Qβ RNA 复制酶中亚基的共表达对β亚基溶解性的影响

在体外RNA和蛋白质合成及自复制系统的研究中 ,QβRNA复制酶作为以RNA为模板的RNA聚合酶 ,是比较重要的应用酶种之一。该酶由 4个亚基组成 ,其中只有 β亚基是由病毒基因编码 ,而其他 3个亚基都是宿主蛋白。利用普通表达载体合成Qβ复制酶时 ,得到的 β亚基几乎都是不溶性蛋白 ,从而影响了Qβ复制酶的活性和产率。为尝试提高 β亚基的溶解性 ,构建含有β亚基基因的表达质粒pBAD 33 rep ,同时利用pET2 1a( )为表达载体表达其他 3个亚基进行共表达研究。不同亚基组合的共表达结果通过SDS PAGE分析表明 ,当 β亚基与EF Tu Ts亚基共表达时 ,溶解度有一定的提高 ,而且可溶性部分也具有复制酶活性。通过调节共表达诱导物浓度 ,相对增强可溶性 β亚基的表达 ,可溶性Qβ复制酶酶量得到相应的提高     

猪β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用

了研制高活性的重组猪β干扰素,对PoIFNβ成熟蛋白第3、7和164位的3个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏嗜性改造并构建了酵母表达载体pPICZαAPIB。pPICZαAPIB经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X33。多株PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导发酵分泌表达了PoIFNβ, 其中B1株酵母的PoIFNβ产量最高,约为2.5×10.5U/mL,其表达量约为60μg/mL,比活为4.17×10.6U/mg。将发酵上清液用PEG20000浓缩后进行SDSPAGE和Western blot检测,结果表明表达产物是分子量约为28kDa和25kDa蛋白的混合物,两者均可与PoIFNβ阳性抗血清发生特异反应。表达产物比PoIFNβ理论推导分子量（约20.8kDa）大,推测可能是表达产物发生了不同程度的糖基化。重组PoIFNβ对伪狂犬病毒在细胞中增殖可呈现抑制作用,并且rPoIFNβ对伪狂犬病毒在MDBK细胞上早期增殖的抑制效果最为明显。     

IL-1β的基因克隆及在原核中的表达

从人外周血中分离出白细胞,提取其总RNA,根据文献报道的IL1β的核苷酸序列合成5′和3′端引物,用RTPCR的方法获得了IL1β的基因cDNA,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量占全菌的40%,并对表达产物进行了分离纯化和活性分析,获得了纯度大于98%的样品,该样品表现出明显的生物学活性。     

人β神经生长因子在大肠杆菌中的高表达

将编码人β神经生长因子(Huβ-HGF)的基因克隆到由T7噬菌体启动子控制的pET11c大肠杆菌表达载体中,重组质粒经鉴定含有Huβ-NGF基因,未解聚的表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),结果显示出二聚体27kD的蛋白带。而完全解聚的表达产物SDS-PAGE显示出一条13β5kD单体带。经凝胶电泳扫描,表达带占菌体总蛋白的14.5％。用兔抗鼠β—NGF的多克隆抗体进行的Western-Blot的结果表明,二聚体同单体都有免疫原性。在生物活性的鉴定中,菌体表达产物可以使小鸡鸡胚的背根神经节产生神经元突起,由此可以证明该表达产物有较高的生物活性。     

