人钙调素在大肠杆菌中的表达、纯化及其活性研究

利用基因重组技术,将经PCR扩增获得的人钙调素基因(hCaMcDNA)插入质粒pBV220,构建重组表达载体hCaM/pBV220,用酶切、DNA测序、PCR扩增鉴定阳性克隆.阳性重组子在大肠杆菌DH5α中经温度诱导可高效表达CaM蛋白,经15%SDS-PAGE分析,可观察到一与CaM分子量相符(约17kD)的诱导表达条带,其表达量占菌体蛋白总量20%,并主要以可溶性形式表达.Westernblot结果证实,17kD的表达条带可与标准鼠抗人CaM单克隆抗体起特异反应.用Pheny1-SepharoseCL-4B疏水亲和层析法纯化重组菌超声上清表达产物,每1L菌液可获CaM纯品3～4mg.重组人CaM(rhCaM)与牛脑CaM的氨基酸组成基本一致.生物活性测定结果提示,rhCaM具有激活NAD激酶的活性,其激活程度与标准人脑CaM几乎一致.     

钙调蛋白拮抗剂对人胃癌细胞效应机理的研究——钙调蛋白与磷酸二酯酶活性测定分析*

我们曾经证明钙调蛋白(Calmodulin,CaM)拮抗剂三氟拉嗪(Trifluoperazine,TFP)有抑制人胃癌细胞增殖和诱导细胞形态向正常分化的效应。本文用CaM活性测定箱方法测定了TFP处理的人胃癌MGC-803细胞胞质内的CaM活性。同时也测定了磷酸二酯酶(Phosphodiesterase.PDE)活性的变化。结果表明TFP选择性抑制胞质内依赖Ca~(2+)/CaM的PDE活性。氨茶碱有抑制CaM活化PDE的作用。本文对TFP作用机理及在调控癌细胞增殖及分化中的意义进行讨论。     

钙调蛋白拮抗剂对人胃癌细胞效应机理的研究——钙调蛋白与磷酸二酯酶活性测定分析

我们曾经证明钙调蛋白(Calmodulin,CaM)拮抗剂三氟拉嗪(Trifluoperazine,TFP)有抑制人胃癌细胞增殖和诱导细胞形态向正常分化的效应。本文用CaM活性测定箱方法测定了TFP处理的人胃癌MGC-803细胞胞质内的CaM活性。同时也测定了磷酸二酯酶(Phosphodiesterase.PDE)活性的变化。结果表明TFP选择性抑制胞质内依赖Ca²⁺/CaM的PDE活性。氨茶碱有抑制CaM活化PDE的作用。本文对TFP作用机理及在调控癌细胞增殖及分化中的意义进行讨论。     

钙调素对细胞周期的调节

RC3细胞是一种用真核表达载体1~(CaM)转染NIH 3T3细胞建成的可调钙凋素(Calmodulin,CaM)高表达细胞模型。通过分子杂交及蛋白免疫印迹方法证实在地塞米松(Dexamethasome,DXM)作用下,RC3细胞可高表达CaM。CaM的过表达使G_1期细胞减少,S期细胞增加;CaM拮抗剂三氟拉嗪(trifluoperazine,TFP)则使G_1期细胞增加,S期细胞减少。高表达CaM使细胞分裂指数提高,G_2期细胞减少,有丝分裂前期细胞增加,M中期细胞比例下降。而TFP处理则使分裂指数下降,G_2期细胞增加,M前期细胞减少,M中期细胞增加。实验结果表明CaM在G_1/S、G_2/M和M中期/M后期3个位点上对细胞周期进行调控;通过加速G_1至S期,G_2至M期和M中期至M后期的进程,使细胞倍增时间缩短,促进细胞增殖。本工作表明,RC3细胞作为CaM表达可调细胞模型,是研究细胞周期调控的有力工具。     

犬α干扰素基因的高效表达及其活性测定

以伴刀豆球蛋白A(ConA)诱导的犬外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板,通过RT PCR的方法克隆扩增出犬α干扰素基因,将所扩增基因克隆于原核表达载体pBV220 并进行测序,结果显示该基因与GenBank上所公布的犬α干扰素基因同源性为100%。将重组表达载体转入宿主菌进行温敏诱导表达,表达产物经SDS PAGE分析,证明目的蛋白以包涵体的形式存在,大小约为19kDa。将表达产物变性、复性、透析、纯化处理后加入犬肾细胞上,用水泡性口炎病毒攻毒,测出重组的CaIFN α具有较高的抗病毒作用,生物活性达到5.11×106 ∪/ ,重组蛋白质的含量约为13 /L。     

