OC-IΔD86 (Oryzacystatin-IΔD86)基因的原核表达及活性分析

根据OC-IΔD86基因序列, 设计合成了7条寡核苷酸片段, 通过重叠延伸PCR技术合成了OC-IΔD86基因, 利用设计好的BamH I/ Xho I酶切位点将OC-IΔD86基因克隆到原核表达载体pet21b中, 在1 mmol/L的IPTG 诱导后5 h, OC-IDD86融合基因在大肠杆菌中得到表达, 表达产物处于可溶状态, 其表达量占总蛋白的11.4%, 可溶性蛋白的16.4%; 利用Ni-NTA系统纯化该蛋白并经PEG20000浓缩后, 活性分析表明该蛋白酶抑制剂在体外表现出对木瓜蛋白酶明显的抑制作用。这为转OC-IΔD86基因的抗根结线虫植物基因工程抗体制备, 以及进一步体内的抗根结线虫研究奠定了基础。     

转HS1prol基因番茄植株的获得

目的为了减少根结线虫对番茄的危害,研究并获得转抗线虫基因HS1prol番茄植株.方法在鉴定表达载体之后,采用CaCl2法制作农杆菌EHA105感受态细胞,然后用冻融法将HS1prol基因转入农杆菌中.通过农杆菌介导法将HS1prol基因导入无菌番茄外植体中,获得抗根结线虫转化再生植株.用卡那霉素筛选到再生植株后,提取抗性芽的基因组,利用设计好的引物进行PCR鉴定.结果与结论目的基因已整合到番茄基因组中,获得了转HS1prol基因番茄植株.     

转HS1~(pro1)基因番茄植株的获得

目的:为了减少根结线虫对番茄的危害,研究并获得转抗线虫基因HS1pro1番茄植株。方法:在鉴定表达载体之后,采用CaCl2法制作农杆菌EHA105感受态细胞,然后用冻融法将HS1pro1基因转入农杆菌中。通过农杆菌介导法将HS1pro1基因导入无菌番茄外植体中,获得抗根结线虫转化再生植株。用卡那霉素筛选到再生植株后,提取抗性芽的基因组,利用设计好的引物进行PCR鉴定。结果与结论:目的基因已整合到番茄基因组中,获得了转HS1pro1基因番茄植株。     

苏云金芽胞杆菌杀线虫伴胞晶体蛋白基因cry6Aa的克隆与表达

通过对晶体蛋白N-末端氨基酸测序,设计简并探针,从对根结线虫高毒力苏云金芽胞杆菌YBT-1518菌株中克隆到1个含有杀线虫晶体蛋白基因的片段。序列测定表明该序列含有两个ORF(orf1和orf2),其中orf1与基因cry6Aa1同源性为98%,已在GenBank上登录(Acc.NO.AF499736),并被命名为cry6Aa2。将克隆的该片段克隆到穿梭载体pHT304上,并转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,重组菌株可形成米粒状伴胞晶体。生物测定表明,表达的毒素蛋白对北方根结线虫的LC50为9.47μg/mL,毒力与出发菌株(10.74μg/mL)相当。     

小眼虫藻△8-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

△8途径是合成多不饱和脂肪酸的替代途径,△8-脂肪酸脱氢酶是该途径的关键酶之一.根据已报道的△8-脂肪酸脱氢酶基因设计引物,分别从小眼虫藻基因组DNA和cDNA中扩增得到该基因片段,序列分析表明:结构基因长1 266 bp,编码421个氨基酸;该基因没有内含子,比已经报道的△8-脂肪酸脱氢酶基因长6bp,并且N末端序列也有所不同.利用酿酒酵母的载体pYES2.0构建△8-脂肪酸脱氢酶表达载体pYEFD,并转化到营养缺陷型酿酒酵母菌株INVSc1中,在选择培养基中筛选得到酿酒酵母转化菌株YD8.YD8在合适的培养条件下,添加外源底物二十碳二烯酸和二十碳三烯酸并诱导基因表达.脂肪酸甲酯气相色谱分析表明小眼虫藻△8-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中获得了高效表达,将二十碳二烯酸和二十碳三烯酸分别转化成二高-γ-亚麻酸和二十碳四烯酸,其底物转化率分别达到了31.2%和46.3%.     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1、3D基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中的Ⅰ型鸭肝炎病毒全基因序列设计了扩增Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1、3D基因的引物,用该特异性表达引物从Ⅰ型鸭肝炎病毒cDNA模板中扩增得到目的基因VP1、3D,用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET32a后构建重组表达载体,转化宿主BL21(DE3),用不同浓度的IPTG诱导VP1、3D基因的表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,Western-blotting分析蛋白免疫原性.结果表明,VP1、3D在大肠杆菌中表达量较高,表达产物的分子量约为48 kD、68 kD,并能被兔抗DHV-1血清所识别.Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1、3D蛋白在大肠杆菌中表达产物具有免疫原性.     