诺卡氏菌形放线菌β甘露聚糖酶的纯化和性质

产β１ ,４Ｄ甘露聚糖酶的诺卡氏菌形放线菌（ Ｎｏｃａｒｄｉｏｆｏｒｍ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ） 菌株ＮＡ３５４０ ,发酵培养７２ｈ ,发酵液离心去菌体,上清经硫酸铵沉淀,９５ ％ 乙醇沉淀,ＣＭＳｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０ 柱层析、羟基磷灰石柱层析、ＤＥＡＥ纤维素离子交换及Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００ 分子凝胶过滤柱等步骤,β甘露聚糖酶的比活提高了１３７ 倍,获得凝胶电泳均一的蛋白样品。经ＳＤＳＰＡＧＥ 和凝胶过滤法分别测定β甘露聚糖酶分子量为４１ｋＤ和４０ｋＤ,证明该酶为单聚体;用等电聚焦电泳测得其等电点为４－８ ;经氨基酸组成分析,发现蛋白中有较高含量的Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ａｌａ 及Ｇｌｕ 残基。该酶的最适反应温度为７５ ℃,在不超过６０ ℃时酶活较稳定;酶反应的最适ｐＨ 为８－０ ,ｐＨ 稳定范围为６－５～１１－０ 。重金属离子Ｈｇ^２＋ 、Ｃｕ^２＋ 、Ｐｂ^２＋ 、Ｆｅ^3＋ 、Ｃｏ^２＋ 、Ｚｎ^２＋ 能强烈抑制该酶活性,而Ｍｎ^２＋ 、Ｆｅ^２＋ 、Ａｇ^＋ 对该酶有部分的抑制作用,低浓度的Ｎａ^＋ 、Ｋ^＋ 、Ｌｉ^＋ 对该酶基本没有影响。     

苏云金芽孢杆菌vip3A基因的检测及保守性分析

Vip3A蛋白是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）在营养期分泌的一类新型杀虫蛋白。用PCR方法从114个Bt菌株和41个Bt标准菌株中筛选到39株即约25%的菌株含有vip3A基因。利用所制备的Vip3A蛋白的多克隆抗体对以上含有vip3A基因的Bt菌株进行Western印迹分析,发现多数PCR反应为阳性的菌株都产生89 kD大小的蛋白,其中有4株没有Vip3A蛋白的表达。从以上菌株中挑选2个对夜蛾科害虫具有较高和较低毒力的菌株,即S101和611,并分别进行vip3A基因的克隆和测序,再与GenBank上所登录的其它6个全长vip3A基因和2个已报道的但未登录GenBank的vip3A基因进行核苷酸和氨基酸序列比较,结果表明,vip3A是一个极其保守的基因。将以上所克隆的2个vip3A基因即vip3AS101和vip3A611分别插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP-S101和pOTP-611,转化到大肠杆菌M15,经1 mmol/L IPTG诱导后均表达89 kD大小的Vip3A蛋白。蛋白可溶性试验表明,Vip3A-S101和Vip3A-611分别有48%和35%的蛋白是可溶的。将Vip3A-S101和Vip3A-611蛋白和已报道的Vip3A-S184蛋白对初孵斜纹夜蛾 (Spodoptera litura) 幼虫进行生物测定,结果表明,3个Vip3A蛋白对斜纹夜蛾幼虫毒力没有显著性差异,这说明了Vip3A个别氨基酸的变化对蛋白的杀虫活性没有影响。     

猪瘟病毒E2基因在Pichia pastoris中的表达及其免疫活性的初步研究

将猪瘟病毒的E2基因克隆入酵母分泌型表达载体pPIC9K中,酶切线性化后电穿孔导入Pichia pastoris进行整合,经G418筛选得到高拷贝转化子,甲醇诱导表达。SDSPAGE和Western blot结果证实了酵母培养上清液中含有E2蛋白。免疫活性研究证明P. pastoris表达的E2蛋白能刺激动物产生抗猪瘟病毒的抗体。     

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

构建了家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)新型载体pBm92,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ATG改变为ATT,然后在多角体蛋白基因的+12位后连接有5个外源基因的克隆位点。将HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的+12位后,构建了pBmIFN+12;同时构建了HuIFN－β克隆在－3位后的转移载体pB．mIFN－3。将两种转移载体DNA分别与BmNPV基因组DNA共转染Bm—N细胞。利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征,筛选重组病毒。用HuIFN－β基因探针与重组病毒DNA进行杂交鉴定。重组病毒BmIFN+12感染Bm-N细胞,其上清IFN活性为2．0×10⁶Iu／ml,将BmIFN+12注射5龄家蚕虫体,表达水平为5．O×10⁷Iu／ml,是HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的-3位后获得的重组病毒表达量的2—4倍。构建的新型BmNPv载体能够在家蚕高效地表达HuIFN-β。家蚕虫体生产的rHulFN-β蛋白具有天然HuIFN-β的抗原性。     

