一个源于皮革肾岛衣地衣型真菌中的HR-PKS基因克隆与鉴定

本研究通过对皮革肾岛衣(Nephrmopsis pallescens)地衣型真菌转录组数据的分析,首次克隆得到一种高度还原型聚酮合酶(Highly reducing PKS)基因全长,并对该基因进行生物信息学分析,并检测该基因在不同培养基上的表达量。该基因cDNA全长7 491 bp (命名为NpPKS1),可编码2 496个氨基酸,是一种稳定存在于细胞质基质中的非分泌蛋白;结构域与其他真菌的洛伐他汀九酮合成酶(LNKS)结构域极为相似,且聚类分析与其他真菌的洛伐他汀九酮合成酶(LNKS)聚为一类;在以葡萄糖和麦芽糖作为碳源的情况下,番茄浸粉、牛肉浸粉、酪蛋白胨等作为氮源可强烈刺激NpPKS1基因的表达,而胰蛋白胨对该基因的表达存在一定程度的抑制效应。本研究为皮革肾岛衣地衣型真菌中的基因资源利用、聚酮化合物异源表达和其合成机制的研究奠定了基础。     

植物Ⅲ型聚酮合酶基因家族的分子进化分析

Ⅲ型聚酮合酶(type Ⅲ polyketide synthase,PKSⅢ)广泛存在于细菌、真菌和植物中,目前数据库中已积累了大量的序列资料。为了进一步了解植物Ⅲ型聚酮合酶基因家族的分子进化,以及其作为系统进化研究材料的可能性,选取了75条来自不同植物物种包括苔藓类植物、蕨类植物、裸子植物、单子叶植物和双子叶植物的PKSⅢ蛋白序列,用CLUSTAL X软件对其氨基酸序列进行了比对,并用邻位相接法构建了系统进化树。结果表明,尽管不同来源的PKSⅢ序列表现了很大的差异,但保守结构域CHS-like所包含的主要功能位点半胱氨酸(Cys184)、苯丙氨酸残基(Phe236和Phe286)、组氨酸残基(His335)、天冬酰氨残基(Asn369)在各植物物种中具有很好的保守性;同时发现,在植物PKSⅢ序列中多数的Cys位点均具有较好的保守性,而且蕨类植物PKSⅢ和单子叶植物PKSⅢ在Cys保守位点有很好的相似性;进一步构建分子进化树表明,PKSⅢ基因基本上首先根据功能而聚类,明显地划分为CHSs和non-CHSs两类,其次按照不同的植物物种聚类。     

真菌聚酮合酶基因分离方法的研究进展

真菌聚酮合酶在代谢中可催化合成多种具有重要生物学活性的次级代谢物,所以真菌聚酮合酶正逐渐成为药学、食品科学和农学等领域的研究热点。本文综述了近五年来建立的几种分离真菌聚酮合酶基因的方法。这些方法解决了真菌中聚酮合酶基因簇难以分离的问题,为改造和利用真菌聚酮合酶以及发掘真菌聚酮化合物资源提供了强有力的手段。     

虎杖中一种新的2-吡喃酮合酶基因的克隆和功能研究

4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮(2-吡喃酮)及其衍生物是一类重要的植物次生代谢产物,具有抗虫、抗真菌等功能,在工业上可用于生产可再生化学平台间苯三酚和1,3,5-三氨基-2,4,6-三硝基苯. 2-吡喃酮合酶(2PS),一种Ⅲ型聚酮合酶(PKSs),是合成2-吡喃酮的关键酶.本研究以中药材虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc)为材料,从中分离鉴定了一种新的2-吡喃酮合酶(Pc2PS). Pc2PS与已知的几种2PSs的氨基酸序列相似性为54%～56%.通过体外酶促反应鉴定功能发现,Pc2PS可以催化1分子乙酰-CoA与2分子丙二酰-CoA,缩合生成4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮;也可以只利用3分子丙二酰-CoA,以相同的效率缩合生成2-吡喃酮.由此可以看出,乙酰-CoA存在与否并不影响该酶的催化效率.随后,我们测定了Pc2PS以丙二酰-CoA为单一底物时的酶动力学参数.虽然之前报道的2PSs也可以只利用丙二酰-CoA生成2-吡喃酮,但与Pc2PS不同的是,乙酰-CoA的缺失会大大降低催化效率.另外,对Pc2PS基因的组织表达特异性检测结果表明,该基因主要在虎杖根中表达,在叶中的表达量很低.本研究丰富了2PS的种类,并为2-吡喃酮的生物合成提供了基因资源.     