RNA干扰在植物抗根结线虫病基因工程应用中的研究进展

植物根结线虫病对农业生产的危害连年加重,以轮作和化学农药为主的传统防治难以满足现代农业生产的需要.以常规的抗性育种和表达外源蛋白为主的抗线虫转基因育种主要受限于抗性基因的匮乏.而近来RNA干扰技术的应用为抗线虫基因工程带来新的突破,通过构建RNA干扰载体,在转基因植物中表达寄生线虫重要基因的dsRNA或siRNA,并经口针取食被导入线虫体内,并引发线虫的系统性RNA干扰反应,导致其出现寄生、发育、代谢、运动等障碍甚至致死,从而使转基因植物实现对寄生线虫的抗性.本文综述了RNAi介导的抗根结线虫基因工程方面的研究进展,分析探讨了这种新的策略的特点并展望了它的应用前景.     

转HSl^prol基因番茄植株的获得

目的：为了减少根结线虫对番茄的危害,研究并获得转抗线虫基因HSl^prol。番茄植株。方法：在鉴定表达载体之后,采用CaCl2法制作农杆菌EHAl05感受态细胞,然后用冻融法将HSl^prol基因转入农杆菌中。通过农杆菌介导法将HSl^prol基因导入无菌番茄外植体中,获得抗根结线虫转化再生植株。用卡那霉素筛选到再生植株后,提取抗性芽的基因组,利用设计好的引物进行PCR鉴定。结果与结论：目的基因已整合到番茄基因组中,获得了转HSl^prol基因番茄植株。     

鸡neurexophilin 1基因在毕赤酵母中的表达

Neurexophilin 1是母鸡子宫阴道结合部位的差异表达基因。根据鸡nxph1的序列,结合毕赤酵母密码子的偏好性,合成nxph1基因,设计引物以合成基因为模板,扩增其去除信号肽的DNA序列△nxph1,将合成的nxph1基因及去除信号肽的nxph1基因片段△nxph1分别插入pPICZαA真核表达载体,构建重组表达质粒pPICZαA/nxph1和去除信号肽的重组表达质粒pPICZαA/△nxph1,电转入毕赤酵母GS115,阳性菌用终浓度为1%的甲醇诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot检测表达产物,结果表明重组菌成功分泌鸡NXPH1蛋白和去除信号的△NXPH1蛋白,大小约29 kD,为探索NXPH1在母鸡生殖道内的功能奠定基础。     

I型鸭肝炎病毒VP1、3D基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中的I型鸭肝炎病毒全基因序列设计了扩增I型鸭肝炎病毒VP1、3D基因的引物, 用该特异性表达引物从I型鸭肝炎病毒cDNA模板中扩增得到目的基因VP1、3D, 用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET32a后构建重组表达载体, 转化宿主BL21(DE3), 用不同浓度的IPTG诱导VP1、3D基因的表达, 收集菌液进行SDS-PAGE电泳, Western-blotting分析蛋白免疫原性。结果表明, VP1、3D在大肠杆菌中表达量较高, 表达产物的分子量约为48 kD、68 kD, 并能被兔抗DHV-1血清所识别。I型鸭肝炎病毒VP1、3D蛋白在大肠杆菌中表达产物具有免疫原性。     