大肠埃希菌trp operon的克隆与表达

色氨酸操纵子所表达酶的高效表达和酶活性的提高,从而构建高产色氨酸菌株.利用PCR的方法从大肠埃希菌基因组中直接克隆色氨酸操纵子,并将其连接到原核表达载体pBV220中,得到重组质粒pBV220-trp operon,转化大肠埃希菌DH5α,温度诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析并用比色法测定其活性.通过凝胶电泳观察PCR扩增产物大小约为7 kb.SDS-PAGE鉴定目的蛋白得到了高效表达,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性分别比对照提高了3.4倍和2.5倍.成功构建了重组质粒pBV220-trp operon,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的表达量和表达活性在大肠埃希菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定基础.     

犬α干扰素基因的高效表达及其活性测定

以伴刀豆球蛋白A(ConA)诱导的犬外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法克隆扩增出犬α干扰素基因,将所扩增基因克隆于原核表达载体pBV220并进行测序,结果显示该基因与GenBank上所公布的犬α干扰素基因同源性为100%.将重组表达载体转入宿主菌进行温敏诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,证明目的蛋白以包涵体的形式存在,大小约为19kDa.将表达产物变性、复性、透析、纯化处理后加入犬肾细胞上,用水泡性口炎病毒攻毒,测出重组的CaIFN-α具有较高的抗病毒作用,生物活性达到5.11×10 6∪/㎎,重组蛋白质的含量约为13㎎/L.     

γ-谷氨酰基转肽酶（GGT）基因工程菌的构建及其发酵条件的初步研究

利用PCR技术以Bacillus subtilis SYU 20016基因组DNA为模板,扩增出1.8kb编码γ-谷氨酰基转肽酶的基因ggt,将其连接到温控表达载体pBV220,得到重组载体pBV220-ggt,重组载体在大肠杆菌JM109中得到表达。SDS-PAGE分析显示融合表达产物的分子量大小为65kD,同核酸序列测定所推导的值相符。对含有ggt的基因工程菌进行表达研究表明：发酵的培养温度为30℃,pH为7.2,装液量为20mL(在250mL的锥形瓶中)的条件下42℃诱导4h后,重组菌的γ-谷氨酰基转肽酶酶活力达到6U/mL,目前报道的非基因工程菌（枯草芽孢杆菌NX-2）酶活力最高仅为3.2U/mL。     

鼠疫耶尔森氏菌VcrV基因在大肠杆菌中的高效表达

将测序后的鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis)LcrV基因重组质粒pGEM－T／ypV酶切,克隆于原核表达载体pBV220,构建成pBV/ypV表达质粒,转化大肠杆菌DH5α,进行PCR及酶切鉴定,筛选阳性克隆,进行温控诱导表达,SDS－PAGE检测表达产物,在相对分子质量38000处有－表达条带,经薄层扫描分析目的蛋白带占全菌蛋白的38．4％以上,主要以可溶形式存在。     

人酸性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用Ncol Ⅰ和EcoRI双酶酶切,获得人酸性成纤维细胞生长因子haFGF基因,将该基因片断连接进入pBV220的EcoRI位点。连接物转化入大肠杆菌RR1,用菌落原位杂交的方法筛选出杂交阳性菌株,用酶切和Southern Blot的方法确定haFGF的插入与否以及插入方向的正反,结果我们得到了haFGF正向插入在pBV220 PLPR启动子下游的重组质粒pBV-αFGF。42℃热诱导使重组子表达,其菌体的裂解液对3T3细胞的DNA合成有较强的促进作用,说明重组菌株能够表达具有生物活性的hαFGF。SDS-PAGE结果表明,hαFGF表达产物约占菌体总蛋白的15％。hαFGF表达产物以包涵体的形式存在。     

