斑马鱼干扰素γ的克隆表达研究

目的：通过人工诱导斑马鱼干扰素的产生,证实两种斑马鱼干扰素γ基因ifng1-1和ifng1-2的存在,并克隆这两种干扰素基因,构建高效表达载体并做原核表达。方法：通过conA药浴,诱导斑马鱼干扰素γ的表达,即刻提取组织总RNA,并通过RT-PCR方法扩增两种干扰素γ基因。将目的基因连入表达载体pET24a,构建重组载体pET24a-ifng1-1和pET24a-ifng1-2。将载体转化BL21,并用IPTG诱导融合蛋白的表达。产物经SDS-PAGE检测,分析蛋白表达情况。结果：成功克隆了两种斑马鱼干扰素γ基因,构建了pET24a-ifng1-1和pET24a-ifng1-2重组载体,并实现了原核融合表达。结论：两种干扰素γ基因都能够被conA所诱生,且具有相似特性,表明两种干扰素γ都不是假基因,都有可能在免疫系统中发挥作用,本实验为进一步研究两种干扰素γ的功能奠定了基础。     

一种新剂型基因工程干扰素稳定性的研究

目前国内市场上的干扰素多数为含有人血白蛋白的冻干制剂 ,为消除人血白蛋白带来的血源性感染 ,并方便临床用药 ,我们根据基因工程药物的特点 ,将冻干基因工程干扰素改造成干扰素注射液 ,选择合适的缓冲系统和非人血白蛋白稳定剂 ,在 4℃和 3 7℃下的稳定性进行了研究 ,确定了一种稳定的新型干扰素注射液。     

α2a型基因工程干扰素发酵工艺的研究

对干扰素工程菌PBV320／7118－α2a型发酵工艺,由批式培养改为反馈式流加培养^[1]可显著提高工程菌PBV320／7188－α2a在40L发酵罐中的菌体产量及干扰素的表达水平。     

基因工程菌的发酵研究

本文对大肠杆菌表达的ｒｈＧＭ－ＣＳＦ工程菌的发酵条件进行了详细的研究,探讨了发酵条件对工程菌表达外源蛋白量的影响,优化了影响发酵的各种条件,形成了一套工程菌发酵表达外源蛋白的工艺,并从工业化角度对工程菌的高密度高表达间的关系进行了探讨。     

基因工程菌的发酵研究

本文对大肠杆菌表达的rhGM - CSF 工程菌的发酵条件进行了详细的研究, 探讨了发酵条件对工程菌表达外源蛋白量的影响, 优化了影响发酵的各种条件, 形成了一套工程菌发酵表达外源蛋白的工艺, 并从工业化角度对工程菌的高密度高表达间的关系进行了探讨。     

干扰素基因工程菌产物表达数学模型的研究

根据阻遏蛋白,辅阻遏因子与启动基因之间的相互作用,建立了采用色氨酸启动子的基因工程重组徽生物的产物表达数学模型。提出了mRNA最大转录速率常数和产物表达速率常数与比生长速率呈线性关系的假设,用干扰素基因工程菌培养过程中的实验数据估计了mR—NA转录速率常数,干扰素表达速率常数和干扰素降解速率常数。推导出了发酵过程中干扰素表达量和细胞内干扰素比活计算公式。运用这些公式可以通过检测色氨酸浓度和细胞比生长速率来计算预测干扰紊表达量。确定最佳的终止培养时间。     

产1,3-丙二醇基因工程菌发酵条件的研究

利用途径工程的方法,将来源于克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的甘油脱水酶基因dhaB和1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT构建成多顺反子重组质粒pSE-dhaB-dhaT并在大肠杆菌JM 109中进行表达,在大肠杆菌中构建一条新的产1,3-丙二醇代谢途径。研究表明,重组菌株JM 109/pSE-dhaB-dhaT在微好氧条件下,尝试用廉价的乳糖为诱导物、维生素B12为辅酶,可以将甘油转化为1,3-丙二醇,产量达15.34 g/L,甘油转化率为35.7%,对低成本生产1,3-丙二醇作了有益的探索。     

鲤鱼生长激素基因工程菌的发酵研究

对表达鲤鱼生长激素的大肠杆菌工程菌的发酵条件进行了详细的研究,探讨了发酵条件对工程菌外源蛋白表达量的影响,优化了影响工程菌发酵的各种条件,形成了一套工程菌小量发酵表达外源蛋白的工艺,为工程菌的大量生产奠定了基础     

