贡蕉胚性悬浮细胞原生质体分离的研究

目的:研究不同方法对贡蕉胚性悬浮细胞原生质体分离的影响,筛选适合用于贡蕉胚性悬浮细胞原生质体分离的方案.方法:用不同的酶浓 度、酶组合及不同的酶解时间对贡蕉胚性悬浮细胞进行原生质体分离,并对不同继代时间的胚性悬浮细胞的原生质体产量和活力进行研究.结果:贡蕉胚性悬浮细胞 在酶组合为3.5%纤维素酶R-10、1%离析酶R-10和0.15%果胶酶Y-23的酶溶液中,酶解8h可获 得高产量的原生质体,采用继代7d的贡蕉胚性悬浮细胞进行原生质体分离时获得的原生质体产量最高,达到1.2×107个/mL PCV ECS,原生质体活力达到85%以上.结论: 合适的酶组合、酶浓度和酶解时间有利于贡蕉胚性悬浮细胞的原生质体分离,继代7d 后的贡蕉胚性悬浮细胞最适合用于原生质体分离.     

茶树叶肉原生质体的分离与纯化

以茶树幼苗叶片为材料,分析了甘露醇浓度、不同酶液组合、酶解时间等因素对叶肉原生质体分离及2种高密度分离液对原生质体纯化的影响。结果表明,叶片在含0.6 mol/L的甘露醇、1.5%的纤维素酶和2.5%的离析酶的酶解液中黑暗酶解16~18 h,叶肉原生质体的分离效果最好。此外,研究发现原生质体在10%的甘露醇与25%的碘克沙醇界面处聚集形成了一条带。     

竹黄菌原生质体的制备与再生分析

为了提高竹黄菌(Shiraia bambusicola P.Hennings)中原生质体用于遗传转化时的转化效率,研究竹黄菌原生质体制备及再生的最佳条件,建立竹黄菌原生质体的高效遗传转化体系。本研究以竹黄菌为材料,采用正交试验分析方法,对影响竹黄菌原生质体制备及再生的主要因素,不同酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂及菌龄、不同再生培养基等进行了系统的研究。结果表明,以0.6 mol/L Na Cl为稳渗剂,用组合酶(质量分数1%裂解酶和质量分数1.5%崩溃酶按4:6体积比混合)在33℃条件下对菌龄为6 d的菌丝体酶解2 h,原生质体产量最高,达到10.57×10~6个/m L;以0.6 mol/L蔗糖为稳渗剂,用组合酶(质量分数1%裂解酶和质量分数1.5%崩溃酶按4:6体积比混合)在29℃条件下对菌龄为4 d的菌丝体酶解2 h,原生质体再生率最高,为0.293%;最适合竹黄菌原生质体再生的培养基是TB3再生培养基。     

辣椒子叶原生质体分离条件的研究

以不同基因型的辣椒子叶为供体组织进行辣椒原生质体分离条件的研究,结果表明：幼龄子叶的原生质体产量与活力均高于老龄子叶;酶解过程中酶液渗透压、酶液浓度、酶解时间均对原生质体分离效果产生重要影响。对于辣椒子叶原生质体,最佳分离条件为酶液甘露醇浓度０．５ｍｏｌ／Ｌ,纤维素酶Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｏｎｚｕｋａ Ｒ－１０ １．５,果胶酶Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ Ｒ－１０ ０．６％,酶解时间８－１０ｈ。不同基因型辣     

扩展青霉原生质体的形成、再生及其影响因素

本文比较了不同酶解温度、酶解pH、菌体浓度、过滤介质、氨基酸和菌体预处理方法等因素对扩展青霉(Penicllium expansun)原生质体形成再生的影响,研究了原生质体对紫外光的敏感性以及贮存和再生活性。采用0.5％纤维素酶加0.5％蜗牛酶,对用振荡培养23小时的菌丝体经30℃保温1小时酶解,可以得到4.7×10~5/ml的原生质体悬液,原生质体再生率可达30％左右。原生质体的平均体积为207μ~3。     

姬松茸原生质体形成和再生的研究

报道了溶壁酶系统、酶浓度、不同菌龄、脱壁促进剂、渗透压稳定剂和酶解温度对姬松茸原生质体释放率及不同再生培养基、渗稳剂种类、菌丝酶解时间和单双层平板对原生质体再生的影响。结果表明 ,菌龄为3～ 5d的菌丝以 1.5 %溶壁酶、0 .5 %蜗牛酶和 0 .5 %纤维素酶组成的酶系统在 30℃以KCl为渗透压稳定剂时 ,形成率为 1.4～ 1.5ⅹ 10 7/mL酶液 ;以蔗糖为渗透压稳定剂 ,菌丝酶解 1.5～ 3h ,以SMY和MYP为再生培养基 ,姬松茸原生质体再生率为 1.1‰～ 1.3‰。     