基于定点突变的植物Ⅲ型聚酮合酶结构与功能研究进展

植物Ⅲ型聚酮合酶(Polyketide synthases,PKSs)催化形成一系列结构迥异、生理活性不同的聚酮类化合物的基本骨架结构,是聚酮类化合物生物合成途径的关键酶。目前已从植物中克隆和鉴定了多种功能不同的Ⅲ型PKSs。定点突变技术是研究蛋白质结构与功能之间复杂关系的重要方法。文中综述了近年来基于定点突变的植物Ⅲ型PKSs结构与功能关系的研究进展,包括利用定点突变技术修饰各种可能影响植物Ⅲ型PKSs结构的氨基酸残基,来研究其对功能的影响(如控制起始底物的特异性、缩合反应次数以及中间产物环化方式),以期为植物Ⅲ型PKSs结构与功能关系的研究提供参考。     

顺式和反式-AT型聚酮合酶研究进展及应用

聚酮类化合物因广泛应用于医药等方面而被大家所熟知,Ⅰ型聚酮合酶（Polyketide Synthase,PKS）在催化聚酮类化合物的生物合成中起着重要的作用。根据不同的酰基转移酶（Acyltransferase,AT）结构域,I型PKS可分为顺式-AT （cis-Acyltransferase,cis-AT）型PKS和反式-AT （trans-Acyltransferase,trans-AT）型PKS,目前cis-AT型PKS研究得比较透彻,trans-AT型PKS相关研究成为当今热点。本文总结了cis-AT型PKS和trans-AT型PKS的联系与区别、工程进展、相关应用以及目前存在的问题,以期为了解cis-AT型PKS和trans-AT型PKS在聚酮化合物合成中的作用提供参考。     

植物类型Ⅲ聚酮合酶超家族基因结构、功能及代谢产物

植物聚酮类化合物主要包括酚类、芪类及类黄酮化合物等,在植物花色、防止紫外线伤害、预防病原菌、昆虫危害以及作为植物与环境互作信号分子方面行使着重要的生物学功能。该类化合物具有显著多样的生物学活性,对人体保健及疾病治疗有显著意义。植物类型Ⅲ聚酮化合物合酶(PKS)在该类化合物生物合成起始反应中行使着关键作用,决定该类化合物基本分子骨架建成和代谢途径碳硫走向,为合成途径关键酶和限速酶。以查尔酮合酶为原型酶的植物类型Ⅲ PKS超家族是研究系统进化和蛋白结构与功能关系的模式分子家族,目前已经分离得到14种植物类型Ⅲ PKS基因,这些同祖同源基因及其表达产物既有共性,也表现出许多独特个性,这些个性赋予此类次生代谢产物结构上的多样性。以下综述了植物类型Ⅲ PKS超家族基因结构、功能及代谢产物研究进展。     

利用Ⅲ型聚酮合酶CsyB起始单元的底物多样性体内合成csypyrone类化合物

作为新型Ⅲ型聚酮合酶,米曲霉来源的CsyB能够依次接受一个起始单元为短链脂肪酰辅酶A、一个延伸单元为丙二酰辅酶A和另一个延伸单元为乙酰乙酰辅酶A的3个底物形成短链的csypyrone B1-3。基于CsyB的晶体结构分析,显示它的活性中心存在一个长约16?的能够接受脂肪酰辅酶A结合通道,这个通道很可能能够接受多种底物。为了检测该酶的底物多样性,将CsyB基因导入到存在长链脂肪酰辅酶A前体的大肠杆菌中表达。高效液相结果显示,相比对照菌株,重组菌株产生了一系列长链的csypyrone衍生物。利用紫外可见光特征吸收值和高分辨液相色谱-质谱联用仪对这些新产物作了初步分析。对3个具有羟基的csypyrone产物的结构进行了核磁共振一维谱和二维谱的详细鉴定,确定了其羟基的位置。上述结果显示,CsyB具有广泛的底物特异性,不但可以接受多种长链饱和或不饱和脂肪酰辅酶A,还可以接受具有羟基修饰的长链脂肪酰辅酶A作为底物。     

