利用泳动性(swimming)、蜂群泳动(swarming)、蹭行运动(twiching)和生物膜定量实验对细菌进行表型分析,并在运动培养基中添加抗生素研究其对运动能力的影响;针对PA0575基因进行融合蛋白表达载体的构建,并对蛋白进行原核诱导表达。【结果】3株突变体菌株的转座子插入突变位点不一致,胞内c-di-GMP水平检测结果显示,PA0575-1菌株的c-di-GMP含量高于野生型PAO1菌株(P0.05),PA0575-2、PA0575-3菌株胞内c-di-GMP水平与野生型PAO1菌株无差异(P0.05)。运动能力检测实验中,与野生型PAO1菌株相比,PA0575-1菌株泳动性增强(P0.05);PA0575-2、PA0575-3菌株的泳动性、蜂群运动均增强(P0.05);该基因不同位点的突变均导致氯霉素对菌株的运动能力产生抑制作用。生物膜定量结果显示,与野生型PAO1菌株相比,细菌培养18 h后PA0575-1的生物膜含量降低(P0.05),PA0575-2、PA0575-3菌株的生物膜含量升高。最后成功构建了PA0575基因不同结构域的8个表达载体,并获得了异源表达蛋白。【结论】PA0575基因降低铜绿假单胞菌胞内c-di-GMP的水平,影响表型的同时也抑制了氯霉素抗性基因的表达。以上研究为PA0575基因对表型的影响奠定了基础。     

Identification of a novel regulator of the quorum-sensing systems in Pseudomonas aeruginosa

Quorum sensing is a global gene-regulatory mechanism in bacteria that enables individual bacterial cells to communicate and coordinate their population behaviors. Quorum sensing is central to the pathogenesis of many bacterial pathogens including Pseudomonas aeruginosa and therefore has been exploited as a target for developing novel antipathogenic drugs. In P. aeruginosa , three intertwined quorum-sensing systems, las, rhl , and the 2-alkyl-4(1 H )-quinolone system, which includes the Pseudomonas quinolone signal (PQS), control virulence factor production, and pathogenesis processes. Previously, we obtained a mutant with diminished expression of the phzA1B1C1D1E1F1G1 operon that is involved in the production of virulence factor phenazine compounds. In this study, the mutant was further characterized, and evidence indicating that the disrupted gene PA1196 in the mutant is a potential regulator of the rhl and PQS systems is presented. PA1196 positively controls the expression of the rhl and PQS systems and affects bacterial motility and multiple virulence factor expression via the quorum-sensing systems. This adds an important new player in the complex quorum-sensing network in P. aeruginosa .     

铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药相关基因的筛选

为了在基因组水平筛选获得铜绿假单胞菌PAO1对碳青霉烯类抗生素耐药相关基因,本研究通过构建PAO1转座突变体文库、筛选对亚胺培南、美罗培南和比亚培南耐药及敏感突变株;通过随机PCR、核苷酸测序及序列比对的手段,确定了突变体中转座子的插入位点及其破坏的基因,获得了48个PAO1中对碳青霉烯类抗生素耐药和敏感相关的基因,其中27个基因突变后表现为耐药性增强,21个基因突变后表现为药物敏感性增强.本实验筛选获得的48个基因中有5个与Alvarez-Ortega和Dotsch等人筛选的基因重复.通过对PA0011,PA0667及PA3901进行基因敲除及遗传互补,进一步确证这3个基因均与PAO1对碳青霉烯类的耐药性相关.本次筛选发现了38个新的与碳青霉烯类耐药相关的基因,其中包括13个class4类基因.对这些新基因的进一步研究,不仅有利于全面了解铜绿假单胞菌的耐药机制及其调控网络,而且有利于药物作用靶点的发现,为有效治疗铜绿假单胞菌的感染提供新思路.