苏云金杆菌vip3A基因的克隆、表达及杀虫活性分析

用全长PCR方法从野生型苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）菌株S184中克隆了2.3 kb大小的vip3A基因并进行了序列分析。将vip3AS184基因插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP,转化大肠杆菌M15,转化子经1mmol/L IPTG诱导后可表达89 kD大小的Vip3A-S184蛋白,并得到Western blot证实。蛋白可溶性试验表明,目的蛋白中约有19%是可溶的,用透射电镜观察到大多数蛋白是以包涵体形式存在的。因此,可以在自然条件下进行目的蛋白的纯化和对家兔进行免疫制备多克隆抗体,用于苏云金杆菌Vip3A蛋白表达的检测。利用IPTG进行诱导培养的菌液对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、斜纹夜蛾(S.litura)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)等3种害虫的初孵幼虫进行生物测定,结果表明,Vip3AS184蛋白对夜蛾科害虫具有较高的杀虫活性。     

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达

利用PCR技术,从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）基因 (BGL1),长度为2596 bp,连接到pGEMT载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框, 构建成重组质粒pSHL9K。 通过电转化将重组质粒pSHL9K插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中,获得高效表达BGL1基因的毕赤酵母重组工程菌株。重组酶的最适温度为50℃,最适pH为5.4。培养基中β-葡萄糖苷酶活性最高可达47U/mL。     

β—N-乙酰氨基己糖苷酶产生菌的筛选与产酶条件

筛选了真菌、细菌和放线菌共1121株,其中有β-HexNAcasc活力的有237株,在所筛选菌中只要有β—GlcNAcase活力,也就有β-GalNAcase活力,但两酶比值(β-GlcNAcase／β—Gal-Nacase)不同。所筛选出的溜曲霉(ASP.tamarii)S215为由土壤中分离的,其产酶最适条件为5％麸皮液体培养基,28—30℃振荡培养5—6天,补充碳源如纤维二糖、葡萄糖胺、半乳糖胺或者补充氮源(NH4)2SO4及NH4NO3,可以稍稍提高酶活。在溜曲霉的培养液中除β-GlcNAcase及β-GalNAcase外,还有a-半乳糖苷酶、β一半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-岩藻糖苷酶及α-甘露糖苷酶。     

脱氧核酶抑制近日基因period 1表达的实验研究

研究脱氧核酶对近日钟基因period1(per1)表达的影响, 进而寻找治疗和近日节律有关疾病的基因疗法. 设计合成针对per 1的脱氧核酶DRz164, DRz256, 并构建pcDNA3-per1_164:256体外转录载体, 将转录产物和脱氧核酶混合, 在一定反应条件下进行体外切割反应, 地高辛酶联免疫及酶催化显色法检测脱氧核酶的体外切割效率. 将pcDNA3-per1和DRz164或DRz256在脂质体的介导下转染NIH3T3细胞, 通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞术(FCM)检测脱氧核酶对近日基因表达的影响. 于37℃孵育2 h后, DRz164对底物的剪切百分率为63%, DRz256为50.5%. RT-PCR半定量检测per1 mRNA表达水平明显下降, FCM结果显示细胞内Per1蛋白的合成受到抑制. 脱氧核酶DRz164, DRz256体外具有定点切割近日钟基因per1mRNA组分的活性, 使转染细胞per1 mRNA 和Per1蛋白表达下降.     

多粘芽孢杆菌 (Bacillus polymyxa)β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质分析

从多粘芽孢杆菌 (Bacilluspolymyxa 1794 )中克隆得到 β-葡萄糖苷酶基因bglA。将其构建在大肠杆菌 (Es-cherichiacoli)表达载体pET28a(+)上 ,转化E .coliBL21,获得重组工程菌BL1979。重组表达的 β-葡萄糖苷酶的酶活力达到 247IU mL ,经镍柱纯化后的β-葡萄糖苷酶最适温度为 37℃ ,最适pH值为70 ,该酶经纯化后纯度可达92.7%。用非变性梯度聚丙烯凝胶电泳发现该酶具有多种寡聚体形式 ,经荧光底物活性染色表明这些寡聚体均具有β-葡萄糖苷酶活性.     