韦兰胶合成菌的原生质体制备与再生研究

旨在研究EDTA预处理、菌龄、酶解浓度、酶解温度及酶解时间对Sphingomonas sp.ATCC 31555原生质体制备与再生的影响。结果表明,菌龄10 h,12 mmol/L EDTA预处理,溶菌酶浓度45μg/mL、酶解温度28℃、酶解时间25 min。得到原生质体的形成率达97.3%,再生率达33.9%。研究结果为菌株进行原生质体融合、基因组改组等选育优良菌种提供参考。     

不同因素对金针菇原生质体制备和再生的影响

比较了不同浓度裂解酶及组合、渗透压稳定剂、酶解时间等因素对金针菇原生质体得率的影响以及不同渗透压稳定剂、培养基、接种方法等因素对金针菇原生质体再生的影响。试验结果表明:固体培养10d的金针菇菌丝,以0.5mol/L KCl作渗透压稳定剂,加入1%纤维素酶和1%溶菌酶在25℃下酶解1.5h,分离原生质体效果最佳,原生质体产量可达27.8×105个/ml以上;以0.5mol/L KCl作渗透压稳定剂,在25℃条件下,金针菇原生质体采用直接涂布法接种在RCM培养基上培养,再生率最高为0.5%。     

'过山香'香蕉胚性悬浮细胞原生质体分离的方法研究

目的:研究不同的方法对‘过山香'胚性悬浮细胞原生质体分离的影响,筛选最适合用于‘过山香'香蕉胚性悬浮细胞原生质体分离的方案.方法:用不同浓度、不同组合的酶液对‘过山香'原生质体进行分离,并对酶液的甘露醇含量、pH值进行调节.结果:3.0%纤维素酶R-10+0.2%果胶酶Y-23的是最佳酶组合;酶解8 h、酶液中含0.41 M甘露醇、酶液pH值为5.3时,获得原生质体产量最高.结论:合适的酶组合、酶解时间、酶液的渗透压和pH值对‘过山香'香蕉胚性悬浮细胞原生质体的分离有明显的促进作用.     

黑曲霉原生质体形成与纯化的研究

研究了黑曲霉菌丝原生质体形成的条件,讨论了培菌方式,菌龄,酶系统,酶解温度,酶解时间及渗透压稳定剂对原生质体形成的影响,结果表明,采用１．５％纤维素酶,以ＮａＣｌ为渗透压稳定剂酶解菌丝体,可获得大量原生质体,并对原生质体纯化的两种方式作了比较,同时对原生质体的释放进行了观察。     

‘过山香’香蕉胚性悬浮细胞原生质体分离的方法研究

目的：研究不同的方法对‘过山香’胚性悬浮细胞原生质体分离的影响,筛选最适合用于‘过山香’香蕉胚性悬浮细胞原生质体分离的方案。方法：用不同浓度、不同组合的酶液对‘过山香’原生质体进行分离,并对酶液的甘露醇含量、pH值进行调节。结果：3．0％纤维素酶R-10＋0．2％果胶酶Y-23的是最佳酶组合;酶解8h、酶液中含0．41M甘露醇、酶液pH值为5．3时,获得原生质体产量最高。结论：合适的酶组合、酶解时间、酶液的渗透压和pH值对‘过山香’香蕉胚性悬浮细胞原生质体的分离有明显的促进作用。     

小花棘豆Embellisia内生真菌原生质体的制备与再生研究

旨在获得数目多且活力高的小花棘豆Embellisia内生真菌的原生质体,分析和探讨该内生真菌原生质体制备与再生的最佳条件,为后续外源基因转化奠定基础。利用酶解法对制备小花棘豆Embellisia内生真菌菌丝的原生质体,研究酶解液成分、p H、温度、渗透压稳定剂、酶解时间及菌龄对原生质体制备和再生的影响;原生质体在TB3培养基上再生后,研究酶解时间对原生质体再生的影响。结果显示,2.5%(W/V)lysing enzymes、2%(W/V)纤维素酶和3%(W/V)蜗牛酶3种混合酶处理,菌龄为10 d,当酶解温度为30℃、p H5.8、1.2 mol/L Mg SO4为渗透压稳定剂,在80 r/min水平摇床酶解8 h时,原生质体浓度较高,达4.42×105个/m L;酶解时间6 h时再生率最高,达46.7%。     

疏绵状嗜热丝孢菌原生质体的制备与再生

以疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)为供试菌株,研究了菌龄、酶的种类及浓度、酶解时间、酶解温度和稳渗剂对原生质体制备的影响及稳渗剂对原生质体再生的影响。结果表明,制备嗜热丝孢菌原生质体比较适宜的条件为:PDB液体培养基培养28 h,以0.7 mol/L NaCl为稳渗剂,0.15 mol/L的溶壁酶,30℃酶解4 h。原生质体再生以0.7 mol/L蔗糖作稳渗剂为最佳。     

