mTORC2调节细胞骨架的信号通路

近几年来,关于哺乳动物雷帕霉素靶（mammalian target of rapamycin,mTOR）在各种哺乳动物细胞中调节肌动蛋白微丝极化及肌球蛋白微丝网形成的研究一直在不断地取得新的进展。尽管到目前为止,包括mTORC2上游和下游在内的相关的调控路径还未明确,但是因为mTORC6,的物学多样性,使其成为了当今生物学研究的焦点之一。基于长久以来特别是近五年对mTORC2的研究,在涉及细胞运动迁移、增殖分化、蛋白质合成、凋亡及自噬等生物学功能的研究中,一些重要的下游相关调控分子和蛋白相继被发现,比如P—Rexl／2、Rho家族GTPases、PKC、cAMP、p27kip1等。该综述着重总结了mTORC2实现这些生物学功能所可能通过的四条路径。当然,仍然需要大量的实验数据和研究证据进一步地证实和完善这些已经发现的可能存在的路径。     

细胞骨架在跨膜信号传递中的作用

细胞骨架在跨膜信号传递中的作用王英杰（杭州大学生物科学与技术系,３１０００７）董萍（浙江省化工研究院）自１９６３年Ｓｌａｕｔｅｒｂａｃｋ首先在水螅刺细胞中发现微管以来,细胞骨架的研究已成为细胞生物学和生物化学研究中最活跃的领域之一。现在,人们普遍认识...     

哺乳动物卵母细胞成熟和受精中细胞骨架重组和作用

卵母细胞成熟和受精是动物生殖过程的核心环节。细胞骨架是遍布于卵母细胞胞质中的一种复杂的蛋白质纤维网络,研究表明,卵母细胞成熟和受精过程中伴随着广泛的胞质骨架重组。哺乳动物卵母细胞和早期胚胎中细胞骨架具有其独特的分布和功能,使卵母细胞和胚胎呈现出不同的变化特点。微丝、微管的分布变化与卵母细胞成熟和受精中遗传物质的重组密切相关。近年来,对哺乳动物不同物种间卵母细胞和胚胎中细胞骨架成分的研究取得了很大的进展,结合这些研究成果,对哺乳动物卵母细胞成熟和受精过程中细胞骨架的重组、分布和作用进行了介绍。同时,对多种信号转导途径参与卵母细胞成熟和受精中细胞骨架系统的调控也作了探讨。     

MAPK信号途径及其在水生无脊椎动物的研究进展

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatived protein kinase,MAPK)信号转导途径普遍存在于真核生物,广泛参与细胞生长、分化、生殖、凋亡、应激等多种生理过程。它通过保守的三级激酶级联反应将细胞外信号传递到细胞内,磷酸化底物蛋白或转录因子发挥作用。目前,MAPK途径在哺乳动物的作用机制,尤其是该途径与人类疾病的关系已有大量的研究,但对水生无脊椎动物的研究相对较少。该文综述了目前MAPK在水生无脊椎动物的研究进展,并对今后的研究方向提出建议。     

血管紧张素Ⅱ上调自发性高血压大鼠和Wistar-Kyoto大鼠血管平滑肌细胞外信号调节激酶的信号转导

本文研究血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)对自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)和Wistar- Kyoto(WKY)大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells．VSMCs)细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated pro- tein kinases,ERKs)信号途径的影响。体外培养SHR和WKY大鼠的VSMCs,先在培养基中加入终浓度为1×105mmol／L 的缬沙坦或1×105mmol／L的PD98059或不加药物,再给予1×107mmol／L的Ang Ⅱ刺激24 h后收集细胞,以无血清培养基 培养的VSMCs作对照。用免疫沉淀法测定ERK活性;用Western-blot方法检测总ERK(total ERK,t-ERK)、磷酸化ERK (phosphorylated-ERK,p-ERK)及丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protem kinases phosphatase-1,MKP-1)水 平;用RT-PCR法半定量测定MKP-1 mRNA的含量。结果显示:(1)SHR和WKY大鼠Ang Ⅱ刺激组VSMCs中ERK活 性、p-ERK、MKP-1及MKP-1 mRNA水平均明显高于对照组(P<0．05);SHR和WKY大鼠Ang Ⅱ+缬沙坦组和Ang Ⅱ +PD98059组的上述指标与对照组比较均无显著性差异。(2)SHR大鼠VSMCs中ERK活性、P-ERK、MKP-1及MKP-1 mRNA均显著高于相同干预的WKY大鼠(P<0．01)。(3)SHR和WKY大鼠之间以及对照组、Ang Ⅱ刺激组、Ang Ⅱ+缬沙 坦组和Ang Ⅱ+PD98059组间VSMCs中t-ERK水平均无显著性差异。以上结果表明,Ang Ⅱ可能主要通过其1型(Ang Ⅱ type 1,AT)受体激活SHR和WKY大鼠VSMCs中ERK途径,增加ERK活性和p-ERK蛋白水平,继而引起MKP-1及 MKP-1 mRNA水平升高。     