金鱼精子质膜和核膜的区域特异性

本文结合采用扫描和透射电子显微镜(包括冷冻断裂-蚀刻、超薄切片以及细胞化学染色法),研究了金鱼精子的超微结构特征,结果表明金鱼精子的质膜和核膜都具有区域特异性:1)精子质膜内大部分区域含有许多蛋白颗粒,但在特定区域内,蛋白颗粒呈有序排列,构成晶格状结构。2)精子头颈部和尾部均有液泡密集之处,凡是覆盖着液泡区的质膜内,几乎都不含有蛋白颗粒。3)液泡区能被细胞化学方法染成致密色,表明内含糖蛋白。4)核膜孔只集中存在于靠近颈部的核膜上,而其他部分则没有。本文对上述诸点进行了讨论。     

注射装载孕酮的红细胞膜泡诱发蟾蜍卵成熟的研究

中华大蟾蜍长足的卵母细胞,经注入装载水相孕酮的红细胞膜泡,能被诱发成熟;直接注入水相孕酮的卵母细胞,无能恢复成熟分裂。将蛋白酶处理的红细胞制备成装载水相孕酮的膜泡,注入卵内,照样能诱发其成熟分裂;然而,分别用根皮素结合或磷脂酶A_2水解红细胞膜磷脂,制备的膜泡,虽亦包裹着水相孕酮,但注射的卵母细胞都未能被诱发成熟。这些结果表明,在通过红细胞膜转运孕酮诱发卵母细胞成熟过程中,红细胞膜上的某些膜蛋白可能不是必要的成份,而膜磷脂类却是关键成份,它不仅可能保证孕酮不被迅速代谢,且保证孕酮从卵母细胞内部诱发成熟分裂。     

低分子量神经丝蛋白(NF-L)的体外组装

利用超速离心和离子交换层析技术,从牛脊髓中分离纯化了神经丝蛋白三组分:NF-L,NF-M和NF-H。应用电镜负染色和金属投影方法研究神经丝的形态结构与NF-L的体外组装,结果表明:神经丝由10nm的核心纤维与外周的丝状突起组成;在近似生理条件下,NF-L可在60min内组装成10nm纤维,纤维由4根亚丝缠绕而成;在碱性缓冲液中,NaCl能促进NF-L装配成短纤维,这种10nm的短纤维无法连接成长纤维。     

血管内皮生长因子蛋白在大鼠睾丸和附睾的表达和定位研究

为探讨血管内皮生长因子(VEGF)在雄性生殖系精子发生发育和成熟过程中的调控作用,应用免疫组化、Periodic acid-Schiff(PAS)染色及蛋白质免疫印迹技术,检测VEGF蛋白在成年大鼠睾丸和附睾的表达和定位情况。Western-blots显示,在大鼠睾丸和附睾内均有VEGF蛋白(约45kD)的表达;免疫组化显示,睾丸内VEGF见于圆形和长形精子细胞、Sertoli细胞和Leydig细胞,免疫阳性产物位于细胞质内。精子细胞的VEGF表达伴随精子细胞顶体发育的全过程,精子残余体呈强阳性。附睾内VEGF表达于附睾管上皮,且有区域和细胞特异性。附睾起始段的所有上皮主细胞内都有VEGF阳性颗粒;头、体、尾各段的VEGF阳性细胞多数与含PAS阳性颗粒的细胞重合,证明为亮细胞;近端附睾的管腔内可见精子头部呈VEGF阳性染色。睾丸、附睾间质血管内皮为VEGF阴性。上述结果表明,VEGF蛋白可由生殖细胞和附睾管上皮细胞直接产生,它可能以自分泌和/或旁分泌的形式共同作用于睾丸和附睾的生殖细胞和血管内皮,直接或间接影响精子的发生、发育和成熟过程,特别是精子顶体的形成过程,并可能与精子在附睾内的成熟有关。     

多种神经活性物质在幼年猫和鸡视网膜神经细胞中的共存(简报)

视网膜起源于前脑泡,结构简单层次分明,因此常被视为脑的简化模型。但近期工作证明,视网膜包含的神经活性物质(神经递质、调质和神经肽)种类之多、分布之复杂并不亚于脑。尤其是无长突细胞不仅包含多种递质和肽类,而且还有递质与肽类或肽类与肽类在一个细胞中的共存。对视网膜神经递质、调质和神经肽的研究将是探索脑奥秘的有效途径。     