长松萝中一个聚酮合酶基因簇的克隆和鉴定

【目的】探索药用地衣长松萝(Usnea longissima Ach)聚酮化合物的生物合成基因簇,克隆聚酮合酶(PKS)基因并分析其功能。【方法】以长松萝地衣型真菌为材料,通过巢氏PCR获得聚酮合酶基因片段和原位杂交筛选基因组文库获得聚酮合酶基因及相邻基因簇。并对获得聚酮合酶进行分子系统进化分析和基因表达分析。【结果】获得药用地衣长松萝中的编码聚酮合酶基因UlPKS5的全长序列以及相邻修饰基因β-内酰胺酶和脱水酶。聚酮合酶UlPKS5含有酮体合成酶(KS),酰基转移酶(AT),产物模板(PT)以及酰基载体蛋白(ACP)结构域。分子系统进化分析显示UlPKS5属于非还原型聚酮合酶中第五组,与蒽醌类化合物生物合成相关。通过半定量RT-PCR分析表明山梨醇(10%)和蔗糖(2%和10%)能够强烈诱导UlPKS5基因表达。【结论】聚酮合酶(UlPKS5)及相邻修饰基因β-内酰胺酶和脱水酶与长松萝中蒽醌类化合物生物合成相关。     

草菇聚酮合酶编码基因vv-alb的克隆及其表达的初步分析

聚酮化合物（polyketides）是一类庞大的次级代谢家族,聚酮合酶（polyketide synthase,PKS）是介导聚酮化合物生物合成的关键酶。通过巢氏简并PCR与染色体步行的方法,获得了草菇中的编码PKS的基因vv-alb的全长序列,并通过荧光实时定量RT-PCR方法对vv-alb基因在草菇不同生长阶段与不同部位的表达情况进行了初步分析,为进一步研究PKS在草菇和其他食用真菌生物代谢过程中的作用奠定了一定的基础。     

植物Ⅲ型聚酮合酶的分子机制与应用前景

植物III型聚酮合酶能催化生成一系列结构各异、具有不同生理活性、包含查耳酮合酶基本骨架的植物次生代谢产物,这类次生代谢产物不仅使植物体本身的抗逆性提高,并且对人类健康医疗有很好的应用前景。以下综述了近年来从植物中克隆、鉴定III型聚酮合酶的研究进展,着重论述了其分子结构、催化反应的类型和机制、表达调控及其在转基因工程方面的研究和应用前景。这些研究将为有效地对其进行基因改造,合成一些难以化学合成的新型天然化合物奠定基础,并且为将来进一步开展III型聚酮合酶的转基因工程提供了参考。     

利玛原甲藻中聚酮合酶基因克隆与分析

为探讨聚酮合酶 (polyketide synthase, PKS)基因与藻毒素合成的关系,揭示PKS基因在赤潮毒素合成中的作用,采用兼并引物,通过PCR技术获得利玛原甲藻(Prorocentrum lima)可能存在的I型PKS基因;并对所获得PKS基因的同源性进行了分析,构建了基于PKS氨基酸序列的系统进化树;采用RT-PCR技术分析了PKS基因在利玛原甲藻中的表达状况;并通过多聚腺苷酸RNA的扩增、细菌的分离鉴定、限制性内切酶酶切、Southern blotting等技术对PKS基因进行了分析.结果表明,利玛原甲藻中PKS基因与海洋原甲藻聚为一支,在利玛原甲藻中有显著表达;以Oligo(T)引物进行RT-PCR扩增时,可出现18S rRNA和PKS基因相应条带;限制性内切酶酶切和Southern blotting结果显示,该基因中存在明显的甲基化;16S rRNA基因序列分析显示,从利玛原甲藻培养液中分离到的细菌与海洋放线菌假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)基因序列同源性达到99%,该菌株中并不存在PKS基因.结果显示,所获得的PKS基因是利玛原甲藻聚酮合酶基因,基因序列已提交GenBank (EF521601);PKS可能在腹泻性贝毒合成中起着关键作用.     