死亡受体的信号传导途径及其调节机制

细胞凋亡是多细胞生物保证个体正常发育成熟和维持正常生理过程所必需的。凋亡细胞表面有特定的感应器即死亡受体,死亡受体可以接受胞外的死亡信号而激活细胞内的凋亡机制。本文简要综述了死亡受体的信号传导途径及其调节机制的研究进展。死亡受体CD95、TNFR1和DR3的信号传导途径相似,均有死亡结构域结合蛋白FADD和死亡效应蛋白caspase-8的参与,而DR4和DR5的信号传导途径研究得不是十分清楚,可能存在FASS依赖性和不依赖性两条不同的信号传导途径。     

白介素-1 β通过JNK/p38信号-转导通路调控肾系膜细胞表达α-平滑肌肌动蛋白

为探讨细胞内丝裂素原活化蛋白激酶（MAPK）家族各亚类信号转导通路在炎症性细胞因子白介素－1β（IL－1β）对大鼠肾系膜细胞（rMC)表型标志物α-平滑肌肌动蛋白（α－SMA）表达及其分布中的调控作用,以IL－1β（10ng/ml)刺激体外培养的rMC,用电穿孔基因转染及免疫杂交法观察IL－1β对α－SMA基因启动子活性及蛋白表达的作用,并用共聚焦荧光显微镜及透射电镜观察IL－1β刺激前后细胞内α-SMA及微丝的分布变化。通过应用PD98059和SB203580特异阻断ERK和p38通路、共转染显性失活JNKK基因特异阻断JNK通路,观察阻断对IL－1β刺激所致α-SMA表达或启动子活性的影响。结果显示,IL－1β刺激6h可明显上调α－SMA启动子活性,在1－2d内显著促进其蛋白合成;IL－1β刺激24h后,细胞内α-SMA及微丝在细胞核周的分布增加。阻断ERK通路对IL－1β诱导的α-SMA表达无明显影响;阻断JNK及p38通路均可使IL－1β诱导的α－SMA表达明显受抑;阻断p38通路的作用比阻断JNK通路更强,而且对基础状态的α-SMA表达也有抑制作用。上述结果提示,IL－1β可刺激rMC发生表型转化,其表型标志物α－SMA可通过基因转录增强而增加蛋白表达,在细胞内的分布向核周转位积聚。JNK及p38通路是介导IL－1β刺激rMC α-SMA表达的主要信号转导途径,而ERK通路不影响IL－1β的这一作用。     

花生四烯酸诱导肌球蛋白磷酸化被抑制的平滑肌细胞 迁移的信号传导途径

在应用肌球蛋白轻链激酶特异抑制剂ML-7抑制了肌球蛋白轻链磷酸化后,花生四烯酸(arachidonic acid,AA)仍可诱导兔血管平滑肌细胞（SM3）发生迁移.为了进一步阐明其信号传导途径,应用多种信号抑制剂,采用免疫印迹、Boyden小室和提取细胞膜蛋白等实验方法,对上述迁移作用的信号传导途径进行了深入的研究.结果显示,PTX（Gi蛋白抑制剂）、U73122（PLC抑制剂）、staurosporine (PKC抑制剂)、PD98059（ERK1/2抑制剂）和SB203580（p38抑制剂）分别可拮抗上述AA诱导的SM3细胞迁移作用,而SP600125（JNK抑制剂）的作用较弱.免疫印迹结果显示,AA可提高SM3细胞中PKC(ε)、ERK1/2、p38和JNK信号的磷酸化水平,呈时间依赖性, PTX或U73122可抑制上述作用;staurosporine可抑制由AA 引起的ERK1/2和JNK的磷酸化水平增强,但对p38的磷酸化水平无影响.还发现AA可促进PLCβ2的细胞膜移位, PTX可抑制其作用.上述结果表明,当肌球蛋白轻链的磷酸化被抑制后, AA可通过Gi蛋白的活化促进PLCβ2向细胞膜移位,进而通过激活PKC(ε)、ERK1/2、p38和JNK等信号转导途径而诱导SM3细胞发生迁移     

