人轮病毒的细胞培养分离及其血清型的鉴定

<正>本轮报导从73份轮状病毒阳性粪便中,用MA-104细胞或非洲绿猴(AGMK)原代细胞培养方法分离到39株人轮状球毒。用噬斑抑制试验和中和试验法鉴定结果可分为4个血清型,其中3个型别以前已报导过。 病毒分离方法,取10％粪便悬液,先经10μg/ml胰酶处理37℃1小时,接种细胞后吸附37℃1小时,洗一次,加入含0.5μg/ml胰酶的MEM,其中含DEAE-dext-     

由G_o期过渡到S期时温度敏感突变株tsAF-8的Pre-rRNA基因的活化

用0.5％低血清培液使tsAF-8细胞进入G_o态后,再培养于含正常量(10％)血清的培液中,分别在允许温度(33.5℃)、非允许温度(39.5℃)、放线菌素D(0.03μg/ml)(33.5℃)或丁酸钠(5mmol/L)(33.5℃)的条件下,用~3HTdR放射自显影检测G_o期tsAF-8细胞进入S期的过程,并用银染核仁组织区(NOR)的方法观察pre-rRNA基因(rDNA)的活化程度。在允许温度时G_o期细胞进入S期,pre-rRNA基因被活化。在非允许温度或低浓度放线菌素D(33.5℃)条件下,G_o期细胞不进入S期,pre-rRNA基因也不活化。5mmol/L丁酸钠(33.5℃)条件下细胞不能进入S期,而pre-rRNA基因被活化,但活化程度较低。     

家蚕血液对BmE-SWU1细胞凋亡的抑制作用

以家蚕胚胎细胞系BmE-SWU1细胞为体外模型,用不同浓度的放线菌素D处理家蚕BmE-SWU1细胞进行家蚕细胞凋亡研究.结果表明:放线菌素D诱导家蚕细胞凋亡的作用呈时间、剂量依赖性.分别用浓度为0、50、100和200 ng/ml的放线菌素D处理BmE-SWU1细胞12 h后,凋亡峰所占比例分别为1.82%、1.26%、8.21%和12.31%.当放线菌素D的浓度为100 ng/ml时,诱导家蚕BmE-SWU1细胞凋亡的效果显著;家蚕血液对放线菌素D诱导的家蚕BmE-SWU1细胞凋亡具有明显的抑制作用.     

巨噬细胞RNA合成的某些特点

在低浓度(≤1μg/ml)放线菌素D作用下,兔腹腔巨噬细胞RNA合成被抑制的情况与兔肾细胞类似。但随着放线菌素D浓度增高,反而促进巨噬细胞的RNA合成。在浓度为100μg/ml时,可使~3H-尿苷的掺入量比对照增加2—10倍。相反,在此浓度下,兔肾细胞的RNA合成却完全被抑制。蔗糖的存在能使巨噬细胞丧失对放线菌素D这种刺激作用反应的能力,其RNA合成完全被抑制。另一方面,巨噬细胞的KNA聚合酶对利福平的敏感性要比其他非免疫细胞至少高4—5倍。如果用高浓度的(500μg/ml)利福平完全抑制巨噬细胞的转录之后,再     

用微载体悬浮培养大量生产高活性鼠干扰素

用自制的MC-1型微载体进行悬浮培养,当其浓度为5mg/ml时,可较好地用以培养和增殖鼠L929细胞。当接种细胞量为30×10~4/ml左右时,一般在3天即可增殖至1×10~6细胞/ml。用25IU/ml鼠IFN起动12—24小时,用NDV作诱生剂,并采用环己亚胺(20μg/ml)和放线菌素D(2μg/ml)进行超诱导,IFN产量可高达1×10~6IU/ml左右,比活接近1.3×10~5IU/ml蛋白。尽量去除培养基,加胰酶—柠檬酸盐消化和高速搅拌,使细胞从载体上分离,再加新鲜培养基和微载体的方法进行扩大生产看来是可行的。这些实验表明采用微载体悬浮培养细胞的技术将更适于IFN的工业化生产。     

