NifA蛋白的N末端结构域决定肺炎克氏杆菌和阴沟肠杆菌中NifA蛋白的温度敏感性

NifA蛋白是固氮基因的中心调节物.它激活nif基因转录时依赖于σ54-RNA聚合酶全酶.肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae, Kp)NifA蛋白由3个结构域组成,即功能不明的N末端结构域,具有ATP酶活性的中心催化结构域和C末端DNA结合结构域.Kp NifA蛋白对温度敏感,而阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae,Ec)NifA蛋白的温度敏感性不如Kp NifA蛋白.实验结果表明NifA蛋白的N末端结构域对该蛋白的温度敏感性起决定性作用.     

苜蓿中华根瘤菌Sm NifA蛋白与阴沟肠杆菌Ec NifA蛋白功能差异的研究

nifA基因是固氮基因nif的调节基因, 其产物NifA蛋白是固氮过程的中心调节因子. 将多拷贝组成型表达的苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti, Sm) nifA基因或阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae, Ec) nifA基因引入苜蓿中华根瘤菌野生型菌株Sm1021和苜蓿中华根瘤菌nifA突变型菌株SmY中, 并检测这些苜蓿中华根瘤菌感染苜蓿之后根瘤的表型及固氮酶活性. 实验结果表明, 苜蓿中华根瘤菌NifA蛋白和阴沟肠杆菌NifA蛋白在苜蓿中华根瘤菌中的功能有明显差异. 在野生型菌株Sm1021中, 引入多拷贝Sm nifA基因对宿主根瘤固氮效率的促进作用明显优于引入多拷贝Ec nifA基因的作用. 引入多拷贝Sm nifA基因的SmY菌株(nifA突变型)能够共生固氮, 而引入Ec nifA基因的SmY菌株仍然不能固氮. 氨基酸序列同源性分析显示, N末端结构域是Sm NifA蛋白和Ec NifA蛋白同源性最低的功能域. 进一步研究表明, Sm NifA蛋白的N末端结构域在互补苜蓿中华根瘤菌nifA突变型菌株SmY的固氮功能时是必需的.     

华葵根瘤菌nifA基因的克隆和功能分析

华葵根瘤菌(Mesorhizobium huakuii即R.astragali)159的nifA基因的序列分析表明,该基因全长1227bp,编码分子量为44734D的Nif A蛋白。与其它NifA蛋白的序列比较发现,华葵根瘤菌NifA蛋白也存在保守的中间结构域和C末端DNA结合结构域,但其氨基端缺失。Tn5定点突变得到的突变体是Nif-表型。构建了nifA基因组成型表达的质粒,此质粒在大肠杆菌中对华葵根瘤菌nifHlacZ有激活作用。     

哺乳动物BMP4蛋白功能位点的进化踪迹分析

哺乳动物骨形态发生蛋白(BMPs)具有促进动物软骨形成,调节细胞增殖、分化及迁移的多种功能。此外,该蛋白在动物个体发育及人(Homo sapiens)肿瘤的发生、发展过程中也扮演着重要角色。本文以人源骨形态发生蛋白4(BMP4)为种子序列,利用多种生物信息学工具进行哺乳动物BMP4蛋白的序列查找及其同源蛋白的搜索,共得到具有完整结构域的同源蛋白序列72条,并以此为基础对哺乳动物BMP4的进化踪迹位点及相关的功能位点进行比较研究。结果表明,BMP4蛋白家族的TGFβ-propeptide结构域具22个全家族保守残基,而TGF-β结构域仅具84个亚家族特异性残基。人BMP4蛋白TGF-β结构域的配基结合位点主要分布于结合口袋的边缘区域。本研究可为BMP4蛋白重要功能区残基的确定及未知功能位点的预测提供信息。     

核受体辅活化子PNRC与孤儿核受体SF1的相互作用有赖于SF1的AF-2功能结构域

核受体辅活化子PNRC(proline richnuclearreceptorcoregulatoryprotein ,富含脯氨酸的核受体辅调节蛋白 )可通过含SH3结合模体的PNRC2 78 30 0区域与孤儿核受体类固醇生成因子 1(steroido genicfactor 1,SF1)相互作用 .激活功能 2 (activationfunction 2 ,AF 2 )结构域在核受体配体依赖性转录激活中发挥了重要作用 ,为探讨AF 2结构域在SF1转录激活中的作用机制 ,采用酵母双杂合分析、缺失突变技术和瞬时转染等研究方法考察了AF 2结构域对SF1反式激活功能及SF1与PNRC相互作用的影响 .SF1的反式激活功能有赖于AF 2结构域 ,其机制是SF1AF 2结构域的突变严重影响了SF1与PNRC的有效相互作用 ,并消除了PNRC对SF1反式激活功能的辅激活作用 .结果表明 ,SF1与PNRC的相互作用有赖于AF 2的功能结构域     