利用枯草芽孢杆菌ytkA和ywoF基因启动子与信号肽重组分泌表达mpd基因

用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pNW33N和去除了信号肽编码序列的成熟mpd基因构建了穿梭启动子探针pNW33N-mpd。用该探针从质粒pMPDP3和pMPDP29上克隆来自于枯草芽孢杆菌ytkA和ywoF基因上游的启动子功能片段,构建了穿梭表达载体pNYTM和pNYWM。将表达载体pNYTM和pNYWM转入枯草芽孢杆菌1A751获得表达菌株1A751(pNYTM)和1A751(pNYTM),mpd基因在ytkA和ywoF基因的启动子和信号肽的带动下实现了分泌表达且具有天然活性,结果表明ytkA基因的启动子强度强于ywoF基因的启动子。利用ytkA基因的强启动子和nprB基因的分泌型信号肽编码序列构建了新的穿梭分泌表达载体pYNMK,并使mpd基因在枯草芽孢杆菌WB800中得到了更高水平的分泌表达,表达菌株WB800(pYNMK)在培养到第84 h时甲基对硫磷水解酶酶活达到最高值为10.40 u/mL,是出发菌株邻单胞菌M6表达量的10.8倍,重组表达产物有91.4%分泌在培养基中。     

外源基因pheA,aroG和tyrB在苯丙氨酸合成途径中的共表达

利用基因工程技术提高了短杆菌的苯丙氨酸合成途径中关键酶活性,大幅度地增加了生物合成苯丙氨酸的产量。首先采用聚合酶链反应(PCR)从大肠杆菌的氟代苯丙氨酸抗性变异菌株基因组中扩增到与苯丙氨酸合成相关的aroG,pheA和tyrB 3个基因。其中aroG编码3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DS),pheA编码双功能酶蛋白-分枝酸变位酶(CM)和预苯酸脱水酶(PD),tyrB编码转氨酶(AT)。设计不同的酶切位点,利用质粒pUC118的多克隆位点,将3个基因按不同的顺序组合串联,然后插入穿梭质粒pCZ.10,导入短杆菌中表达。结果表明3个大肠杆菌基因在短杆菌中能够表达。其中以aroG-pheA-tyrB顺序串联而构建的黄色短杆菌工程菌株1311-GAB中的DS酶活力提高4.5倍,CM提高4.2倍,PD提高2.7倍,AT提高3.2倍;它的苯丙氨酸合成量提高2.35倍。     

利用杆状病毒载体在棉铃虫血细胞中表达大肠杆菌β－半乳糖苷酶

用携带大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因的杆状病毒转移载体pAc36O－B－gal与野生型的苜蓿丫纹夜蛾(AcNPV)DNA同时转染草地夜蛾细胞,经x—gal筛选和空斑纯化得到重组型杆状病毒AcNPV－β－gal。该重组病毒能有效地感染棉铃虫血细胞系,并高效表达出受AcNPV多角体蛋白启动子控制的、具有生物活性的外源基因产物－－β－半裂糖苷酶。80％以上的酶蛋白能分泌到细胞外,培养液中酶活可达每毫升50000单位以上,约相当于170μg酶蛋白。用要SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离表达产物和β－半乳糖苷酶在凝胶上的特异性显色反应分析,重组病毒在棉铃虫血细胞中表达的AcNPV多角体蛋白－－大肠杆菌β－半乳糖苷酶融合蛋白是以5种活性的多聚体或复合物形式存在的。     