组织蛋白酶D和nm23基因蛋白在乳腺癌中的表达及与淋巴结转移的关系

采用免疫组织化学 ABC法检测了 43例乳腺癌中的组织蛋白酶 D和 nm 2 3基因蛋白的表达。结果显示组织蛋白酶D在乳腺癌组织中表达阳性率为 76 .7% (33/43)。 43例乳腺癌中 2 5例伴有淋巴结转移 ,18例无淋巴结转移 ,其组织蛋白酶D表达阳性率分别为 92 % (2 3/2 5 )及 5 5 .6 % (10 /18) ,两者之间具有显著性差异 (P<0 .0 1)。 nm 2 3基因蛋白在 43例乳腺癌中阳性率为 72 .1% (31/43)。在有淋巴结转移和无淋巴结转移的乳腺癌中 nm2 3基因蛋白阳性率分别为 6 0 % (15 /2 5 )及80 .9% (16 /18) ,nm2 3基因蛋白的表达与淋巴结转移呈显著负相关 (P<0 .0 5 )。结果提示对乳腺癌根治术后无淋巴结转移 ,但组织蛋白酶 D表达阳性 ,nm2 3基因蛋白表达阴性的患者 ,可能具有潜在的复发和转移倾向 ,应多加关注 ,并密切随访。     

抗酶1基因转染对HeLa细胞增殖及细胞周期的抑制作用

研究抗酶(antizyme)1对人宫颈癌HeLa细胞增殖与细胞周期的影响,并分析抗酶1对细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表达影响.采用定点突变技术,将抗酶1的frameshift位点缺失,随后将突变基因重组至真核表达载体pEGFP-N1中,鉴定后转染HeLa细胞.通过MTT法检测细胞增殖变化,流式细胞术分析抗酶1对细胞周期的影响.RT-PCR和Western印迹检测抗酶1转染对细胞周期蛋白 D1基因表达的影响.酶切结果显示,抗酶1突变基因成功克隆至pEGFP-N1中.成功转染HeLa细胞后,检测结果显示,抗酶1能够减慢HeLa细胞增殖速度,并使细胞停滞于G₀/G₁期,细胞周期蛋白D1基因的表达同时受到抑制.实验说明,抗酶1基因能够抑制HeLa细胞增殖,通过降低细胞周期蛋白D1的表达阻滞细胞周期.     

细胞周期蛋白D1特异性核酶表达载体的构建及其活性

应用mfold程序对锤头状核酶(ribozyme,Rz)和大鼠细胞周期蛋白(cyclin)D1基因的二级结构进行分析,设计合成锤头状Rz基因,通过RT-PCR扩增获得大鼠细胞周期蛋白D1目的基因,将Rz基因和细胞周期蛋白D1基因分别克隆入载体pGEM-3Zf( )中,体外转录Rz基因和靶基因并进行切割实验;将Rz基因与逆转录病毒载体pLXSN重组得到Rz真核表达载体pLXSN-Rz,将其转染入HSC-T6细胞,G418筛选出阳性细胞克隆,用RT-PCR检测细胞周期蛋白D1基因的表达。结果显示:针对目的基因的832位点设计合成了Rz832,成功获得Rz832基因、细胞周期蛋白D1mRNA的体外转录载体pGEM3Zf-Rz832和pGEM3Zf-cD1,经体外转录出Rz832(105nt)及细胞周期蛋白D1mRNA(1079nt)。体外切割实验证实Rz832能够特异性切割细胞周期蛋白D1mRNA,产生1014nt和65nt的切割产物,切割效率为80%。所构建的pLXSN-Rz832经酶切电泳、PCR鉴定显示,插入的Rz832序列大小约为57bp,与预期结果相同,经测序证实Rz832序列正确。转染pLXSN-Rz832的肝星状细胞(hepaticstellatecells,HSCs)细胞周期蛋白D1mRNA的表达受到明显抑制,仅为对照组的42.22%(t=-193.443,P<0.01),结果表明:Rz832能够在体外特异性切割细胞周期蛋白D1mRNA、并在HSC-T6细胞内有效抑制细胞周期蛋白D1基因的表达。     

少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达

△6-脂肪酸脱氢酶是一种膜整合蛋白,也是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶.在前期工作中,通过RT-PCR和RACE技术,从少根根霉NK300037中克隆到一个潜在编码△6-脂肪酸脱氢酶的序列,序列和功能分析结果表明该序列具有一个长度为1377bp、编码由458个氨基酸组成、大小为52kD的新的△6-脂肪酸脱氢酶基因.把少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因(RAD6)亚克隆到表达载体pPIC3.5K,构建重组表达载体pPICRAD6,并转化到毕赤酵母菌株GS115进行表达.提取酵母细胞总脂肪酸和进行甲酯化,经气相色谱和气相色谱-质谱连用分析表明,目的基因的编码产物能将C16:1、C17:1、C18:1、亚油酸和α-亚麻酸在△6和7位间特异性脱氢而引入一个新的双键,生成更高不饱和的脂肪酸,该催化反应没有链长特异性,只有键位特异性.此外,按Kozak序列特点,改变目的基因转译起始密码子周边序列结构,并把改变后序列导入毕赤酵母GS115中进行功能表达分析,结果表明在毕赤酵母中这种改变同样能提高目的基因的表达水平.综合所有分析结果表明,巴斯德毕赤酵母更适合用来综合分析△6-脂肪酸脱氢酶基因的功能.     