单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体ORF1的表达及其抗凋亡作用

旨在研究单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体 (LAT) 开放读码框1 (ORF1) 对放线菌素D诱导的凋亡作用的影响。以HSV-2 333基因组为模板PCR扩增ORF1片段,构建重组质粒pEGFP-ORF1,转染Vero细胞,RT-PCR鉴定ORF1的表达。放线菌素D诱导Vero细胞凋亡,通过荧光显微镜观察凋亡小体,Hochest33258荧光染色观察细胞形态变化,MTT检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率。双酶切和测序确认pEGFP-ORF1构建成功,RT-PCR表明该真核表达载体能在Vero细胞中高效表达。转染了pEGFP-ORF1的Vero细胞经放线菌素D凋亡诱导后,Hochest33258染色显示细胞形态正常。MTT结果表明转染了重组质粒pEGFP-ORF1的Vero细胞经放线菌素D凋亡诱导后Vero细胞活性与未经任何处理的正常对照组相比,无显著差异 (P＞0.05),但高于放线菌素D诱导凋亡的Vero细胞组及与转染空质粒pEGFP-C2且放线菌素D诱导凋亡的Vero细胞组,差异具有统计学意义 (P＜0.05)。流式结果表明,转染重组质粒pEGFP-ORF1且经放线菌素D诱导凋亡组与正常对照组凋亡率差异不显著 (P＞0.05),而显著低于放线菌素D诱导凋亡组和转染空质粒pEGFP-C2且经放线菌素D诱导凋亡组 (P＜0.05)。HSV-2 LAT ORF1具有抗放线菌素D诱导的Vero细胞的凋亡作用。     

猪红细胞与人淋巴细胞形成玫瑰花环的影响因素

Lay等人曾发现人T淋巴细胞与猪红细胞形成花环,证实在人T淋巴细胞表面存在猪红细胞受体。为探讨该种受体的特性,我们观察了若干因素对人T淋巴细胞与猪红细胞花环形成的影响,现报告如下: 材料与方法猪红细胞悬液制备取抗凝猪血,用Hanks液洗涤3次,并以Hanks液配成0.5％猪红细胞悬液(约为8×10~7个细胞/毫     

鱼类染色体显带的研究 Ⅰ.鱼类染色体复制带显带的BrdU-Hoechst-Giemsa方法

本文报道显示鱼类染色体复制带的BrdU-Hoechst-Giemsa方法。采用含20％小牛血清的RPMI-1640培养液进行肾细胞培养,收获前按终浓度加入10μg/ml BrdU和2μg/ml放线菌素D,分别处理16—18小时和1.5—2小时。制片经Hoechst-33258染色,紫外灯照射,2×SSC温育和Gicmsa染色,获得了鲢鱼、鳙鱼和大鳍刺鳑鮍的染色体复制带图象,带纹清晰,结果较稳定。发现BrdU和放线菌素D有抑制鱼类染色体浓缩的作用。     

蝗虫性细胞减数分裂制片方法的改良

最近,我室采用分离、滴片方法观察蝗虫性细胞减数分裂,取得良好效果。现介绍如下。 1.取材在麦熟和稻熟季节采集蝗虫。取其精巢固定于卡诺液中0.5—1小时。去固定液,用95％酒精洗3次,移于70％酒精中,置于低温下可长期保存。 2.制片方法 (1)用眼科镊把精巢取出,装入瓶中,加入碎玻璃反复振荡,使组织捣碎。 (2)用吸管吸取捣碎液放入离心管内,以1000转/分的速度离心3—5分钟。去上清液,     

用固定化黑曲霉完整细胞连续生产柠檬酸

本研究比较了两种固定化黑曲霉完整细胞的方法:黑曲霉KCU520在30℃培养5天,用无菌水制成分生孢子悬液(10~7—10~8孢子/ml)。①在400ml80％海藻酸钠溶液中加入孢子悬液600ml,然后逐滴加到1％CaCl_2溶液中,形成的颗粒在10℃固定1小时备用。②聚丙烯酰胺凝胶(PAG)固定化,在64ml孢子悬液(4℃)中加丙烯酰胺12克,双丙烯酰胺     

用自旋标记研究抗癌药物对中国地鼠肺正常细胞V_(79)和癌变细胞V_(79)-B_1膜流动性的影响

本文用脂肪酸自旋标记Ⅲ(10,3)在ESR波谱仪上研究了作用于不同环节的抗癌药物硫杂脯氨酸、阿糖胞苷、放线菌素D和5-氟-2′脱氧尿嘧啶对中国地鼠肺正常细胞V_(79)和癌变细胞V_(79)-B_1膜流动性的影响。从所得的ESR波谱计算了抗癌药物处理前后细胞膜脂肪酸链的序参数、平均涨落角度、旋转相关时间和微观粘度的变化。发现用抗癌药物处理以后,V_(79)和V_(79)-B_1细胞膜脂肪酸链的序参数增加,平均涨落角度变小,旋转相关时间和微观粘度增大,细胞膜流动性变小。这四种药物对细胞膜的疏水脂肪酸链作用类似,而硫杂脯氨酸对细胞膜表面作用最大,阿糖胞苷,放线菌素D和5-氟-2′脱氧尿嘧啶依次减小。做了序参数随药物处理时间的动力学曲线。发现除放线菌素D外,V_(79)-B_1细胞膜序参数对其他三种药物的反映比V_(79)细胞膜快。     

