大鼠酰胺化酶的信号肽引导的昆虫细胞表达外泌系统

将大鼠酰胺化酶的信号肽及前导肽编码序列引入昆虫核多角体病毒转移表达载体,构建ＰＡＢＣｈＧＲＦ（Ｇｌｙ）、ＰＡＢＣＩＧＦＩ融合基因的昆虫细胞分泌表达质粒ｐＢａｃＰＡＧ２、ｐＢａｃＰＡＩ,并与经修饰的银纹夜蛾核多角体病毒ＢａｃＰＡＫ６线性化ＤＮＡ共转染秋粘虫细胞Ｓｆ２１,通过同源重组、筛选和鉴定,得到它们的重组病毒ＢａｃＰＡＧ、ＢａｃＰＡＩ。将重组病毒感染Ｓｆ２１细胞,ＰＡＢＣｈＧＲＦ（Ｇｌｙ）和ＰＡＢＣＩＧＦＩ均得到有效外泌表达,表达产物通过ＩｇＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ柱可获得快速纯化。     

人乳铁蛋白基因在昆虫细胞中的表达

将人乳铁蛋白ｃＤＮＡ（ｈＬＦｃ）克隆在质粒ｐＢａｃＰＡＫ８的ＢａｍＨＩ和ＳａｃＩ位点,构建成转移质粒８ｈＬＦｃ。该质粒ＤＮＡ与ＡｃＮＰＶ ＢａｃＰＡＫ６病毒株基因组ＤＮＡ经共转染草地夜峨培养细胞Ｓｆ２１,在培养的贴壁细胞中挑出空斑,经过３轮纯化,结合斑点杂交筛选,获得重组病毒。用蛋白质免疫印迹法检测到在重组病毒感染的Ｓｆ－２１细胞中存在乳铁蛋白基因的表达产物。酶联免疫检测结果表明：重组人乳铁蛋白在     

重组人骨形态形成蛋白2在家蚕幼虫中表达及产物纯化

将编码人ＢＭＰ２ｃＤＮＡ基因插入昆虫杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫ１,与修饰的家蚕核形多角体病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫＤＮＡ共转染家蚕细胞,通过同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的ＢＭＰ２ｃＤＮＡ基因的重组病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫ－ＢＭＰ２。用重组病毒感染家蚕幼虫,第五天ＢＭＰ２表达率最高,每毫升蚕血淋巴中约１０μｇ表达产物;表达产物在在体内被加工成Ｃ－端１６ｋＤ片段,以二硫键连结成分子量为３０ｋＤ的同源二聚体;经纯化获得９０％以上纯度的成熟ＢＭＰ２,与骨基质胶原结合后植入大鼠皮下,７天后在局部诱导生成软骨组织。     

抗品胚抗原单链抗休基因在家蚕细胞和幼虫中的表达

将抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因插入家蚕杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫ－Ｈｉｓ,与修饰的家蚕核型多角体病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫ ＤＮＡ共转染家蚕细胞,经同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的抗ＣＥＡ ＳｃＦｖ基因的重组病毒Ｂｍ－ＢａｃＳｃＦｖ。用重组病毒分别感染家蚕细胞和幼虫,在两者中均得到了高效表达,产物分子量为２８ｋＤ,前者占细胞总蛋白的６％,后者为０．３ｍｇ／蚕。目的基因在家蚕细胞和     

汉滩病毒核壳蛋白（NP）在杆状病毒系统的表达及其免疫原性研究

应用杆状病毒表达载体成功地表达了汉滩病毒７６－１１８株（ＨＴＮＶ）核壳蛋白,将ＨＴＮＶＳ基因插入杆状病毒转染质粒ｐＡｃＹＭＩＢ的多角体基因启动子下游附近,与经Ｂｓｕ３６１酶切线性化的杆状病毒（ＡｃＶＥＰＡ）ＤＮＡ共同转染Ｓ１９细胞,经空斑筛选获得了高效表达ＮＰ的重组杆状病毒（ＡｃＶＨａｎＳ）。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证实,表达产物与ＨＴＮＶ毒粒ＮＰ分子量均为５０ＫＤ左右,紫外扫     

苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)大立方形多角体突变株的分子生物学研究

利用空斑技术,从既能形成多角体又含ＴＫ酶基因的苜蓿丫纹夜蛾重组核型多角体病毒ＡｃＭＮＰＶ－ＴＫ中,纯化了一株形成大立方形多角体的病毒突变株ＡｃＭＮＰＶ－ＴＫｍｔ５１３。用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔⅠ、ＢｇｌⅡ及ＫｐｎⅠ等限制性内切酶对它做了酶切分析,并克隆了多角体蛋白全基因及其侧翼部分的片段。对所克隆的部分全序列测定结果,发现在多角体蛋白基因读码框内只出现了一个碱基的突变,导致了第２５位的氨基酸密码子由ＧＧＴ变为ＧＡＴ,该位氨基酸由甘氨酸（Ｇｌｙ）变为天冬氨酸（Ａｓｐｑ）还利用ＰＣＲ技术扩增出突变了的多角体蛋白基因部分片段,并将它克隆入转移载体质粒ｐＥＶ５５,与不形成多角体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ＨＢｓＤ４ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞,结果产生同样的大立方形多角体病毒。     

江浙蝮蛇神经生长因子在家蚕幼虫中的表达

江浙蝮蛇神经生长因子（ＮＧＦ）基因克隆于昆虫病毒转移栽体ｐＢａｃＰＡＫ８中,获得重组转移栽体ｐＢａｃ－ＰＡＫ－ＮＧ〈与线性化Ｂｍ－ＡａｃＰＡＫ６修饰病基因组ＤＮＡ共转染家蚕细胞,经过体内重组,筛选到重组病毒。用重组病毒洒家蚕幼虫,５天后收集血淋巴,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测及利用ＰＣ１２细胞进行ＮＧＦ生物活力测定证明,神经生长因子在家蚕幼虫中得到较高表达,且表达产物具有良好的生物学活性     

重组家蚕病毒表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白

将传染性囊病病毒ＨＺ９６株主要宿主保护性抗原ＶＰ２的ｃＤＮＡ基因克隆到杆状病毒转移载体ｐＢａｃ－ＰＡＫ８中,获得重组转移载体ｐＢａｃＰＡＫ－ＶＰ２,载体ｐＢａｃＰＡＫ－ＶＰ２与修饰病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫ６线性化基因组ＤＮＡ共转染单层家蚕Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（Ｂｍ）Ｎ细胞,经细胞内同源重组,筛选到重组病毒。ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫鲩迹结果表明,ＶＰ２在家蚕培养细胞和家蚕幼虫中均得到了表达。     

抗癌胚抗原单链抗体基因在家蚕细胞和幼虫中的表达

将抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因插入家蚕杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫＨｉｓ, 与修饰的家蚕核型多角体病毒ＢｍＢａｃＰＡＫＤＮＡ共转染家蚕细胞, 经同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的抗ＣＥＡＳｃＦｖ 基因的重组病毒ＢｍＢａｃＳｃＦｖ。用重组病毒分别感染家蚕细胞和幼虫, 在两者中均得到了高效表达, 产物分子量为２８ｋＤ, 前者占细胞总蛋白的６ ％ , 后者为０ ．３ ｍｇ／ 蚕。目的基因在家蚕细胞和幼虫中表达产物经Ｎｉ２＋ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ亲和柱纯化, 前者纯度可达９０％ 以上, 后者纯度较低; 纯化后的融合蛋白具有ＣＥＡ 结合活力, 其亲和常数分别为５ ．４×１０８／ｍｏｌ·Ｌ－ １ 和２．３ ×１０８／ｍｏｌ·Ｌ－１ , 略低于其亲本单抗Ｅ７Ｂ１０ ２．７ ×１０９／ｍｏｌ·Ｌ－ １ 。     

汉滩病毒包膜糖蛋白G1和G2重组杆状病毒表达载体的构建与表达及其免疫原性

将汉滩病毒（ＨＴＮＶ）Ｍ基因插入杆状病毒转移质粒ｐＡｃＹＭＩＢ多角体启动子下游附近,与Ｂｓｕ３６１酶切线性化的杆状病毒（ＡｃＶＥＰＡ）ＤＮＡ共同转染Ｓｆ９细胞,经空斑筛选获得了表达包膜糖蛋白（Ｇ１、Ｇ２）的重组杆状病毒（ＡｃｖＨａｎＭ）。经纯化ＡｃＶＨａｎＭＤＮＡ的Ｓｏｕｔｈｅｍｂｌｏｔ证实,Ｍ基因正确插入了杆状病毒基因组中。用抗糖蛋白混合单克隆抗体和病人血清做免疫荧光染色,观察到细小的特异性荧光颗粒,呈典型的核周分布。免疫荧光检测还证实,重组糖蛋白与９株抗糖蛋白单抗均起反应,提示重组糖蛋白的抗原位点分布与病毒毒粒糖蛋白相同或相似,用放射免疫沉淀（ＲＩＰ）分析仅显示Ｇ２带,且表达的Ｇ２分子量略小于病毒Ｇ２,这可能与两者的糖基化程度不同有关。研究还表明,重组糖蛋白具有细胞融合活性。     