新的红细胞分化相关基因EDRF1功能的初步研究

曾报道过通过功能筛选得到一个新的红细胞分化相关基因, 并命名为EDRF1(erythroid differentiation related factor 1, GenBank登录号为AF040247). 鉴于功能线索明确, 选择K562细胞作为模型细胞, 通过基因转染技术观察了EDRF1反义RNA表达和EDRF1过表达对细胞增殖和分化的影响, [³H]TdR掺入和半固体集落培养实验的结果显示EDRF1过表达时, 细胞增殖代谢能力有所下降. Northern印迹和RT-PCR的结果表明, 反义EDRF1表达载体转染后的K562细胞α-globin, γ-globin mRNA表达水平下降, STAT3, c-myc, GATA-1表达下调, 红细胞生成素受体(EpoR)在反义表达载体转染后表达有一定程度的上调. 说明EpoR和珠蛋白的表达调节没有内在的正协同关系, EDRF1对K562细胞增殖和分化的调节有可能是通过影响GATA-1等诸多红系特异的转录因子与顺式序列相互作用的转录活性实现的.     

黄瓜花叶病毒cDNA载体在烟草细胞中表达外源基因

为了探讨利用黄瓜花叶病毒(CMV)构建表达载体的可行性,分离了山东株(SD) CMV RNA 3的全长cDNA。测定其全序列后,采用定点突变的方法在衣壳蛋白(CP)基因起始密码子处改造出一个NsiⅠ位点,可将外源基因引入NsiⅠ位点和CP基因终止密码子上游附近的XhoⅠ或SalⅠ位点而置换掉CP基因。分别用绿色荧光蛋白(GFP)基因、β-葡糖醛酸酶(GUS)基因以及小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因3种报告基因置换CP基因。将Fny株CMV RNA 1、RNA 2和SDCMV嵌合RNA 3的cDNA分别插入pCass载体的35S启动子和终止子之间,将构建的置换型载体直接以质粒的方式转染烟草原生质体,表达了3种报告基因。     

TMSG-1基因功能的初步研究

TMSG-1是用mRNA差异显示技术克隆的转移相关基因, 它在高转移肿瘤细胞系和有转移的肿瘤组织中表达下降. 以高转移的前列腺癌细胞系PC-3M-1E8为受体细胞, 通过基因转染技术观察了TMSG-1基因表达对细胞V-ATPase活性、细胞内pH值和细胞凋亡情况的影响, 同时利用GFP对TMSG-1细胞内定位进行了分析. 结果表明, V-ATPase在PC-3M-1E8细胞系, 转染空载体和转染反义TMSG-1细胞系的活性无明显差异. 在转染正义TMSG-1的细胞系中, V-ATPase的活性比PC-3M-1E8细胞系, 转染空载体和转染反义TMSG-1细胞系均有明显增高(P < 0.001). 利用pH敏感性荧光探针BCECF测定细胞内的pH值, 结果显示转染正义TMSG-1组的pHi值有明显提高. 细胞凋亡的检测结果表明, 转染正义TMSG-1组细胞凋亡明显增多(P < 0.01), BCL2的表达显著下降. TMSG-1蛋白的细胞内定位分析表明, TMSG-1是一个跨膜蛋白, 定位于内质网、线粒体等细胞质膜系统. 实验结果表明, 前列腺癌细胞系中TMSG-1的上调可以提高细胞V-ATPase的活性, 增加细胞内的pH值, 同时TMSG-1的上调还可抑制BCL2的表达, 促进细胞凋亡的发生.     

蜂毒溶血肽前体蛋白cDNA的克隆及其融合蛋白的表达

从蜜蜂毒腺中提取总RNA ,通过RT PCR扩增得到了蜂毒溶血肽前体蛋白的cDNA ,将扩增产物克隆到 pT7Blu T载体上 ,再进一步将插入片段酶切并连接到 pUC1 1 8载体上 ,构建了重组质粒pUMP。DNA序列分析结果表明 ,克隆得到的cDNA序列与所发表序列完全相同 ,且与 β 半乳糖苷酶部分序列构成正确的读码框。含重组质粒 pUMP的大肠杆菌DH5α表达了与β 半乳糖苷酶部分序列融合的蜂毒溶血肽前体蛋白