人轮状病毒ZTR-5株灭活疫苗的制备及小鼠血清免疫学评价

目的: 研究人轮状病毒ZTR-5株灭活疫苗的制备及在实验小鼠中的免疫原性评价。方法: 轮状病毒ZTR-5株在MA104细胞上经蚀斑筛选纯化后,获得单一克隆接种至Vero细胞上适应性培养,免疫荧光定量检测病毒的感染性滴度,对收获的病毒液进行离心、超滤、分子筛纯化,甲醛灭活,抗原定量检测Al(OH)₃吸附制备的实验性疫苗。使用不同剂量(8EU、32EU、128EU、256EU)经肌内注射免疫小鼠,共免疫三次,免疫间隔2周。采用间接ELISA法检测血清特异性抗体效价。 结果: 通过蚀斑纯化,筛选得到一株纯化的病毒株ZTR-5纯-1,在Vero细胞上适应性后感染性滴度达7.35logCCID₅₀/ml;大量培养收获的病毒原液滴度为7.57logCCID₅₀/ml,制备获得轮状病毒样品抗原含量为2 560EU/ml;经肌内注射,初次免疫后,所有剂量组动物均获得抗体阳转,阳转率为100%;第一次加强免疫后,各组血清特异性抗体水平均明显增高,免疫剂量为128EU和256EU的两组小鼠血清抗体效价均达1∶10 240;第二次加强免疫后,各剂量组(8EU、32EU、128EU、256EU)血清抗体效价依次达1∶5 120,1∶7 456,1∶14 481.54,1∶14 481.54。 结论:人轮状病毒ZTR-5株可在Vero细胞上稳定增殖,所制备的疫苗具良好免疫原性,用128EU/2次免疫即可获得良好的免疫效果。     

蓖麻蚕血球细胞的体外培养及其病毒感染试验

蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricini Donovan)由本所昆虫饲养室提供。选择健康的5龄幼虫,饥饿24小时,先用自来水洗净虫体,将幼虫放入75％乙醇中浸泡20—30分钟,体表消毒,取出幼虫以灭菌的双重蒸馏水和Hanks液各洗涤2次,置幼虫于已灭菌的滤纸平皿中,吸干体表水分。剪脚部采血,直接滴入预先盛有2毫升培养液的扁瓶中,每瓶采血1—2滴,加盖橡皮塞,轻微摇动瓶子,使培养瓶内的细胞均匀悬浮于     

单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体RL1的表达及其抗凋亡作用

单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体(LAT)-RL1对放线菌素D诱导的凋亡作用的研究。构建重组pEGFP-RL1质粒,转染Vero细胞,RT-PCR及荧光鉴定重组质粒的表达。放线菌素D诱导Vero细胞凋亡,通过Hochest33342荧光染色观察细胞形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,JC-1荧光观察膜电位变化,Caspase 3凋亡蛋白检测。RT-PCR和荧光观察表明该真核表达载体能在Vero细胞中高表达。Hochest33342染色转染了pEGFP-RL1的Vero细胞经放线菌素D凋亡诱导后,细胞形态正常。流式结果表明转染重组质粒pEGFP-RL1且经诱导凋亡组与正常对照组凋亡率无差异,而显著低于诱导凋亡组和转染空质粒pEGFP-C2诱导凋亡组。转染重组质粒pEGPF-RL1的细胞JC-1染色后,红色细胞的比例要远大于绿色细胞的比例,而转染空质粒pEGFP-C2被染成绿色细胞的数量较多。Caspase-3结果表明转染了空质粒pEGFP-C2的Vero细胞经诱导凋亡后,活性显著高于转染了pEGFP-RL1经放线菌素D诱导凋亡后的Vero细胞和正常Vero细胞。HSV-2 LAT RL1具有抗放线菌素D诱导的Vero细胞的凋亡作用。     

