核移植技术生产乳腺生物反应器的研究进展

乳腺生物反应器的研制带来了转基因制药业的兴起。但十几年来,显微注射技术一直是生产乳腺生物反应器的唯一实用手段,由于它本身固有的缺点,使得乳腺生物反应器未能有长足的进步。基因打靶与核移植相结合很可能成为生产乳腺生物反应器更有效的途径,它在外源基因定点整合,消除位点效应、降低生产成本、节省时间方面具有明显的优势。     

整合人mAAT基因转基因山羊的获得

旨在通过动物转基因技术开发奶山羊的乳腺生产治疗人肺纤维性囊肿的新药－人抗胰蛋白酶因子（人mAAT),选择繁殖机能优良的奶山羊56只作为供体,采用FSH＋LH做超数排卵,获取原核期胚,并进行显微注射和鲜胚移植,3月和5月两个月份超排处理后超排效果明显好于12月份,分别可获得平均排卵19．50,21．70和16．06枚,受精卵精分别为4．31,6．48和3．57枚,显微注射后胚胎移植给供体或自然发情的受体,移植受胎率分别为18．18％和25．00％,所生羔羊29只,对转入外外基因编码区N－末端和3‘调控区部分序列进行PCR,PCR-Southem和Southern检测,检出阳性转基因羊羔4只,基因的融合效率为13．79％。     

人-山羊异种核移植胚胎发育的初步研究

以体外分离培养的人胚胎成纤维细胞为核供体,经血清饥饿培养后,通过显微操作技术移入山羊去核卵母细胞中,采用化学方法激活重组胚.通过体外培养观察,2-细胞胚胎发育率可达51.33%,4-细胞发育率为31.42%,但发育至桑椹胚阶段的胚胎数目大大减少,仅为9.73%.虽然目前尚未能获得异种核移植囊胚,但实验结果说明山羊成熟卵母细胞可以支持人体细胞核完成重编程,人-山羊异种体细胞核移植重组胚可在体外完成其早期发育.     

核移植技术生产乳腺生物反应器的研究进展

乳腺生物反应器的研制带来了转基因制药业的兴起。但十几年来,显微注射技术一直是生产乳腺生物反应器的唯一实用手段,由于它本身固有的缺点,使得乳腺生物反应器未能有长足的进步。基因打靶与核移植相结合很可能成为生产乳腺生物反应器更有效的途径,它在外源基因定点整合,消除位点效应、降低生产成本、节省时间方面具有明显的优势。     

转人t-PA指形区缺失基因的山羊体细胞核移植及其继代核移植

为了探索转基因体细胞核经连续核移植后的发育潜力,以转人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞为核供体,MII期的卵母细胞质为核受体,利用胞质内注射法构建原代核移胚胎(G0),并进行了原代核移植胚胎的继代核移植研究。比较原代和继代核移植胚胎在体外发育能力上的差异;在G1、G2代核移植试验过程中,比较了供体胚胎细胞的发育阶段对核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,原代核移植胚胎的卵裂率(76.45%±1.17%)与继代核移植胚胎的卵裂率(72.18%±1.97%,76.05%±2.38%,75.99%±2.84%)无显著性差异(P>0.05)。但原代核移植胚胎的桑葚胚率(47.20%±2.93%)、囊胚率(11.00%±1.42%)显著高于G1、G2、G3代核核移植胚胎的桑葚胚率(34.99%±2.66%,28.23%±2.00%,23.34%±1.99%)、囊胚率(3.87%±0.67%,2.08%±1.66%,0);在G1、G2中,当用16-细胞期核移植胚胎作为核供体时的桑葚胚率(29.57%±1.53%,24.43%±1.87%)、囊胚率(1.96%±1.31%,2.01%±1.34%)低于用32~64-细胞时期的核移植胚胎的桑葚胚率(34.32%±1.31%,29.76%±1.66%)、囊胚率(3.86%±1.03%,3.48%±0.34%),但无显著性差异(P>0.05)。由此得出结论:转基因体细胞核移植胚胎不宜进行多代克隆;胞质内注射法构建核移植胚胎,用32~64-细胞期的胚胎作为核供体构建的核移植胚胎的体外发育率高于用16-细胞期的胚胎作为核供体构建的核移植胚胎的体外发育率。     