苦荞查尔酮合酶基因FtCHS1启动子的克隆及分析

采用染色体步移技术,从苦荞（Fagopyrum tataricum Gaertn.）中克隆获得FtCHS1基因5'端侧翼序列,共1038 bp,将其命名为P_FtCHS1。生物信息学分析表明,P_FtCHS1中A/T碱基含量为63.5%,含有4个可能的转录起始位点,分别位于起始密码子上游-684~-734、-692~-742、-920~-970、-929~-979 bp处,该序列包含TATA-Box和CAAT-Box等启动子核心元件以及与光、低温和激素应答等相关的功能元件。本研究进一步构建了P_FtCHS1-pBI101植物表达载体,并瞬时转化拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）叶片,结果显示该序列可驱动GUS报告基因的表达。低温（4℃）和光照（UV-B）处理苦荞幼芽后,采用荧光定量PCR技术分析FtCHS1基因的表达量,结果表明P_FtCHS1可响应低温和紫外环境胁迫,从而引起FtCHS1基因表达量发生变化。     

放线菌模块型聚酮合酶的系统发育组学分析及其在聚酮类化合物筛选中的应用

【目的】通过分析模块型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)的系统进化关系,阐明酮基合成酶(ketosynthase,KS)和酰基转移酶(acyltransferase,AT)序列与聚酮产物之间的关系,为放线菌天然产物的筛选提供指导。【方法】从PKSDB数据库的20个模块型PKS基因簇中调取所有KS(190个)和AT(195个)氨基酸序列,利用MEGA 4.0软件分别构建KS、AT、KS+AT 3种序列模式的系统发育树,并计算KS序列的簇内和簇间平均进化距离。设计了一对KS结构域的引物,通过PCR方法对20株活性放线菌分离菌株进行了筛选,测定了阳性菌株的KS序列,和已知的相关KS序列构建系统发育树,并对阳性菌株进行了发酵培养和代谢产物分析。【结果】放线菌来源的同一PKS的KS序列倾向于聚成一个进化枝,且按照其产物结构聚类;同一PKS的KS簇内平均进化距离小于0.300,不同PKS的KS簇间平均进化距离一般大于0.300。AT系统发育树按照其底物特异性聚成两个大的分枝;同一PKS的部分AT分别处于两个分枝,其余AT散在分布。KS+AT系统发育树则综合了KS树和AT树的拓扑结构特点。获得13株KS阳性分离菌株,它们的多数KS序列按照菌株分别聚类,其中4株菌的大部分KS各自聚成独特的簇,5株菌的大部分KS分别处在已知PKS进化枝内。从3株阳性菌中分离到预期的聚酮类产物。【结论】放线菌中KS的进化方式以垂直进化为主,而AT则以水平进化为主;KS序列与产物结构相关,且KS簇间平均进化距离可作为不同PKS的判定标准;相对于AT和KS+AT,KS系统发育组学分析更适用于指导放线菌聚酮类产物的筛选。     

红色红曲菌M7中色素聚酮合酶基因敲除突变体的鉴定

摘要:【目的】研究红色红曲菌(Monascus ruber) M7中控制红曲色素合成的聚酮合酶基因(pksPT)的功能。【方法】对M7 中pksPT进行了生物信息学分析;借助农杆菌介导的红曲菌转化技术敲除M7中pksPT,获得pksPT缺失突变体(ΔpksPT),比较M7和ΔpksPT菌落形态、产孢能力、生长速度、色素和桔霉素产量的差异。【结果】pksPT全长8687 bp,编码蛋白含有2690个氨基酸,属于非还原Ⅲ型聚酮合酶,包括β-酮酯酰基合成酶(KS)、酰基载体蛋白(ACP)、酰基转移酶(AT)和甲基转移酶(ME)四种结构域,组合形式为KS-AT-ACPACP-ME。ΔpksPT的分析结果显示,pksPT的敲除不影响其产分生孢子和闭囊壳的能力;ΔpksPT不能产生任何一种红曲色素;其生长速度明显快于野生菌株M7;桔霉素产量较M7 提高了2.8倍。【结论】pksPT是M7中控制红曲色素合成的关键基因,红曲色素的合成显著影响红曲菌产桔霉素能力和生长速度。     