DNA重组技术：Ⅲ.重组质粒在大肠杆菌中的转化

氯化钙法是用质粒DNA转化细菌细胞,尤其是大肠杆菌细胞最常使用的方法。实验操作如下: (1) 将受体菌接种在平板培养基上划线,37℃过夜,进行活化。 (2) 挑选单菌落,接于5ml LB培养液,37℃震荡过夜。 (3) 从上述培养液中取0.5ml,转入50mlLB培养液,37期震荡培养2～4小时,到细菌密度大约为5×10~7/ml,OD_(575)约为0.8。     

细胞色素P450表氧化酶对肿瘤坏死因子诱导的内皮细胞凋亡的影响

目的研究细胞色素P450表氧化酶对肿瘤坏死因子诱导的内皮细胞(bovine aortic endothelial cells, BAECs)凋亡的影响.方法在原代培养的BAECs中,分别转染构建在腺相关病毒载体内的细胞色素P450表氧化酶基因2J2,2C11,F87V两周后,用肿瘤坏死因子(TNF-α)(10ng/ml)和放线菌素D(ActD)(5ng/ml)诱导内皮细胞凋亡,通过细胞形态学和流式细胞计数观察其凋亡变化,同时采用Western blot分析检测Bcl-2和P38和丝裂原激动蛋白激酶ERK的表达水平.结果与对照相比,转染细胞色素P450表氧化酶基因后BAECs 凋亡细胞数减少,Bcl-2表达增加, P38表达减低, ERK的磷酸化水平增加.结论细胞色素P450表氧化酶能明显的抑制肿瘤坏死因子诱导的BAECs凋亡,并可能通过上调Bcl-2、下调P38的表达水平和通过增加ERK的磷酸化水平发挥抗凋亡作用.     

以龙胆紫染硫酸酯多醣类的组织化学意义

甲、方法:1)固定于任何固定液皆可,但以酒精为最合适。石蜡切片,厚3微来。切片脱蜡,降酒精,至蒸馏水。2)以龙胆紫(gentian violet)水溶液1∶250,000或1∶1,280,000染色24小时(即0.25毫升0.1%龙胆紫贮存液加入100毫升蒸馏水内;或以0.1毫升0.1%龙胆紫液加入128毫升蒸馏水内)。3)滤纸吸干切片,然后在亚尼林二甲苯(anilinc-xylene)1∶1或1∶2液内脱色及脱水约5分钟(或稍长),直至紫色不再从切片上脱下为止。以二甲苯洗2—3次,用树胶封片。若染透明质酸(hyaluronic anid)可以甘油封片。     

草鱼和团头鲂染色体G带带型的研究

本文报道了经改进的胰酶一步法和放线菌素D(AMD-BSG)法所显示的鱼类染色体G带。采用草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和团头鲂(Megalobrama amblycephala)的血淋巴细胞和肾细胞进行短期培养。血淋巴细胞的空气干燥制片,用胰酶一步法处理,显示出细致清晰的染色体G带。培养的肾细胞在收集前1-1.5h,1.5—2h,2.5—3h,用最终浓度为2μg/ml的AMD(actiomycin D)处理,其气干制片在HCI和Ba(OH)_2中处理,经2×SSC温育,Giemsa染色,获得了良好的染色体G带。在前中期或早中期的一个细胞单倍体组的染色体显带能达200多条带纹,结果较稳定,反差明显,图象清晰。根据实验结果初步绘制了草鱼和团头鲂的G带模式图。     

焦性磷酸酶的组织化学显示法

甲) 硷性焦性磷酸酶(alkaline pyrophosphase)的显示法: 1) 新鲜组织片固定于冷的5%中性福尔马林液中(此液含有0.9%氯化钠)1小时。 2) 以0.9%氯化钠洗10—20分钟。 3) 冰冻切片(20—35微米),切片径入0.9%氯化钠中或酶作用基液中(Substrate solution)。 4) 切片入酶作用基液内,在37℃下作用3小时,基液之     

对rDNA转录活性的图象分析

用低浓度的放线菌素D(AMD)处理人的外周血淋巴细胞,可以导致细胞周期各阶段核仁形成区(NOR)的银可染性显著减少,表明了放线菌素D对rDNA的转录活性具有明显的抑制作用。本实验采用IBAS图象分析系统,对经不同浓度的放线菌素D处理过的外周血淋巴细胞进行形态学测量和计算机统计分析,其结果阐述了细胞中NOR的银可染性(即rDNA的转录活性指标)与AMD浓度梯度的相关性,并以此建立了相应的回归方程。本文结果表明,间期的银染核仁面积是检测rDNA转录活性较为敏感的指标。