ht-Pam基因在山羊β-酪蛋白基因座定位整合的研究

利用体细胞基因打靶与核移植技术制备动物乳腺生物反应器是当今转基因定位整合表达的一种新技术。分别克隆山羊的β-酪蛋白基因5′调控区的6.3kb片段,外显子7、外显子8和9三个基因片段,并与克隆的人tPA突变体cDNA一起构建了含有neo和tk正负筛选标记基因的β-酪蛋白基因打靶载体P^GBC4tPA,并验证了neo基因、tk基因以及Cre-LoxP系统的有效性。将线性化的P^GBC4tPA通过电转染整合到山羊胎儿成纤维细胞基因组中,利用G418和GANC进行抗性细胞克隆的药物筛选,初步获得抗性细胞克隆244个,PCR检测后获得阳性细胞克隆31个,其中初步验证2个细胞克隆转植基因整合位点重组后的基因序列正确,并且该细胞克隆能够有效扩增。这为下一步基因打靶体细胞核移植制备山羊乳腺生物反应器奠定了基础。     

成年核移植山羊生长相关基因的表达分析

体细胞核移植过程有可能影响克隆动物生长相关基因尤其是印迹基因的表达水平。本研究运用同源引物 PCR 扩增、RACE 技术并结合同源克隆策略, 克隆了 7 个山羊生长相关基因包括 3 个印迹基因(H19、IGF2 和 IGF2R)和 4 个非印迹基因(IGF1、IGF1R、GHR 和 GHSR)的完全 CDS 或者部分 cDNA 序列, 经生物信息学技术确认后, 用荧光实时定量 PCR 对 8只成年克隆山羊中这些基因的表达水平进行分析, 结果表明 3 个印迹基因中 IGF2R 基因表达水平极显著高于对照组的自然繁殖山羊(P<0.01), 而 H19 和 IGF2 的表达则没有很大区别; 4 个非印迹基因中只有 IGF1R 的表达水平极显著高于对照组(P<0.01), IGF1、GHR 和 GHSR 的表达与对照组相似。表明即使在表型正常的成年克隆动物也存在一定的表观遗传异常。通过对获得完全 CDS 和 3′UTR 的 IGF2 基因经过生物信息学分析表明, 山羊 IGF2 基因包含一个 540 bp 的开放阅读框 (ORF)编码 179 个氨基酸。IGF2 基因 cDNA 序列和氨基酸序列以及其它基因部分序列比较分析表明, 山羊所有这些基因与绵羊的同源性要高于同牛的同源性。     

体细胞基因打靶制备动物乳腺生物反应器的策略与应用

在转基因动物研究中,由于基因表达调控元件的人工拼接和外源基因在动物基因组中随机整合所带来的“位置效应”,致使转基因动物外源基因的表达水平不高并且差异较大。为此,利用定位整合优势,对以基因同源重组为基础的基因打靶技术进行了大量研究。介绍了就利用体细胞基因打靶和核移植技术制备动物乳腺生物反应器的策略和应用情况做一综述,并对提高基因打靶效率的各种策略,打靶细胞的选择,转基因细胞核移植的低融合事件以及基因打靶制备乳腺生物反应器的优越性进行分析。     

体细胞基因打靶-核移植技术研究进展

转基因效率与外源基因表达水平低的现状一直是制约动物生物反应器研究与产业化的主要技术瓶颈。体细胞克隆动物的成功和胚胎干细胞基因打靶技术的逐步完善使得体细胞基因打靶与核移植技术的结合使用成为可能,这就为生产遗传修饰家畜提供了一种新的手段,为动物生物反应器的成功研制提供了新的技术途径。从体细胞基因打靶的载体设计、转染系统的建立、中靶细胞的筛选和鉴定以及培养体细胞寿命等方面阐述了体细胞基因打靶—核移植技术体系的最新研究进展,并对其在异种器官移植、建立动物疾病模型、提高家畜生长性能以及生产药用蛋白等各个领域中的应用前景作了展望 。     