伪狂犬病毒VP22蛋白C-端系列缺失突变体的构建及亚细胞定位分析

以绿荧光蛋白(GFP)为标记,构建了一系列伪狂犬病毒VP22蛋白的C-端缺失突变体与GFP融合表达的真核表达质粒,脂质体介导转染Hela细胞,通过荧光显微镜观察分析各个缺失突变体的亚细胞定位,发现伪狂犬病毒VP22蛋白与核定位有关的结构域在第60个到第90个氨基酸残基之间,第111个到第159个氨基酸残基有可能与形成细胞核内的颗粒有关,与微管蛋白结合有关的结构域可能在第187到第241个氨基酸残基之间.上述研究结果为进一步深入研究伪狂犬病毒VP22蛋白的结构与功能奠定了基础.     

绿竹SEP3-like蛋白表达纯化以及不同结构域互作研究

在双子叶植物中,SEPALLATA3(SEP3)参与生殖生长的很多方面,包括花分生组织和花器官的形成。但是在单子叶植物中,花器官形成的分子机制还不清楚。为了揭示单子叶植物中SEP3蛋白的结构以及聚合体的形成与生物学功能的关系,以单子叶植物绿竹Bambusa oldhami为材料,构建绿竹SEP3(BoSEP3)蛋白不同结构域原核表达载体,在大肠杆菌中进行重组蛋白诱导表达,获得不同结构域的可溶蛋白,通过镍柱及分子筛分离纯化表明,BoSEP3蛋白K结构域以四聚体形式存在;同时构建BoSEP3蛋白不同结构域的酵母表达载体,通过酵母双杂交系统检验BoSEP3蛋白同源互作表明,K结构域有参与形成多聚体的功能。实验提供了一套表达纯化BoSEP3蛋白以及检验蛋白质互作的有效方案,为开展BoSEP3蛋白功能和结构生物学研究奠定了基础。     

TBC蛋白家族成员在人类疾病发生发展中的作用

TBC(Tre-2/Bub2/Cdc16)是真核生物中普遍存在的一种由200个氨基酸残基组成的保守性蛋白质结构域,含有该结构域的蛋白质被称为TBC蛋白。TBC蛋白具有GTPase激活活性,可促进小G蛋白Rab-GTP水解为Rab-GDP,从而参与特异的胞内转运过程。在哺乳动物中,部分TBC蛋白具有十分重要的作用,其功能异常与人类疾病的发生发展密切相关。本文主要介绍了哺乳动物TBC蛋白的结构和功能,以及近年来TBC蛋白在人类疾病发生发展中的作用,以期为深入解析TBC蛋白的致病机制提供参考。     

鲫鱼PKZ Zα结构域与d(GC)、d(TA)重组质粒的结合

Zα是能够特异性识别并结合左旋DNA(Z-DNA)的蛋白结构域,首先在人ADAR1中鉴定,随后又在ZBP-1(DLM-1)和E3L等蛋白质中发现了该结构域．鲫鱼PKZ是首次报道的具有Zα结构域的鱼类eIF2α激酶．为深入了解鲫鱼PKZ Zα的功能,原核表达并亲和层析纯化了3种多肽,即野生型PZα(Zα1Zα2)、替换型P(Zα1)2(Zα1Zα1)和点突变型（PZαK34A、PZαS35A、PZαR39A、PZαP57A）．同时,构建了含有d(GC)6、d(GC)13、d(TA)13特殊插入序列的3种重组质粒,用于体外模拟Z-DNA．凝胶阻滞实验分析了3种多肽分别与重组质粒的亲和性结果表明,PZα和P(Zα1)2能够与d(GC)重组质粒结合,并且随着多肽含量的增加,阻滞效应越明显．与野生型PZα相比,替换型P(Zα1)2结合d(GC)重组质粒的能力更强PZα和P(Zα1)2还能微弱地与d(TA)13重组质粒结合．点突变型多肽都不能与重组质粒结合,暗示鲫鱼PKZ Zα结构域中这4个氨基酸残基在结合核酸分子的过程中非常关键．该文结果有利于进一步揭示鱼类PKZ Zα结构域与Z-DNA结合的分子机理．     