MEF2A基因突变对血管平滑肌细胞增殖迁移及其表型的影响

目的:观察肌细胞增强因子2A(MEF2A)基因突变对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖迁移及其表型的影响。方法:分别将野生型(WT)MEF2A质粒(WT组)、21个核苷酸缺失突变型(△21,显性负突变)MEF2A质粒(△21组)以及MEF2A siRNA(siRNA组)转染进人主动脉血管平滑肌细胞(VSMC),通过溴化噻唑基蓝四唑(MTT)法和Millicell小室观察各组VSMC的增殖和迁移变化,免疫印迹(Western blotting)检测各组VSMC之间MEF2A蛋白、平滑肌α肌动蛋白(α-SM-actin)、SM22α、骨桥蛋白和丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路表达差异。结果:MEF2A△21组和MEF2A siRNA组的VSMC增殖增加,迁移数量增多;同时此两组中α-SM-actin和SM22α表达减少,骨桥蛋白表达增加;磷酸化p38和ERK1/2表达也明显增强。结论:MEF2A基因显性负突变及沉默可使VSMC向合成型转化,其增殖和迁移能力增加。而p38和ERK1/2MAPK信号通路可能参与MEF2A基因介导的血管平滑肌细胞表型转化。     

活性氧:从毒性分子到信号分子--活性氧与细胞的增殖、分化和凋亡及其信号转导途径

活性氧(reactive oxygen species,ROS)是生物体有氧代谢产生的一类活性含氧化合物的总称,主要包括O2·-、H2O2、·OH等,机体细胞通过多种途径维持ROS产生与消解的动态平衡。近年的研究揭示ROS参与细胞正常的生理过程,与细胞的增殖、分化及凋亡密切相关。不同刺激诱导细胞产生的内源性ROS可作为第二信使,通过改变氧化还原状态调节增殖、分化和凋亡相关的信号转导通路中多种靶分子的活性,最终决定细胞的命运。     

一种改良的肌细胞骨架染色方法

为了观察肌细胞骨架,对传统考马斯亮蓝染色法进行改良,并与免疫荧光染色法进行了比较。培养的血管平滑肌细胞先用多聚甲醛预固定后再进行考马斯亮蓝染色,可使细胞骨架非常清晰的显色,解决了传统考马斯亮蓝染色易使肌细胞变形、脱片的问题,其效果与免疫荧光染色相近。因此,多聚甲醛预固定．考马斯亮蓝染色法是一种适于肌细胞骨架染色的简便方法。     

血管舒-缩肽在血管平滑肌细胞中的表达与调控

为探讨血管舒 缩肽表达的调控机制及血管平滑肌细胞 (VSMC)在该网络平衡中的地位 ,以血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )为诱发因素刺激培养的大鼠VSMC ,用RT PCR和放射免疫分析观察内皮素 1(ET 1)、AngⅡ、心钠素 (ANF)和肾上腺髓质素 (ADM)在VSMC中的表达与释放及相互关系 ,用电泳迁移率改变分析 (EMSA)和染色质免疫沉淀 (ChIP)分析揭示其分子机制 .在被AngⅡ处理的VSMC中 ,4种血管活性肽的表达活性均升高 ,其中缩血管肽基因表达被迅速诱导 ,而舒血管肽则是先降后升 .但刺激前后舒 缩血管肽之间的平衡关系无明显改变 .放免分析证实 ,AngⅡ可程度不同地促进 4种血管活性肽合成 ,使胞内 4种活性肽水平升高 ;对培养液中 4种活性肽进行检测的结果显示 ,AngⅡ可促进ET 1、AngⅡ释放 ,抑制舒血管肽释放 ,尤以ANF的胞内水平明显高于胞外 .EMSA分析显示 ,在AngⅡ诱导 4种肽表达的同时 ,与细胞增殖有关的转录调控因子转录激活蛋白(AP 1)与 4种活性肽基因启动子的结合活性明显增强 .ChIP结果表明 ,AP 1在染色质靶位点的募集与血管活性肽基因的表达上调有直接关系 .结果提示 ,AP 1与特异DNA顺式作用元件的相互作用参与了血管活性肽的转录激活 .VSMC不仅作为它们的效应器 ,而且还通过调节AP 1与靶基因中的共有顺式元件——     