中国棉铃虫核型多角体病毒DNA聚合酶基因的克隆和序列分析

应用谷实夜蛾核型多角体病毒（ＨｚＳＮＰＶ）ＤＮＡ聚合酶基因ＨｉｎｄⅢ／ＰｓｔⅠ３５９６ｂｐ片段作探针,经Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交,克隆了中国棉铃虫核型多角体病毒（ＨａＳＮＰＶ）完整的ＤＮＡ聚合酶基因,大小约为３．４ｋｂ。限制性内切酶分析表明,ＨａＳＮＰＶＤＮＡ聚合酶基因限制性内切酶图谱与ＨｚＳＮＰＶ相似。用双脱氧链终止法测定该基因部分核苷酸序列（８０５ｂｐ）,推导出编码区２０６ａ。序列同源性比较显示,ＨａＳＮＰＶＤＮＡ聚合酶与ＨｚＳＮＰＶ之间具有高度的同源性;与ＬｄＭＮＰＶ、ＡｃＭＮＰＶ、ＢｍＳＮＰＶ、ＣｆＭＮＰＶ和ＯｐＭＮＰＶ也具有一定的同源性     

杆状病毒DNA解旋酶

ＤＮＡ解旋酶 (ｈｅｌｉｃａｓｅ)是ＤＮＡ复制过程中一类重要的酶 ,负责打开ＤＮＡ双链 ,并参与新生链的合成 ,在ＤＮＡ修复和重组过程中都发挥着必不可少的作用。杆状病毒ＤＮＡ解旋酶除了参与ＤＮＡ复制外 ,对于晚期基因的转录、关闭宿主蛋白质合成及决定杆状病毒宿主域方面都有重要的作用。1.杆状病毒解旋酶的结构目前已有 5种杆状病毒的ＤＮＡ解旋酶基因得到克隆并测序 ,分别是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(ＡｃＭＮＰＶ) ,黄杉毒蛾核多角体病毒 (ＯｐＭＮＰＶ) ,家蚕核多角体病毒 (ＢｍＮＰＶ) ,甜菜夜蛾核多角体病毒(ＳｅＭＮＰＶ)及粉…     

斜纹夜蛾核多角体病毒几丁质酶基因的克隆及序列分析

以苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｔｉｒｎｉｃａ ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ,ＡｃＭＮ－ＰＶ）基因组含几丁质酶基因（ｃｈｉＡ）的ｐｓｔＩ Ｍ片段为探针,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交将斜纹夜蛾核多角体病毒（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ,ＳｐｌｔＮＰＶ）的ｃｈｉ     

一种新型家蚕核多角体病毒Bac to Bac系统的构建

用家蚕核型多角体病毒的全基因组ＤＮＡ与Ａｃ－ＢａｃｉｍｉｄＤＮＡ共转染家蚕ＢｍＮ细胞,构建转座一穿梭载体Ｂｍ－Ｂａｃｍｉｄ。另一供体质粒以转座方式将乙肝病毒ｅ抗的基因ＨＢｅＡｇ整合到Ｂｍ－Ｂａｃｍｉｄ的ａｔｔＴｎ７位点上成为重组ｒＢｍＨＢｅ。结果表明Ｂｍ－Ｂａｃｍｉｄ既能在大肠杆菌中以质粒的形式复制,又能在家蚕ＢｍＮ细胞和草地夜蛾Ｓｆ９细胞中复制,形成感染性病毒粒子。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎ     

小鼠金属硫蛋白 Ⅰ cDNA编码序列的克隆及其在昆虫细胞中的表达

将质粒ｐＢＸ－ＭＴ上的小鼠ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ片段切下作为模板,通过ＰＣＲ方法删除该片段的非编码序列,将编码序列克隆到质粒ｐＢＳ－ＳＫ中,经ＤＮＡ序列测定后证明其克隆序列正确．再将ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ编码序列插入到转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８的ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ位点之间,通过磷酸钙／ＤＮＡ共转染方法将其导入昆虫细胞Ｓｆ９中,以Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＤｏｔＥＩＡ方法对表达产物进行了检测,表达量为１ｍｇ／Ｌ     