绿盲蝽核受体基因AlE75D的克隆和性质分析

【目的】克隆绿盲蝽Apolygus lucorum核受体基因E75D全长,明确其表达谱,并获得该基因的重组蛋白及制备其单克隆抗体。【方法】利用RACE法克隆绿盲蝽核受体基因Al E75D全长;qRTPCR法分析绿盲蝽不同日龄成虫(1-16 d)及7日龄雌成虫6种组织(脂肪体、飞行肌、卵巢、马氏管、中肠和表皮)中该基因的mRNA相对表达水平;利用NdeⅠ和XbaⅠ双酶切含有目的基因的p MD18-T载体后进行亚克隆,再利用IPTG诱导的重组质粒进行特异性表达重组蛋白,通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析纯化靶蛋白;最后通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备重组蛋白的单克隆抗体,Western blot验证该抗体的特异性。【结果】从绿盲蝽中克隆获得蜕皮激素核受体基因Al E75D(Gen Bank登录号:KX912700),其开放阅读框长1 911 bp,编码636个氨基酸,预测分子量为75.68 k D;该基因编码蛋白具有E75D的典型特征,由A/B域(23 aa)、D域(85 aa)、E域(190aa)和F域(338 aa)组成,但缺失C域;绿盲蝽Al E75D的氨基酸序列与半翅目蝽科的豆荚草盲蝽Lygus hesperus的E75D序列一致性最高(为98%)。Al E75D在整个绿盲蝽成虫期均有表达,在7日龄雌成虫中达到峰值;此外,Al E75D在雌成虫6个供试组织中也均有表达,并在脂肪体及卵巢中高表达。双酶切后的重组克隆载体可成功亚克隆到p Czn1载体上,IPTG可成功诱导p Czn1-Al E75D重组质粒特异性表达一个约75 k D的蛋白。用Ni-NTA琼脂糖树脂凝胶纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白为抗原,获得了一株能稳定传代并分泌抗Al E75D蛋白单克隆抗体的细胞株,该单克隆抗体可与绿盲蝽总蛋白及Al E75D重组蛋白特异性结合。【结论】Al E75D在绿盲蝽体内的表达谱表现出发育阶段特异性和组织特异性;本研究获得的其重组蛋白的单克隆抗体具有高特异性。结果为进一步在蛋白水平上分析该基因的功能奠定基础。     

一种重组人α1型干扰素突变体IFN-α1/86D的纯化与鉴定

本文研究了重组人α1型干扰素突变体IFN-α1/86D在摇瓶培养和分批发酵培养的重组大肠杆菌DH5α株中的表达动态,并采用阳离子交换层析和抗α1型干扰素单克隆抗体亲和层析的两步流程对其进行了纯化,得到SDS-PAGE纯及高效液相层析(HPLC)纯的IFN-α1/86D产品,共比活性为2.3×10~7单位/毫克蛋白。N端氨基酸序列测定的结果表明,纯化产品的纯度在95％以上,但其N端不均一,产品中含有两种N端序列正确的IFN-α1/86D活性分子,即约75％为去Met分子和约25％为带Met分子。     