花背蟾蜍蝌蚪发生类坏死的皮肤在恢复过程中的超微结构

本实验以花背蟾蜍后肢芽期的蝌蚪为材料,用0.001 mol/L氨水(氨水组)和0.01mol/L醋酸(醋酸组)处理皮肤使之发生类坏死。以细胞核、细胞表面、细胞质及细胞间隙等的超微结构变化为指标,研究了各组皮肤发生类坏死后恢复过程中的可逆变化。结果观察到:两组均能引起核染色质浓缩,粘液分泌,液泡增多,线粒体及内质网膨大变形,细胞间隙变窄;醋酸还引起张力原纤维的凝集及紊乱等。恢复过程中,细胞核内染色质的分布趋于均匀,粘液的分泌渐正常,液泡减少,线粒体及内质网的形态逐步恢复,但细胞间隙一直很??窄;醋酸组中张力原纤维恢复成束且排列较整齐。作者认为氨水及醋酸引起蝌蚪皮肤发生类坏死后,在一定时间内是可以恢复的,而且此可逆变化也反映在超微结构的变化上。     

Chlorophyll isolation,structure and function: major landmarks of the early history of research in the Russian Empire and the Soviet Union

This paper covers major events of the early history of chlorophyll research in the Russian Empire and the Soviet Union from 1771 until 1952, when the modern period of studies on photosynthesis began in full swing. Short biographical sketches of key scientists, reviews of their major research contributions and some selected photographs are included. This revised version was published online in August 2006 with corrections to the Cover Date.     

磁场对丘脑下部一氧化氮含量的影响及与丘脑下部神经内分泌核团的关系

应用硝酸还原酶反应—分光光度法测定和NADPH-d组织化学技术,对磁场处理后丘脑下部一氧化氮量的变化及其可能的原因进行了研究,发现磁场可促使丘脑下部一氧化氮量(OD值)显著升高,并具有显著滞后效应。NADPH-d阳性神经细胞及NADPH-d和血管加压素(AVP)双染阳性神经细胞集中分布在丘脑下部室旁核、室周核和视上核,但不存在 于视交叉上核,提示室旁核、室周核和视上核一氧化氮能神经细胞是丘脑下部的一氧化氮的主要来源。磁场处理后大鼠丘脑下部一氧化氮含量(OD值)较正常对照组显著升高应归因于这些神经细胞受磁场作用表达增强。一氧化氮和血管加压素的共存可能对磁场调节内分泌具有一定意义。     

荧光脂质体导入黄瓜悬浮细胞原生质体的研究

用“脱水再加水法”制成包裹荧光黄的脂质体,通过PEG诱导融合或保温共培养法,成功地将脂质体导入了黄瓜悬浮细胞原生质体。PEG处理组摄入脂质体的细胞可达80—90%,其中50—60%的细胞荧光较强,均匀一致。脂质体/原生质体保温共培养半小时,荧光细胞达95%以上,荧光较弱,在细胞中呈点状分布,3—4天后脂质体逐渐破裂,点状荧光变为均匀一致的荧光。导入荧光黄脂质体的原生质体经持续分裂形成愈伤组织和胚状体,进一步分化出芽和根。     

重组人pLXSN-CD80逆转录病毒载体的构建及在CHO和PA317细胞中的表达

CD80是表达于抗原提呈细胞表面的分化抗原,它提供T细胞活化的协同刺激信号,并在抗肿瘤免疫应答中起着重要作用。我们在克隆了CD80全长。cDNA的基础上,将其与逆转录病毒pLXSN表达载体连接,构建成表达质粒,并用磷酸钙沉淀法将其转染PA317和CHO细胞,经G_(418)筛选获得抗G_(418)的PA317和CHO细胞克隆。以RIA,FACs和Westernblot检测CD80分子在PA317和CHO细胞上的表达、分布和分子量,结果显示,pLXSN-CD80转染的CHO细胞可表达较高丰度的CD80分子,其表观分子量为40kD。pLXSN-CD80转染的PA317和CHO细胞经5个月连续传代培养,无论存在G_(418)的选择压力与否,仍然持续表达CD80分子,表明我们构建的pLXSN-CD80表达载体具有应用于试验性治疗的潜能。