转人t-PA指形区缺失基因的山羊体细胞核移植及其继代核移植

为了探索转基因体细胞核经连续核移植后的发育潜力,以转人组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞为核供体, MII期的卵母细胞质为核受体,利用胞质内注射法构建原代核移胚胎(G0),并进行了原代核移植胚胎的继代核移植研究。比较原代和继代核移植胚胎在体外发育能力上的差异;在G1 、G2代核移植试验过程中,比较了供体胚胎细胞的发育阶段对核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,原代核移植胚胎的卵裂率(76.45%±1.17%)与继代核移植胚胎的卵裂率(72.18%±1.97%,76.05%±2.38%,75.99%±2.84%)无显著性差异(P>0.05)。但原代核移植胚胎的桑葚胚率(47.20%±2.93%)、囊胚率(11.00%±1.42%)显著高于G₁、G₂、G₃代核核移植胚胎的桑葚胚率(34.99%±2.66%,28.23%±2.00%,23.34%±1.99%)、囊胚率(3.87%±0.67%,2.08%±1.66%,0);在G₁、G₂中,当用16-细胞期核移植胚胎作为核供体时的桑葚胚率(29.57%±1.53%, 24.43%±1.87%)、囊胚率(1.96%±1.31%, 2.01%±1.34%)低于用32～64-细胞时期的核移植胚胎的桑葚胚率(34.32%±1.31%, 29.76%±1.66%)、囊胚率(3.86%±1.03%, 3.48%±0.34%),但无显著性差异 (P>0.05)。由此得出结论：转基因体细胞核移植胚胎不宜进行多代克隆;胞质内注射法构建核移植胚胎,用32～64-细胞期的胚胎作为核供体构建的核移植胚胎的体外发育率高于用16-细胞期的胚胎作为核供体构建的核移植胚胎的体外发育率。     

Nuclear transfer of goat somatic cells transgenic for human lactoferrin gene

Transgenic animal mammary gland bioreactors are used to produce recombinant proteins with appropriate post-translational modifications. The nuclear transfer of transgenic somatic cells is a powerful method to produce mammary gland bioreactors. We established an efficient gene transfer and nuclear transfer approach in goat somatic cells. Gene targeting vector pGBC2LF was constructed by cloning human lactoferrin (LF) gene cDNA into exon 2 of the milk goat beta-casein gene and the endogenous start codon was replaced by that of human LF gene. Goat fetal fibroblasts were transfected with linearized pGBC2LF and 14 cell lines were positive according to PCR and Southern blot. The transgenic cells were used as donor cells of nuclear transfer and some of reconstructed embryos could develop into blastocyst in vitro. __________ Translated from Hereditas (Beijing), 2006, 28(12): 1513–1519 [译自: 遗传]     

Nuclear transfer of goat somatic cells transgenic for human lactoferrin gene

Transgenic animal mammary gland bioreactors are used to produce recombinant proteins with appropri-ate post-translational modifications.The nuclear transfer of transgenic somatic cells is a powerful method to pro-duce mammary gland bioreactors.We established an effi-cient gene transfer and nuclear transfer approach in goat somatic cells.Gene targeting vector pGBC2LF was con-structed by cloning human lactoferrin (LF) gene cDNA into exon 2 of the milk goat beta-casein gene and the endogenous start codon was replaced by that of human LF gene.Goat fetal fibroblasts were transfected with lin-earized pGBC2LF and 14 cell lines were positive accord-ing to PCR and Southern blot.The transgenic cells were used as donor cells of nuclear transfer and some of recon-structed embryos could develop into blastocyst in vitro.     

利用多重筛选机制提高山羊乳腺上皮细胞基因打靶的效率

构建了山羊β-酪蛋白基因座基因打靶载体pGBC—GFP—neo,载体包含了正负筛选标记基因neo和tk,以及无启动子的GFP基因。打靶载体线性化后用脂质体包裹转染山羊乳腺上皮细胞,利用G418和GANC进行抗性细胞克隆的药物筛选,共得到抗性细胞克隆51个,对抗性克隆利用激素诱导β-酪蛋白基因启动子指导GFP表达,得到GFP表达阳性细胞克隆17个,对其中4个生长状态良好的克隆PCR检测验证后用于核移植,克隆胚发育率为59．5％,部分发育到桑椹胚或囊胚。     