Differential Regulation of NOTCH2 and NOTCH3 Contribute to Their Unique Functions in Vascular Smooth Muscle Cells

Notch signaling is a key regulator of vascular smooth muscle cell (VSMC) phenotypes, including differentiation, proliferation, and cell survival. However, the exact contribution of the individual Notch receptors has not been thoroughly delineated. In this study, we identify unique roles for NOTCH2 and NOTCH3 in regulating proliferation and cell survival in cultured VSMCs. Our results indicate that NOTCH2 inhibits PDGF-B-dependent proliferation and its expression is decreased by PDGF-B. In contrast, NOTCH3 promotes proliferation and receptor expression is increased by PDGF-B. Additionally, data show that NOTCH3, but not NOTCH2 protects VSMCs from apoptosis and apoptosis mediators degrade NOTCH3 protein. We identified three pro-survival genes specifically regulated by NOTCH3 in cultured VSMCs and in mouse aortas. This regulation is mediated through MAP kinase signaling, which we demonstrate can be activated by NOTCH3, but not NOTCH2. Overall, this study highlights discrete roles for NOTCH2 and NOTCH3 in VSMCs and connects these roles to specific upstream regulators that control their expression.     

Src介导骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞黏附和迁移过程

为阐明酪氨酸激酶Src在整合素被骨桥蛋白(OPN)激活所触发的细胞黏附和迁移信号途径中所起的作用,应用Src特异性抑制剂PP2阻断Src,观察OPN诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)黏附和迁移活性的改变,并利用免疫沉淀检查PP2对整合素下游信号分子黏着斑激酶(FAK)和整合素偶联激酶(ILK)磷酸化及其相互作用的影响。结果显示,PP2可明显抑制OPN诱导的VSMC黏附和伤口愈合(黏附和迁移活性分别为对照组的76.6%和33.8%);OPN可显著诱导FAK磷酸化(磷酸化水平达对照组的1.9倍),促进ILK去磷酸化,并使FAK与ILK的结合减少(降至对照组的46.4%)。10μmol/LPP2可明显抑制OPN诱导的FAK磷酸化、拮抗OPN诱导对ILK的去磷酸化作用、促进FAK与ILK之间的结合。研究结果表明,Src作为OPN-整合素-FAK信号途径中的信号分子,通过影响FAK和ILK的磷酸化以及两者之间的相互作用来调节VSMC的黏附和迁移活性。     

平滑肌细胞迁移的肌球蛋白轻链非磷酸化途径

为了阐明平滑肌细胞迁移存在肌球蛋白轻链非磷酸化调节途径,研究花生四烯酸(arachidonicacid,AA)对肌球蛋白轻链非磷酸化状态下平滑肌细胞迁移的影响及其相关的信号传导途径.经Boyden小室跨膜迁移实验发现,AA对培养的兔血管平滑肌SM3细胞具有明显的诱导迁移作用.然而,当预先用10μmolL肌球蛋白轻链激酶(myosinlightchainkinase,MLCK)特异性抑制剂ML7作用SM3细胞后,发现AA对SM3细胞仍然具有明显的诱导迁移作用,并呈剂量依赖性,这种诱导作用可被细胞外信号调节激酶12(ERK12)的特异性抑制剂PD98059或磷脂酶C(PLC)的特异性抑制剂U73122所拮抗.此外,Ⅱ型肌球蛋白抑制剂blebbistatin(BLB)可部分抑制“非磷酸化”状态下AA的诱导迁移作用.经Western印迹检测显示,10μmolLML7可完全抑制SM3细胞中20kD肌球蛋白轻链(MLC20)磷酸化,并且加入AA后MLC20仍为非磷酸化状态.应用免疫荧光染色法观察肌动蛋白在SM3细胞中分布的变化,发现在AA作用下肌动蛋白呈细胞边缘聚集现象,有伪足形成,细胞形态表现为迁移状态.预先用ML7作用后再加入AA,肌动蛋白的分布与上述结果相同.研究结果初步表明,在平滑肌细胞迁移的作用途径中,在MLC磷酸化调节途径受到抑制时,AA可诱导MLC非磷酸化的平滑肌细胞发生迁移,其分子机理可能与ERK12和PLC信号传导途径有关,非磷酸化的肌球蛋白直接参与了该迁移过程.     