多聚磷酸盐及其代谢酶的研究进展

多聚磷酸盐(polyP)是由几个到几百个无机磷酸盐单体通过高能磷酸键聚合而成的线性多聚体,广泛分布于自然界和生物体.本文总结了polyP在生物体中的重要功能,包括基因表达和调控、DNA的摄取、微生物的运动性、对胁迫和饥饿的应答、病原菌的毒性以及对细胞凋亡、血液凝固、细胞钙化、线粒体功能的调节,需要polyP的酶有内切酶、葡萄糖激酶、NAD激酶和AMP磷酸转移酶等.本文对调控polyP的多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinase,ppk)和外切聚磷酸酶(exopolyphosphatase,PPX )的生化性质和结构也进行了总结.同时,结合我们的研究工作,重点分析了结核分枝杆菌中PPX的同源蛋白和可能的生物化学活性.     

金黄色葡萄球菌蛋白A (SpA) Z结构域串联体的克隆、表达和筛选

筛选一种高效重组金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)用于制备抗体纯化亲和介质。首先通过基因操作获得金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)的Z结构域单体、二串体、三串体、四串体和五串体基因,将目的基因分别克隆至pET-22b表达载体并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,获得不同串联个数的Z结构域基因工程菌,经诱导表达和Ni2+亲和层析纯化得到Z结构域单体和二-五串体蛋白。纯化后的目的蛋白偶联至琼脂糖凝胶作为亲和层析介质,对人免疫球蛋白G(IgG)进行分离纯化。分析比较Z结构域串联体蛋白产量及其偶联的亲和介质对抗体吸附载量的差异。结果表明,构建的Z结构域单体、二串体、三串体、四串体和五串体基因工程菌能有效表达目的蛋白,制备的凝胶亲和介质可特异性吸附人IgG。增加Z结构域串联数,重组蛋白产量和单位摩尔数多聚体蛋白吸附载量获得提高,其中,重组四串体蛋白产量大(160 mg/10 g湿菌体),对抗体的吸附载量高(34.4 mg人IgG/mL胶),更适合作为配基用于亲和层析介质的制备。     

人类Cornulin蛋白S100结构域钙依赖的多聚化能有效减少细胞的损伤

在哺乳动物中发现一类新的能够抵制环境压力和保持组织完整性的应激蛋白.含有S100钙结合结构域的Cornulin(CRNN)是这类蛋白质之一,它在人类食管鳞状上皮细胞中高表达,而在食管鳞状上皮细胞癌中却低表达,它能抑制脱氧胆酸诱导的细胞损伤.S100结构域在CRNN的功能上具有重要作用.为了进一步探讨CRNN S100结构域的生物学特性,克隆、表达、纯化了该结构域,证明其折叠正确,适合用于生物物理和生物化学特性的研究.更为重要的是,通过核磁共振、凝胶过滤层析、超速离心、质谱和蛋白质交联分析,发现S100结构域具有钙依赖的多聚性质,而多聚体的形成更有利于保护细胞免受脱氧胆酸和乙醇的损伤.上述结果表明,S100结构域是CRNN发挥功能的关键结构域,它可以通过多聚化更好地保护细胞.该工作将进一步揭示S100结构域的生物学功能.     

伪狂犬病毒VP22蛋白C-端系列缺失突变体的构建及亚细胞定位分析

以绿荧光蛋白(GFP)为标记,构建了一系列伪狂犬病毒VP22蛋白的C-端缺失突变体与GFP融合表达的真核表达质粒,脂质体介导转染Hela细胞,通过荧光显微镜观察分析各个缺失突变体的亚细胞定位,发现伪狂犬病毒VP22蛋白与核定位有关的结构域在第60个到第90个氨基酸残基之间,第111个到第159个氨基酸残基有可能与形成细胞核内的颗粒有关,与微管蛋白结合有关的结构域可能在第187到第241个氨基酸残基之间。上述研究结果为进一步深入研究伪狂犬病毒VP22蛋白的结构与功能奠定了基础。     