利用体细胞核移植技术制作人胰岛素原转基因牛 （英文）

通过体细胞核移植技术制作了人胰岛素原转基因牛。在CMV启动子指导下以内部核糖体进入位点序列(IRES)连接的新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因组成了双重标记基因的筛选系统,用于转基因细胞的富集以及细胞和植入前胚胎的筛选。转基因通过电穿孔的方法(900V/cm,5ms)转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,基因转染细胞在添加G418 (800μg/mL)的培养基中培养10天以富集转基因细胞。选择表达绿色荧光蛋白的转基因细胞作为核供体进行体细胞核移植,重构胚经体外培养至囊胚阶段,选择表达绿色荧光蛋白的囊胚进行胚胎移植。为比较基因转染以及供体细胞所处周期对转基因细胞核移植胚胎发育的影响,用作核移植供体的转基因细胞或非转基因细胞先饥饿培养2—4天(0.5 ?S) ,然后恢复培养(10?S) 10 h使细胞同步化于G1期,以正常培养的细胞作为对照进行核移植。结果表明,转基因细胞作为核供体得到的核移植胚胎的体外囊胚发育率低于以非转基因细胞为核供体的对照组(23.2% VS 35.2 %,P<0.05) ;转基因细胞周期同步化处理与否对其克隆胚囊胚发育率无显著影响(23.2% VS 18.9 %,P>0.05)。胚胎移植后2个月直肠检查发现7头受体牛(每头移植2—4枚胚胎)中有一头妊娠,并最终发育足月产下一头小牛。聚合酶链反应(PCR)检测和DNA测序分析表明其为转人胰岛素原基因的转基因克隆牛。     

以经过转染的乳腺上皮细胞生产克隆羊

为研究转基因乳腺上皮细胞发育的全能性,利用电转染方法将人乳铁蛋白(hLF)乳腺特异性表达载体电转染山羊乳腺上皮细胞,经G418和PCR筛选获得阳性克隆细胞株,经催乳素诱导的细胞株上清液用Western blotting方法检测hLF的表达。以转基因与上清液中表达hLF均为阳性的细胞为核供体细胞,进行山羊体细胞核移植。结果为:16株细胞表达重组hLF,分子质量为75 kD;将144枚重构胚移入16只同步发情的山羊输卵管中,在移植后的30 d、60 d和90 d的妊娠率分别为87.5%、81.3%和62.5%;最终3只受体妊娠足月,产下3只克隆羊,克隆效率为2.1%,PCR-RFLP分析表明克隆羊均来自供体羊细胞,但没有整合外源基因。结果表明,hLF转基因乳腺上皮细胞能分泌hLF;乳腺上皮细胞经转染、筛选和长期培养的条件下,能保持发育的全能性。     

猪克隆胚胎激活方法优化与转人溶菌酶基因克隆猪的生产

为了提高转基因克隆效率和获得转人溶菌酶基因克隆猪,研究了不同电激活参数和化学辅助激活方法对猪克隆胚胎和孤雌胚胎体外发育的影响.结果发现:电场强度会显著影响克隆胚胎的融合率和体外发育能力(P<0.05),电脉冲次数对克隆胚胎体外发育促进作用不显著(P>0.05),而相同电激活条件下克隆胚胎和孤雌胚胎的体外发育能力变化趋势不同;电激活后再利用放线菌酮+细胞松弛素B(CHX+CB)处理4 h能显著提高克隆胚胎的囊胚率(P<0.05),而用二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)处理没有提高克隆胚胎囊胚率(P>0.05),但6-DMAP或CHX+CB处理均可显著提高孤雌胚胎的囊胚率(P<0.05).上述结果表明,最佳的孤雌激活条件并不一定是克隆胚胎的最佳激活条件.本研究中猪克隆胚胎的最佳激活方法为1.6 kV/cm、100μs、2次直流电脉冲间隔100μs,再辅以CHX+CB处理4 h.利用优化的激活条件成功获得了乳腺特异表达人溶菌酶的转基因猪,为猪转基因育种奠定了基础.     

转基因技术在制备动物乳腺生物反应器中的应用和发展

利用乳腺生物反应器可以高效获得安全、足量的药用蛋白,在制药工业中具有广阔的应用前景。但是,目前采用的转基因技术由于其各自固有的局限性,未能使乳腺生物反应器的研究取得长足的进步。基因打靶技术和核移植技术的发展为乳腺生物反应器的开发注入了新的活力。本文综合近年来国内外文献,阐述了各种转基因技术的优点与缺陷,同时说明了构建“体细胞打靶-克隆技术体系”在制备大动物的乳腺生物反应器中的必要性。