重组人干扰素βser17工程菌发酵培养条件的优化研究

实验对重组人干扰素βser17(rhIFNβser17)工程菌的发酵培养条件进行了研究,通过实验优化确定了适宜rhIFNβser17表达的培养基、诱导剂使用浓度、诱导时期和诱导后的收获时间等,建立了发酵培养工艺,并在50L发酵罐进行了中试发酵,菌体收获量湿重达13.08g/L,rhIFNβser17表达量占菌体总蛋白的20.2%,纯化后比活性达2×107IU/mg蛋白以上,为进一步的下游开发奠定了基础。     

重组大肠杆菌产角质酶-CBM摇瓶发酵优化及分泌表达研究

在TB培养基的基础上,通过单因素分析和正交设计对重组大肠杆菌产角质酶-CBM发酵进行优化,得到最适培养基的组分为:甘油5 g/L,蛋白胨 16 g/L,MgSO₄·7H₂O 2.5 mmol/L,K₂HPO₄ 13.7 g/L,KH₂PO₄ 1.53 g/L,菌体生长至对数前中期时添加终浓度为1 g/L乳糖 和0.75 g/L 甘氨酸,30℃发酵48 h,角质酶-CBM产量可达63 U/ml,较TB培养(20 U/ml)提高了近3倍。考察了热激作用、渗透调节物质及温度两控制对角质酶-CBM分泌表达的影响,在添加Lactose和Glycine后,发现在添加终浓度为75 mmol/L的L-脯氨酸,37℃热激1 h或47℃热激0.5 h,变温至25℃发酵,角质酶-CBM产量可达90 U/ml,较TB恒温培养提高了近四倍。     

表达重组别藻蓝蛋白质粒在工程菌株中的遗传稳定性研究

将含有表达重组别藻蓝蛋白基因的重组质粒pMal-2X的工程菌株P1分别在含有Amp的LB固体培养基上采用划线法连续传代至100代,其生长速度（在LB培养基中）、菌落形态和抗生素抗性等方面与原始种子库无明显差异;取第10,20,50,100代提取质粒DNA经EcoRI限制性内切酶酶切检查,酶切图谱没有改变。DNA测序未见apc基因变异。原代菌株与传代第10,20,50和100代菌株经诱导培养,其rAPC表达水平、菌体蛋白的SDS—PAGE图谱及重组蛋白的免疫原性均无明显差异。以上结果表明,重组质粒pMal-2X在工程菌株P1中具有良好的遗传稳定性。     

利用重组大肠杆菌生产双乙酰

大肠杆菌自身代谢特征具有发酵生产双乙酰的天然优势。利用PCR技术,以广泛用于双乙酰生产的Lactococcus lactis基因组DNA为模板,克隆得到α-乙酰乳酸合成酶基因α-als,将其构建在表达载体pET-30 a上。与能够高效表达3种大肠杆菌来源HSP 70家族分子伴侣的pKJE 7质粒共同转化E.coli BL21(DE3)。利用目的蛋白质分子伴侣共表达的方法,首次获得了能够高效表达具有酶活力的α-乙酰乳酸合成酶的重组大肠杆菌。在静置培养条件下,能够在该菌株的培养基中检测到双乙酰的生成。融合蛋白酶在温度为30-40℃和pH在6-7之间时具有较高的酶活,以丙酮酸为底物,该酶最适pH为6.8,最适温度为39℃。     

大肠杆菌表达的重组白细胞介素-2的初步纯化

本文对大肠杆菌表达产生的重组白细胞介素-2进行了纯化研究。通过比较两种方法制备的rIL-2包含体的纯度,发现用4mol/L脲溶解可溶性细菌蛋白后可使rIL-2包含体纯度达70％;在高浓度变性剂条件下进行凝胶过滤,解决了rIL-2易聚合的问题;结合透析,利用空气氧化形成高活性氧化型rIL-2;经SephadexG-100凝胶过滤,DEAE离子交换等步骤纯化,得到了均一性rIL-2,纯度达98％,比活达4.3×10~6u/mg蛋白,得率为30.8％。     