小鼠金属硫蛋白ⅠcDNA编码序列的克隆及其在昆虫细胞中的表达

将质粒ＰＢＸ－ＭＴ上的小鼠ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ片段切下作为模板,通过ＰＣＲ方法删除该片段的非编码序列,将编码序列克隆到质粒ＰＢＳ－ＳＫ中,经ＤＮＡ序列测定后证明其克隆序列正确,再将ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ编码序列插入到转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８的ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ位点之间,通过磷酸钙／ＤＮＡ共转染方法将其导入昆虫细胞Ｓｆ９中,以Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和ＤｏｔＥＩＡ方法对表达产物进行了检测,表达量为１ｍｇ＝     

Epstein－Barr病毒潜伏膜蛋白（LMP）基因在哺乳动物传代细胞中的表达

ＥＢ病毒潜伏膜蛋白（ＬＭＰ）是由病毒编码的主要的与病毒致宿主细胞潜伏感染有关的蛋白之一。我们用基因重组技术,把含有ＬＭＰ基因（ＢＮＬＦ１）３个外显子（ｅｘｏｎ）开放阅读框架（ＯＲＦ）的长１．８０ｋｂｐ的ＤＮＡ片段,和能分解ＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ的含有ＳＶ４０早期启动子和ＨｇｒｙｏｍｙｃｉｎＢ磷酸转移酶全基因（长１０２５ｂｐ）的ＤＮＡ片段（长１．６０ｂｐ）,同时重组于亚克隆载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（ｐＢＳ）中,并使该重组质粒ｐＢＳ－ＬＭＰ－Ｈｙｇ（长５７６７ｂｐ）在乳地鼠肾传代细胞（ＢＨＫ）中获得表达。ＢＨＫ细胞在经此重组质粒转染后,ＬＭＰ阳性细胞是２％,在ＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ的持续压力下,ＬＭＰ表达细胞率可达２０％。３个月后,ＬＭＰ表达细胞逐渐减少。５个月后,不能测到ＬＭＰ表达细胞。经免疫荧光和蛋白印迹（Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ）实验证实,人鼻咽癌、风湿性关节炎和正常人血清中不含有抗ＬＭＰ抗体。     

BIV—1—gp120在重组杆状病毒系统中的表达

将中国株ＨＩＶ－１Ｂ亚型ｇｐ１２０全基因序列克隆到杆状病毒转座载体ｐＦａｓｔＢａｃＩ中多角体启动子下游,构建成重组转座载体ｐＦａｓｔＢａｃＩ－ｇｐ１２０,利用细菌／杆状病毒（Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃ）表达系统筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞Ｓｆ９中高效表达了ＨＩＶ－１的外膜糖蛋白ｇｐ１２０,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析结果一致,证明表达了２种糖基化程度不同的ｇｐ１２０。     

重组人干细胞因子在昆虫细胞中的高效表达

含信号肽的可溶性人干细胞因子（ｈＳＣＦ）ｃＤＮＡ 基因重组于杆状病毒转移载体ｐＶＬ９４１ 中,重组转移载体ｐＶＬ９４１ＳＣＦ与野生型苜蓿夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ 共转染草地夜蛾细胞Ｓｆ９ 后,通过体内同源重组构建了重组病毒ＡｃＮＰＶＳＣＦ。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交表明重组病毒基因组中含有ｈＳＣＦ基因片段。重组病毒感染单层Ｓｆ９ 细胞后,表达产物分泌到胞外培养液中。用ＭＴＴ 比色法和ＴＦ１ 细胞株测定表达产物与ＩＬ３ 的协同效应,测得感染重组病毒的培养细胞第三天表达量为１９７０ ｕｎｉｔｓ／ｍ Ｌ培养液。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析可见分子量为１８ ×１０３ 、２０ ×１０３ 和２２ ×１０３ 三条带。     

一株拓宽宿主范围的昆虫杆状病毒的筛选和木质素酶的异源表达

将ＡｃＮＰＶ ＤＮＡ和ＢａｍＨＩ酶解的ＢｍＮＰＶ ＤＮＡ共转染ＳＦ２１细胞,再用子代病毒反复感染ＳＦ２１和ＢｍＮ细胞。经空斑分析纯化,筛选出既能在ＳＦ细胞又能在ＢｍＮ细胞中复制多角体病毒的昆虫核型多角体病毒。限制酶２分析表明筛选所得的病毒为ＡｃＮＰＶＢｍＮＰＶ的杂交型。