十字花科黑腐病菌中GGDEF结构域蛋白差异的in silico分析

近年来,含有GGDEF结构域(含有甘氨酸(G) (2个),天冬氨酸(D),谷氨酸(E),苯丙氨酸(F)保守氨基酸)的蛋白受到重视,已证实含GGDEF结构域蛋白在细胞信号转导、生长和致病性等方面发挥了重要作用.十字花科黑腐菌8004菌株(Xanthomonas campestris pv.campestris str.8004,Xcc 8004)有32个基因编码含GGDEF结构域蛋白,实验证明其中部分蛋白与Xcc致病性、胞外酶产生、生物膜形成和泳动等生命活动相关.本文利用互联网提供的生物信息学资源,对Xcc 8004不同功能含GGDEF结构域蛋白进行生物信息学分析,着重分析其结构域架构.对蛋白结构域架构整体比较显示,这些蛋白的整体结构域架构具有多样性,共有结构域架构仅有PAS_4-GGDEF-EAL (分布于参与致病的蛋白中);对结构域架构局部比较显示,在参与致病性的含GGDEF结构域蛋白中,PAS_4-GGDEF和GGDEF-EAL为共有结构域架构;在参与内切葡聚糖酶产生的蛋白中,PAS_4-PAS_4、PAS_4-GGDEF和GGDEF-EAL为共有结构域架构.本研究结果将为蛋白质功能预测提供线索.     

SND1蛋白与HuR蛋白相互结合作用

人源SND1(staphylococcal nuclease domain containing 1)蛋白由N端的SN(staphylococcal nucleases)结构域和C端的TSN(Tudor-SN5)结构域组成,其中SN结构域又包含SN1~SN4四个重复的功能片段.本课题组前期研究结果表明,SND1蛋白可以通过SN结构域与G3BP(Ras-GAP SH3 domain-binding protein)蛋白相互结合,共同参与细胞应激颗粒(stress granules,SGs)的形成.SGs是真核细胞在受到氧化应激、病毒感染等外界刺激时在胞浆内形成的与RNA代谢相关的颗粒状结构.对于SGs的成分鉴定及相互作用的分析一直是学者们研究的热点.本研究中,免疫共沉淀实验结果表明,以抗SND1抗体可以共沉淀出HeLa细胞内另一个重要的应激相关人类抗原R(human antigen R,HuR)蛋白.另外,利用脂质体转染法将pcDNA3-FLAG-HuR重组质粒瞬时转染入HeLa细胞,成功过表达外源性的FLAG-HuR融合蛋白,再以抗FLAG标签抗体又可以反向共沉淀出内源性SND1蛋白,证明SND1与HuR之间存在蛋白质间的相互结合作用.细胞免疫荧光实验结果表明,当给予HeLa细胞0.5 mmol/L亚砷酸钠氧化应激时,SND1与HuR蛋白共同定位于胞浆中的SGs结构中.GST-pulldown实验结果进一步表明截短的SN结构域可以结合HuR蛋白,其中以SN1功能片段的结合能力最强,表明SND1蛋白是通过SN结构域与HuR蛋白形成应激复合物,参与SGs的胞浆组装.并不定位于SGs的TSN结构域亦可结合HuR蛋白,提示SND1-HuR的蛋白相互作用可能并不局限于SGs,具有其它方面的功能意义.     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因特性分析

营养期杀虫蛋白是在苏云金芽胞杆菌营养期中发现的一种非晶体状胞外杀虫蛋白 .通过Southern杂交的基因定位实验 ,证实了营养期杀虫蛋白基因并非位于染色体和环型质粒上 ;在 2 0个不同血清型的 2 3种菌株中 ,营养期杀虫蛋白基因的存在率为 5 6 5 % (13 2 3) .同时对随机选择的 3个不同亚种菌株进行基因克隆和序列分析 ,表明其基因具有相当高的同源性 .运用生物信息技术 ,对营养期杀虫蛋白多肽进行了功能结构域比对分析 ,发现这 789多肽蛋白的N端 31至 15 0残基之间存在一种趋化信号传导因子相似序列 ,C端 5 36至 6 6 6残基之间则存在着纤维素结合结构域相似肽 .上述结果提示 ,营养期杀虫蛋白基因在苏云金芽胞杆菌天然菌株中高度保守并较为广泛分布 ,其编码蛋白的特殊结构提示了营养期杀虫蛋白潜在的功能特性 ,为进一步研究营养期杀虫蛋白奠定了基础 .     