利用重组大肠杆菌生产人生长激素发酵工艺的研究

在摇瓶培养和发酵罐培养条件下,研究了E.coli/BL21(DE3)/pET30a(+)-hGH工程菌的不同发酵工艺条件。确立了该工程菌的最优化工艺参数:M9-2培养基,37℃、pH值为6.8-7.4、诱导起始菌体密度为OD600达3.0-4.0,IPTG浓度为1mmol/L,诱导时溶氧控制为50%以上,补料为10%甘油、5%Yeast extract和5%Tryptone。该工艺条件经过连续三批发酵,证实稳定可行,目的蛋白在胞间质呈可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的20%以上。     

重组大肠杆菌产Streptomyces sp. FA1来源木聚糖酶的摇瓶发酵优化

为了实现来源于Streptomyces sp. FA1的木聚糖酶的高效胞外分泌表达,对E.coli BL21(DE3)/pET20b(+)/coe/xynA基因工程菌的发酵产酶诱导条件进行优化,获得最优的诱导条件为25 ℃发酵6 h后添加终浓度为0.4 mmol/L的IPTG。在此基础上对发酵培养基进一步优化,得到最优培养基成分为:甘油11 g/L,酵母粉24 g/L,蛋白胨8 g/L,磷酸盐浓度89 mmol/L,镁离子4 mmol/L。最终酶活达到780.2 U/ml,为未优化前的2.2倍,是目前大肠杆菌摇瓶发酵产木聚糖酶的最高表达水平,为实现该酶的工业化生产奠定基础。     

重组大肠杆菌高密度发酵生产RGD-TRAIL的条件优化

本文以一株产RGD-TRAIL的重组大肠杆菌为研究对象,在10L发酵罐中考查了诱导温度、pH值、溶氧、流加葡萄糖对重组大肠杆菌生长和RGD-TRAIL蛋白表达的影响。结果表明:诱导温度25℃,pH值控制7.0,溶氧控制30%,以5g·L~(-1)·h~(-1)流速流加葡萄糖最有利于菌体生长和蛋白表达,菌体收率和RGD-TRAIL产量分别达到45.99g·L~(-1)和160.2mg·L~(-1)。     

MM工程菌的大规模发酵培养工艺研究

首先在50L发酵罐上研究了MM工程菌的发酵培养工艺。确定了接种量4％,搅拌转速300～500r／min,pH7,2和糖补加速率0．066 g．(L·mjn)^-1等参数,活菌数可达每毫升211亿。以氧传递系数为放大准则可成功地将该工艺在200L倒产发酵罐上再现,说明该工艺具有可放大性。     

Cecropin-X发酵过程中工程菌质粒稳定性的研究

通过连续斜面转接实验 (5 0次 )检测重组Cecropin X工程菌质粒的结构稳定性 ,采用 30L自动控制发酵罐观察不同培养基 ,有无选择压力和溶氧高低等培养条件对质粒分裂稳定性的影响。结果表明 ,该工程菌质粒具有结构稳定性和分裂不稳定性。当外源蛋白表达时 ,便会出现分裂不稳定性 ,表达量越高 ,质粒丢失情况越严重。经1 2h的培养 ,当采用TB和 2×LB作为发酵培养基时 ,带质粒的菌为 6 8 5 %和 98 0 % ,包涵体得率有很大差异 ,干重分别为 1 2 4和 0 4 0g L。发酵培养基中 (TB)氨苄青霉素浓度为 0和 1 0 0 μg mL时 ,带质粒的菌为 6 8 5 %和 92 0 % ,包涵体得率基本一致 ,干重分别为 1 2 4和 1 2 0g L。通过改变搅拌速度来调节溶氧量 ,当转速为 1 5 0和 2 5 0r min时 ,带质粒的菌为 6 8 5 %和 1 0 0 % ,包涵体得率有较大差异 ,干重分别为 1 2 4和 0 71g L。     

重组野猪α-干扰素基因的高效表达和下游工艺的研发

利用PCR方法,从东北野猪和长白猪的肌肉基因组DNA中分别扩增出一条501bp的基因片断 ,与GenBank上登载的猪α-干扰素基因序列相比,核苷酸同源性达到98.4%以上。以其中野猪α-干扰素基因片断为参考模板,经过密码子优化、5?和3?区域的mRNA二级结构优化,全基因合成得到编码野猪α-干扰素基因成熟肽的基因。克隆该基因到原核表达载体pWL之中.随后转化至宿主菌DH-5α。经过SDS-PAGE电泳检测,发酵后的重组野猪IFN-α-干扰素基因的蛋白表达量大于25%。复性纯化后的重组蛋白,经过VSV-WISH系统检测,其生物活性为4.45×106IU/mg。