花生△12脂肪酸脱氢酶基因高效表达载体构建与原核表达

花生是世界范围内广泛种植的重要油料作物之一,其种子中富含油酸和亚油酸。△^12脂肪酸脱氢酶（FAD2）是亚油酸合成的关键酶,催化油酸（18：1）在△^12位上脱氢生成亚油酸（18：2）,但由于△^12脂肪酸脱氢酶本身的特性,目前还没有有效的方法将其纯化并在蛋白水平作进一步的研究,尚需对其结构和功能之间以及表达调控进行更深入全面的研究。本文利用从花生中克隆的△^12脂肪酸脱氢酶基因（GenBank接受号为AY1006）构建高效表达载体,把花生△^12脂肪酸脱氢酶基因全长序列插入到大肠杆菌高效表达载体pRSETB中,构建了pRSET／HO-A融合表达载体,并转化到大肠杆菌表达菌BL21（DE3）pLysS中,在IPTG诱导下,pRSET／HO-A融合表达载体在BL21（DE3）pLysS菌株中高效表达了△^12脂肪酸脱氢酶。利用Clon-Tech蛋白纯化Kit进一步分离了目的蛋白,同时加入外源性底物油酸在20℃温育6h后,进行脂肪酸甲酯化处理,通过气相色谱（GC）和气相色谱,质谱（GC-MS）分析表明,所编码的酶具有△^12脂肪酸脱氢酶的活性,能将外源性的底物油酸转化为亚油酸,转化率为11．8％。花生△^12脂肪酸脱氢酶基因的原核表达目前国内外还未见报导,本实验为其进一步的大量纯化和结构功能分析奠定了基础。     

口蹄疫病毒3D基因的克隆表达及功能分析

利用RT-PCR技术扩增了口蹄疫病毒(FMDV)编码RNA依赖的RNA聚合酶的3D基因,并将其克隆到原核表达质粒载体pET-28a(+)中.3D基因经测序确认后在大肠杆菌BL-21中表达,表达产物纯化的目的蛋白进行Western-blotting检测,获得分子量约55KDa的单一3D基因表达产物.利用RNA体外复制体系和荧光定量PCR技术,证明纯化的3D基因表达产物RNA依赖的RNA聚合酶具有较高的酶活性,可以在体外从头合成FMDV RNA,且主要以引物依赖的方式合成病毒基因组.     

辣椒乙烯转录因子CaERF18的分离与诱导表达

旨在明确辣椒(Capsicum annuum L.HDA149)与南方根结线虫(Meloidogyne incognita)不亲和互作过程中相关特异性ERF类型转录因子的候选基因及其表达模式。应用RT-PCR方法,从南方根结线虫诱导的辣椒中分离到一个694 bp cDNA序列的乙烯(ERF)转录因子基因核心序列,命名为CaERF18,编码231个氨基酸,含有一个保守的由59个氨基酸构成的ERF结构域,与NtERF118、SlERF4和SlERF19 AP2结构域的相似性分别为44.3%、42.6%和39.3%。表达分析表明,南方根结线虫侵染可显著诱导CaERF18的表达,接种线虫后12h相对表达量开始升高,12 h升高3.8倍,72 h升高7.2倍。结果表明,CaERF18是一受病原物诱导表达的基因,推测CaERF18在介导辣椒对根结线虫的抗性作用中可能具有重要的调控功能。     

番茄SlMYB86基因的原核表达及缺氮胁迫下的表达分析北大核心CSCD

MYB转录因子参与植物细胞形态与模式建成、次级代谢的调控以及生物和非生物胁迫应答等反应。该研究采用RT-PCR方法扩增了番茄SlMYB86基因,并进行了聚类分析和保守域序列分析,构建原核表达载体和诱导纯化蛋白,利用qRT-PCR和Western blot检测SlMYB86在缺氮复氮下的表达水平,为深入探究番茄MYB86转录因子在缺氮胁迫下的功能奠定基础。结果表明:(1)番茄SlMYB86与番茄SlMYB26在进化树上属于同一分支,亲缘关系较近,且SlMYB86含有2个Myb_DNA-binding保守结构域,属于R2R3-MYB型转录因子。(2)qRT-PCR分析发现,SlMYB86基因在番茄根和叶中均有表达,缺氮胁迫下SlMYB86表达较对照显著增加。(3)成功构建pET-28a-SlMYB86原核表达载体并转化E.coli BL21(DE3),SDS-PAGE和Western blot结果表明,SlMYB86蛋白的最佳诱导条件为0.5 mmol/L的IPTG、37℃诱导8 h;目的蛋白相对分子量大约为41 kD,与预期大小一致,并获得较高纯度的SlMYB86原核蛋白。(4)将纯化的SlMYB86蛋白免疫小白鼠获得抗体,利用该抗体进行Western blot分析发现,番茄中SlMYB86蛋白在缺氮胁迫后表达上调,表明番茄SlMYB86基因参与了缺氮胁迫的应答。