红汁乳菇中一个聚酮合酶基因的鉴定和表达分析

聚酮化合物具有丰富的生物活性,为了解红汁乳菇(Lactarius hatsudake)中聚酮合酶基因,从红汁乳菇基因组中分离并克隆得到LhPKS1基因,通过生物信息学分析推测其功能,并通过RT-PCR验证该基因的表达量。结果显示,LhPKS1基因全长cDNA含有6 036 bp,编码2 011个氨基酸残基,结构域顺序依次为SAT-KS-AT-PT-ACP-TE,该蛋白无跨膜结构和信号肽,聚类分析显示LhPKS1蛋白与参与生物合成苔色酸的真菌PKS蛋白聚为一支。在以10%肌醇、2%和10%的山梨醇为碳源添加物及以番茄浸粉为氮源添加物时,该基因表达量较高。研究有助于通过LhPKS1基因的过表达及异源表达,为大量获取苔色酸类化合物及其骨架提供参考。     

聚酮化合物β-酮酰-ACP合酶的计算机对比分析与组合生物合成

为了合理地设计新的聚酮化合物提高组合生物合成的效率,本文使用ClustalW、Mega4.0分析了26种来自不同聚酮合酶的β-酮酰-ACP合酶结构域的序列特征,并用ProtParam、Phdsec、Swiss-Model等工具对其中9种具有不同底物专一性的β-酮酰-ACP合酶的一级结构、二级结构和三级结构及活性位点进行了分析与预测。发现它们结构上的相似性大于序列上的相似性;活性位点都富含丝氨酸;底物含有2个羧酸基团的β-酮酰-ACP合酶的理论pI均小于5.0且其形式电荷总量也偏低;序列V303ELHGTGTPLGDPIEAGA320是这26种β-酮酰-ACP合酶的一段保守序列,但它并不与活性位点相邻。这些研究对进行聚酮合酶的模块或结构域替换以及定点突变具有重要的指导意义,也为探讨其的进化机制提供了参考。     

红霉素链霉菌聚酮合成酶基因eryA Ⅲ的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:在大肠杆菌中异源表达红霉素链霉菌聚酮合成酶eryA Ⅲ基因.方法:构建表达载体pET-m28a,PCR扩增高GC含量长片段基因eryA Ⅲ及分子伴侣GroELS的基因,并插入该载体,每个基因都能够独立启动和终止表达;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达.结果:NdeⅠ、Hind Ⅲ分别酶切质粒pET-m28a/eryA Ⅲ-GroELS,琼脂糖凝胶电泳显示获得与预期大小相同的DNA片段;SDS-PAGE结果表明,重组大肠杆菌表达了由eryA Ⅲ编码的相对分子质量为348×103的蛋白;与GroELS共表达后,目的蛋白在上清中的表达量明显增加.结论:GroELS提高了eryA Ⅲ编码蛋白的可溶性,为红霉素合成通路在大肠杆菌中的重建奠定了基础.     

高原鼢鼠神经型一氧化氮合酶基因编码区序列克隆与分析

高原鼢鼠是青藏高原特有的地下鼠,受到高原低氧以及洞穴低氧的双重低氧环境压力。经RNA 提取、RT-PCR、亚克隆与测序,本研究获得高原鼢鼠神经型一氧化氮合酶(nNOS)的编码区序列,并对其分子特征进行了分析。结果显示:高原鼢鼠nNOS 基因编码区(CDS)全长4 290 bp,编码1 429 个氨基酸残基;CDS 与大鼠、小鼠、兔、狗、人的同源性分别为90% 、89% 、87% 、87% 、89% ;结构域上,高原鼢鼠nNOS 具有PDZ蛋白结构域、氧化域、还原域及钙调素结合位点等nNOSs 所具有的典型结构域;基于nNOS 的最大似然树和贝叶斯树均支持高原鼢鼠与大鼠、小鼠具有最近的亲缘关系,与形态或其它分子标记构建的进化关系相符;分子进化分析检测到高原鼢鼠nNOS 中存在3 个正选择位点---332 T、1200 G 和1334 P,但均未达到统计显著水平。本研究为揭示高原鼢鼠nNOS 的表达特征及其在低氧适应中的作用与调控机制研究奠定了初步基础。