脂肪细胞中Munc18c的缺失不影响胰岛素诱导的GLUT4转运(已撤稿2016-01-13)

动物脂肪和肌肉组织中葡萄糖的摄取是通过受胰岛素调控的GLUT4储存囊泡的运输实现的.Sec1p的同源物Munc18c被认为是通过控制SNARE复合物的装配来使GLUT4囊泡锚定到质膜上的重要物质.我们发现Munc18c的缺失没有影响GLUT4的转运上膜,也没有影响Syntaxin4在细胞膜上的定位.在缺少Munc18c和功能性Syntaxin2的时候,GLUT4的转运可能和Munc18b有关.在3T3-L1脂肪细胞中与Syntaxin4具有强烈相互作用的是Munc18c而不是Munc18a和Munc18b.然而,当缺少Munc18c时,Munc18a和Munc18b与Syntaxin4体现出较弱的相互作用.因此,Syntaxin4可能在胰岛素刺激GLUT4转运过程中起到重要的作用,且与SM蛋白的相互作用是有代偿性的.     

Syntaxin 1A 与 Munc18a 在细胞内的相互作用和定位研究

Syntaxin 1A (Syn1A) 和 Munc18a 蛋白在囊泡转运和分泌中起着至关重要的作用,然而它们在细胞中分选和转运的分子机制目前尚不清楚 . 我们用绿色荧光蛋白 (EGFP) 和红色荧光蛋白 (TDimer2) 分别标记 Syn1A 和 Munc18a ,并用荧光显微技术观察它们在 BHK-21 和 HEK293 细胞中的转运和定位 . 实验结果表明 Syn1A 主要定位在细胞质膜上,而 Munc18a 主要分布在胞浆中,但是与 Syn1A 共表达时能定位到细胞质膜上 . 删除胞浆部分的 Syn1A 蛋白不能上膜,提示其胞浆结构域在分选和定位过程中起着重要的作用 .     

撤稿声明

正赵平,周琦,毕龙俊,沈金花,杨新洲,刘庆华.脂肪细胞中Munc18c的缺失不影响胰岛素诱导的GLUT4转运.生物化学与生物物理进展,2014,41(11):1144-1154[ZHAO Ping,ZHOU Qi,BI Long-Jun,SHEN Jin-Hua,Yang Xin-Zhou,LIU Qing-Hua.Munc18c is dispensable for insulin-stimulated GLUT4 translocation in adipocytes.Progress in Biochemistry and Biophysics,2014,41(11):1144-1154].应论文作者请求,撤销上列已发表论文.作者撤稿函刊登如下.     

自噬对葡萄糖转运蛋白4动力学影响分析

葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)与胰岛素抵抗有着紧密联系,抑制自噬能减缓胰岛素抵抗.为了探讨自噬对胰岛素抵抗方面的作用,现以GLUT4囊泡为动力学模型,通过全内反射荧光显微镜实时观测3T3-L1成熟脂肪细胞中GLUT4囊泡的运动,并采用高斯拟合及相应的搜索算法,从TIRFM时间序列中提取运动轨迹、速度等信息进行统计分析.结果显示:自噬对GLUT4的运动具有一定的影响.抑制自噬后,GLUT4囊泡运动的胰岛素响应程度增强,长距离运动囊泡增多,平均运动速度加快.     

GLUT4在胰岛素调控葡萄糖转运中作用

机体的血糖平衡调节主要依赖于胰岛素,其中一个重要的机制是胰岛素通过调控GLUT4的囊泡运转来调节脂肪细胞和肌细胞对葡萄糖的摄取。由胰岛素受体介导的一系列磷酸化过程能调节一些关键的GLUT4转运相关蛋白质的活性,这些蛋白质包括小GTP酶、拴系复合体和囊泡融合体。而这些蛋白质又反过来通过内膜系统调节GLUT4储存囊泡的生成、滞留,并调控这些囊泡的靶向出胞方式。了解这些过程有助于解释2型糖尿病中胰岛素耐受的机制,并可能为糖尿病提供新的靶向治疗方法。     