梭梭原生质体快速制备方法的建立及其在亚细胞定位中的应用

梭梭是中国西北荒漠半荒漠地区防沙治沙首选建群树种。目前梭梭蛋白亚细胞定位采用洋葱表层细胞以及鹰嘴豆和拟南芥原生质体等进行,但采用不同体系进行亚细胞定位,可能会出现不同结果,这与同源或异源表达的植物细胞特性有关。因此,梭梭蛋白采用其原生质体进行亚细胞定位结果更真实可信。通过对酶种类及配比、质壁分离时间、酶解液pH、酶解时间等的优化,本研究拟建立梭梭原生质体快速制备方法,并探讨其在亚细胞定位中的应用。结果表明:以2～3 cm长的幼嫩同化枝,置于pH值5.6的CPW酶解液(10%甘露醇, 0.1%MES, 1.0%纤维素酶, 0.4%离析酶)中,黑暗条件下27℃恒温水浴45 r/min酶解10～11 h,为梭梭原生质体快速制备最佳条件,原生质体产量可达0.41×10~7个/g·FW,存活率为70.32%;所得原生质体应用于亚细胞定位研究效果良好。本制备方法可应用于梭梭原生质体培养、细胞研究、基因瞬时表达等领域。     

拟南芥叶肉原生质体分离条件的优化研究

以野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana,ecotype Columbia)无菌苗为材料,研究了叶肉原生质体分离过程中的预处理条件、酶解方式、酶解温度和离心力大小等因素对产量和活力的影响.结果表明,酶解方式和酶解温度对原生质体产量影响显著,28℃静置酶解14 h能够将原生质体产量提高6.32倍.低温预处理和离心力大小对原生质体活力影响显著,4℃低温预处理24 h能够将原生质体活力提高55%.适宜拟南芥原生质体叶肉细胞分离的最佳条件为:4℃低温预处理24 h,28℃静置酶解14 h,600 r·min-1离心3次,每次10 min,得到的原生质体产量为2.91×106个·g-1,活力为84.03%.     

银耳原生质体分离与再生条件优化研究*

应用正交设计,研究不同菌株(Tr01、Tr21)、材料(芽孢、菌丝体、子实体)、溶壁酶浓度和酶解温度对原生质体产量的影响。实验结果表明,实验材料对原生质体产量影响最大,以芽孢为材料原生质体产量可达到2.75×107个/ml,而菌丝体和子实体的原生质体产量仅为2.5×106个/ml 和1.0×106个/ml;在35℃下酶解,原生质体产量高;溶壁酶浓度在1%~3%范围内对原生质体产量影响不大;不同菌株原生质体产量差异不显著。本实验还研究了稳渗剂浓度对原生质体再生率的影响,结果表明,0.5 mol/L~0.7 mol/L的KCl 对原生质体再生没有显著差异,再生率最高可达32.3%。     

金针菇原生质体分离制备、融合、再生及融合子检出

探讨了利用金针菇菌丝体分离、制备原生质体;不同的酶浓度和酶解时间对原生质体得率的影响;以及八种再生培养基的选择性试验.建立了金针菇原生质体的分离、制备、融合及再生的试验体系.试验共获得209株再生菌株,通过核染色检测,共获得37株具有双核和锁状联合的再生株.     

小麦全蚀病菌原生质体制备的条件及再生菌株的致病性

分别利用崩溃酶、溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶酶解小麦全蚀病菌,进行原生质体的制备试验。结果显示,4种酶均能消化该菌细胞壁,获得一定数量的原生质体;产生原生质体效率最高的是溶壁酶,该酶在浓度为16 mg/mL时产生的原生质体数量最多,最佳的酶解时间为2~3 h,最适作用温度为28℃。制备的原生质体可以再生并与原始出发菌株具有相同的致病能力。     

黄绿木霉原生质体诱变育种研究

利用正交实验方法研究了影响黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)原生质体形成的因素,并利用紫外线、硫酸二乙酯、氯化锂几种因素复合诱变原生质体筛选高产纤维素酶菌株。影响原生质体形成的因子顺序是酶系统>菌龄>酶解时间>酶解温度,原生质体形成的最佳条件是0.5%蜗牛酶 0.5%溶菌酶 1.0%纤维素酶,菌龄为18h,酶解时间为3.0h,酶解温度为32℃;在该条件下原生质体产量可达到4.25×106个mL-1。Ca2 和PEG对提高原生质体再生率的作用明显;复合诱变后得到酶活显著提高、遗传性能稳定的诱变株T-14,其EG酶活与BG酶活分别提高了58.43%、44.48%。     

光果甘草原生质体分离条件优化

目的:探索光果甘草原生质体分离的最佳条件。方法:对光果甘草原生质体分离的若干影响因子,包括材料来源、酶液组成、酶解方式、酶解时间、渗透压、预处理方式进行考察,以确定最佳的原生质体分离条件。结果:光果甘草原生质体分离的最佳条件为:以生长7 d光果甘草无菌苗的子叶作为分离材料,4℃、MS培养基上预培养12 h,以1.5%纤维素酶+0.5%果胶酶作为分离原生质体酶液体系,以含有0.7 mol/L甘露醇作为渗透保护剂的CPW溶液配制酶液,于25℃静置条件下酶解14 h。结论:采用本实验所确定的光果甘草原生质体最佳分离条件可获得大量优质的原生质体,为后续细胞融合及遗传转化等实验奠定了良好的基础。