FHL2转录激活结构域的定位

LIM蛋白家族成员FHL2 (fourandhalfLIMdomainprotein)在转录调节、细胞凋亡及肿瘤的发生发展中都起着重要作用。利用GAL4转录因子中的DNA结合结构域 (DBD)和含有与DBD结合序列的荧光素酶报告基因(GAL4 LUC)构建了哺乳动物细胞转录激活系统 ,并利用该系统定位了FHL2的转录激活结构域。首先将GAL4 DBD序列以正确读框插入到pcDNA3载体的多克隆位点中 ,构建成真核表达载体pDBD ,再将野生型FHL2及其不同片段以正确读框与pDBD中GAL4 DBD序列融合 ,构建成野生型FHL2及其缺失突变体表达载体。将这些表达载体分别瞬时转染 2 93T胚胎肾细胞 ,野生型FHL2及其缺失突变体都得到了表达。利用GAL4 荧光素酶报告基因对野生型FHL2及其不同突变体的转录激活活性检测表明 ,在 2 93T胚胎肾细胞和乳腺癌MCF 7细胞中 ,野生型FHL2具有转录激活活性 ,缺失N端半个LIM结构域使FHL2转录激活活性降低 ,缺失C末端第二个LIM结构域对FHL2的转录激活功能影响不大 ,缺失C末端最后一个LIM结构域则使FHL2的转录激活功能完全丧失 ,而C末端缺失 2个LIM结构域使FHL2转录激活活性又有所恢复。这说明FHL2C末端最后一个LIM结构域对其转录激活功能是必需的 ,而C末端第二个LIM结构域可能对FHL2的转录激活功能有负调控作用 ,这种负调控作用取决于     

PES1蛋白与雄激素受体的相互作用及定位

目的:研究PES1蛋白与雄激素受体(AR)之间的相互作用。方法:利用免疫共沉淀实验检测PES1蛋白与AR之间的相互作用,并进行相互作用定位;利用Western印迹研究PES1对乳腺癌细胞内AR表达水平的影响。结果:免疫共沉淀实验显示PES1蛋白与AR存在相互作用;PES1蛋白的1~110、111~220、221~320和311~588氨基酸残基(aa)区域均能与AR结合,415~588 aa不能结合AR;AR的651~918 aa区域与PES1结合。PES1不能调节乳腺癌细胞AR的表达水平。结论:PES1多个区域均能与AR相互作用,并且主要结合在AR的转录激活结构域2,为进一步探讨PES1对AR功能的调节奠定了基础。     

巴西固氮螺菌Yu62nifA基因克隆、测序及功能分析

用TD-PCR法克隆了巴西固氮螺菌(Azospirillun brasilense)Yu62的nifA基因.序列分析表明它与巴西固氮螺菌Sp7的nifA序列高度同源(96.5%),其编码的产物NifA蛋白与Sp7菌株NifA的氨基酸序列同源性为97.6%.该基因可以完全互补巴西固氮螺菌Sp7 nifA-突变株的Nif-表型.研究了NH4+和O2对Yu62 nifA基因的表达及NifA活性的影响.结果表明mfA基因在Yu62菌株中是部分组成型表达的,氨和氧不能完全阻遏其表达,在5mmol/LNH4Cl与微氧(0.5%O2)条件下表达最高;NifA蛋白在0.4%～0.5%O2时活性最高,氧分压降低和提高都使NifA活性下降,1mmol/L NH4Cl足以抑制NifA的活性.     

蛋白质多聚SUMO化修饰及其功能

泛素（ubiquitin, Ub）是一类高度保守的小蛋白, 可与靶蛋白的赖氨酸残基共价连接, 形成多聚泛素链行使功能. 类似于泛素化修饰过程, 小泛素相关修饰物(small ubiquitin related modifier, SUMO）也可以共价修饰靶蛋白的赖氨酸残基, 从而影响靶蛋白的定位、稳定性以及蛋白间的相互作用, 发挥重要的生理功能. 尽管在多数情况下, 靶蛋白发生的是单SUMO化修饰, 但最近研究发现,SUMO依赖自身的赖氨酸也可以形成多聚链. 与单SUMO化修饰不同的是, 多聚SUMO化修饰的靶蛋白可以进一步被泛素化修饰, 进而诱导靶蛋白的降解. 这是一种新的、特殊的化学修饰形式, 弄清它的生理功能,对于了解细胞的生长、分化以及凋亡等生理过程将具有重要的意义. 本文将就此方面的最新研究进展做一综述.