磷脂酰肌醇信号在GLUT4囊泡转运中的调控作用

葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)参与胰岛素敏感的脂肪细胞和肌肉细胞中的葡萄糖转运,对机体葡萄糖代谢至关重要。磷脂酰肌醇作为各种蛋白质的定位信号,参与调控细胞生长和新陈代谢,在胰岛素信号转导过程中起着关键作用。在过去的几十年里,关于磷脂酰肌醇信号调控GLUT4囊泡转运方面已有了很大的进展。该文总结了磷脂酰肌醇在GLUT4囊泡转运中的调控作用。     

Rab蛋白在葡萄糖转运中的作用

在脂肪和骨骼肌细胞中,胰岛素可迅速刺激葡萄糖转运,即通常所说的GLUT4转运。 GLUT4转运是指Rabs与GTP结合时,促进囊泡与微管和微丝蛋白结合,并通过锚定和融合作用使GLUT4囊泡与目标膜结构融合。多数 Rab 家族成员广泛表达于各种组织细胞中,且在细胞内定位十分广泛,几乎存在于真核细胞所有的膜相关的细胞器的胞浆侧。 Rab 蛋白作为囊泡运输的分子开关,通过调节运输小泡的停泊和融合,在囊泡的形成、转运、粘附、锚定、融合等过程中起着重要的作用。 Rab蛋白受到多种上游调节蛋白的调节,同时调控着下游的多种效应蛋白,构成了复杂的调控网络：任何一个环节改变都可能会导致蛋白质转运的异常,进而引发疾病。本文系统阐述了Rab蛋白在葡萄糖转运过程中的作用及该领域的最新进展。     

认识Munc13

Munc13是C.elegans Unc-13和Drosophila Dunc-13在哺乳动物中的同系物,有四种亚型,是SNARE蛋白的调节蛋白之一。Munc13蛋白含有两个结构域：C1和C2结构域,DAG/佛波醇结合到C1结构域上,能增强Munc13-1促进囊泡成熟的能力。在神经递质的胞吐过程中,有许许多多的蛋白参与,其中Munc,Synaptotagmin和Rab等蛋白家族是其重要的调节因子。同时,囊泡的转运和分泌也需要这些功能特殊的蛋白质的参与。全面了解Munc13的结构域与功能及其在分泌中的地位和分泌模式,有助于其在临床医学中的应用,如其在胰岛素释放等分泌调节中起着的重要作用。     

认识Munc13*

Munc13是C.elegans Unc-13和Drosophila Dunc-13在哺乳动物中的同系物,有四种亚型,是SNARE蛋白的调节蛋白之一。Munc13蛋白含有两个结构域:C1和C2结构域,DAG/佛波醇结合到C1结构域上,能增强Munc13-1促进囊泡成熟的能力。在神经递质的胞吐过程中,有许许多多的蛋白参与,其中Munc,Synaptotagmin和Rab等蛋白家族是其重要的调节因子。同时,囊泡的转运和分泌也需要这些功能特殊的蛋白质的参与。全面了解Munc13的结构域与功能及其在分泌中的地位和分泌模式,有助于其在临床医学中的应用,如其在胰岛素释放等分泌调节中起着的重要作用。     

葡萄糖转运蛋白4的转运调控研究进展

GLUT4在胰岛素作用下的转运上膜是血糖调控的一个关键途径.其中包含了两个重要的过程-胰岛素信号转导以及GLUT4转运途径.在这两个过程中新的特异分子的发现以及它们功能特点的研究是发展有效的药物治疗糖尿病的关键因素.本文主要从GLUT4在胞内的循环途径,胰岛素调节的GLUT4的转运以及转运中的调控蛋白三个方面着手,综述了GLUT4的转运调控研究进展.     