同源异型盒基因对血管平滑肌细胞的调控作用

同源异型盒基因是一类对生物体的生长、发育和分化从时间和空间上进行协调的调控基因。构成血管中膜的血管平滑肌细胞表型具有极大的可塑性。在一些病理性血管重构时,血管平滑肌细胞可发生表型调变,从分化型调变为去分化型,具备增殖和迁移能力。在此过程中,多种同源异型盒基因的表达发挥了重要的调控作用。现就同源异型盒基因与血管平滑肌细胞的表型调变、增殖和迁移的关系等方面的研究进展作一综述。     

ERK信号通道调控大鼠气道平滑肌细胞的增殖与凋亡

 为了了解ERK信号通道对正常大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells, ASMCs)增殖与凋亡的调控. 通过对正常大鼠ASMCs原代培养,4～7代用于实验,以ERK激动剂表皮生长因子（EGF）和抑制剂PD98059干预ASMCs生长,采用RT-PCR和免疫荧光染色观察ASMCs上ERK mRNA和蛋白的表达,MTT法、^３Ｈ-TdR掺入法检测ASMC增殖,Hoechst染色和Annexin-Ⅴ FITC PI双染色法检测细胞凋亡,Western免疫印迹检测ERK1/2、磷酸化ERK1/2和procaspase-3蛋白的表达.结果发现ASMCs上存在ERK mRNA和蛋白的表达,与空白对照组比较,PD98059干预后ASMCs的Ａ_４９０值和细胞DNA合成量均减少(Ｐ<0.05),细胞凋亡指数、早期凋亡细胞百分率均增高(Ｐ<0.05),ERK1/2、磷酸化ERK1/2表达和ERK活化率均降低, procaspase-3蛋白的表达增高.EGF干预后ASMCs的Ａ_４９０值和细胞DNA合成量均增高(Ｐ<0.05),细胞凋亡指数、早期凋亡细胞百分率均下降(Ｐ<0.05),ERK1/2、磷酸化ERK1/2表达和ERK活化率均增高, procaspase-3蛋白的表达降低.P+E组无明显差异(P>0.05).ERK信号通道参与大鼠ASMCs增殖和凋亡的调控,ERK对大鼠ASMCs凋亡的调控与procaspase-3蛋白有关,这一发现将有助于对哮喘ASMCs异常增殖调控机制的深入研究.     

平滑肌内向整流钾通道(K_(IR))

平滑肌内向整流钾通道在维持和调节细胞膜电位中发挥重要作用,并可能成为新的治疗靶点.综述了其分子学基础、电生理特性、生理功能和调控机理等研究进展.     

血清饥饿可诱导人血管平滑肌细胞再分化

体外培养的分化型血管平滑肌细胞 (vascularsmoothmusclecells ,VSMC)以特异性标志基因表达、长梭形外观及对兴奋剂刺激产生收缩反应为其表型特征 .以血清饥饿法培养处于超汇合 (overconfluence)状态的人VSMC ,观察其分化型标志基因表达活性及其与细胞形态特征和收缩反应性之间的关系 ,探讨细胞生存环境对VSMC基因表达及表型的影响 .研究显示 ,生长至超汇合的VSMC由含血清培养转为血清饥饿后 ,收缩蛋白如SMα肌动蛋白 (SMα actin)、SM2 2α、h1 calponin、肌球蛋白重链 (MHC)SM1和SM2亚型的表达活性明显上调 ,证实血清饥饿诱导的收缩蛋白基因表达和血清应答因子 (serumresponsefactor ,SRF)与CArG顺式元件结合活性的增强有关 .同时 ,血清饥饿还可激活参与VSMC分化调节的转录调控因子SmLIM、Gax和分化相关蛋白HRG 1基因的转录 .随着血清饥饿培养时间的延长 ,VSMC逐渐形成多层、束状、成极性排列的形式 ,对兴奋剂刺激产生的收缩反应明显增强 .结果表明 ,超汇合状态的去分化型VSMC脱离血清刺激后 ,可以再分化成熟并重新获得收缩能力