Sec1/Munc18蛋白的研究进展

大多数细胞包含许多种转运到不同目的地的囊泡.尽管存在许多特定的转运途径,根本的分子原则非常相似并在进化中保守.有充足的证据表明,膜融合除需要SNARE蛋白家族的参与外,也需要Sec1/Munc18(SM)蛋白;但是与SNARE蛋白功能的一致清楚相反,不同的实验系统得到的不同研究数据,使人们对于不同的SM蛋白的确切作用、作用位点和它们与SNARE蛋白的作用方式持不同观点.不同的SM蛋白与SNARE蛋白存在三种不同的作用模式.最近的研究确定,Munc18-1直接促进融合,并且它可能以所有三种模式与SNARE蛋白相互作用.本文综述了该领域的最新研究进展.     

葡萄糖转运的胰岛素敏感性以及forskolin, dipyridamole和pentobarbital对三种L6 骨骼肌细胞葡萄糖转运的抑制作用

用稳定过表达并带有myc表位的葡萄糖转运子1(glucose transporter 1, GLUT1)或葡萄糖转运子4(glucose transporter 4, GLUT4)的L6骨骼肌细胞株定征GLUT1和GLUT4对胰岛素的响应. 所筛选的L6-GLUT1myc细胞克隆分化前后的葡萄糖摄取量均在线性范围. 100 nmol/L胰岛素使L6-GLUT1myc和L6-GLUT4myc肌原细胞膜上GLUT1或GLUT4的量分别达到基础组的(1.58±0.01)倍和(1.96±0.11)倍, 2-脱氧葡萄糖摄取量分别达到了(1.53±0.09)倍和(1.86±0.17)倍, 此作用可被渥曼青霉素(wortmannin)抑制. 胰岛素刺激了此2种细胞中的Akt磷酸化. L6-GLUT1myc肌原细胞的葡萄糖摄取量对胰岛素浓度呈剂量依赖性, 但与野生型细胞相比, 其对胰岛素的敏感性和最大响应没有改变. 但L6-GLUT4myc肌原细胞的葡萄糖摄取量对胰岛素的敏感性和最大响应均增加. 以前的研究提示毛喉素(forskolin)可能影响胰岛素刺激的GLUT4转位. 本研究表明, 在L6-GLUT4myc细胞中, 毛喉素使胰岛素刺激的葡萄糖摄取减少了65%, 此作用是由它对GLUT4的直接抑制而不是由其对GLUT4转位的影响造成的. 毛喉素和dipyridamole对GLUT4比对GLUT1有更强的抑制作用, 而戊巴比妥(pentobarbital)对GLUT1的抑制作用强于GLUT4. 应用这些抑制剂的结果表明、L6肌原细胞中基础状态下和胰岛素刺激状态下的葡萄糖主要由过表达的GLUT1或GLUT4转运. 因此, L6-GLUT1myc和L6-GLUT4myc细胞株为筛查对肌肉细胞GLUT1或GLUT4的活性或转位有不同作用的化合物提供了一个平台.     

以消散场成像和单微粒跟踪技术揭示GLUT4囊泡和分泌囊泡的不同动态过程

葡萄糖转运子蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)在维持体内葡萄糖动态平衡的过程中起着至关重要的作用。GLUT4贮存囊泡(GLUT4 storage vesicle,GSV)和神经内分泌细胞中的分泌囊泡含有许多相同的蛋白。研究证明这些蛋白调节了分泌囊泡的胞内转运过程,但是GLUT4囊泡和分泌囊泡是否具有相同的胞内动态过程还未阐明。文章以3T3-L1纤维原细胞中的GSV和神经内分泌细胞PC12细胞中的分泌囊泡:致密核心大囊泡(large dense core vesicle,LDCV)为研究对象,使用消散场显微成像技术和单微粒跟踪技术直观观察了活体细胞内单个GSV和LDCV的三维运动轨迹。通过以适当方程拟合单个囊泡的均方位移曲线,发现两种囊泡都具有三种运动模式。定量分析显示作自由扩散运动和方向性扩散运动的GSV数量明显多于LDCV。对比GSV和LDCV的三维扩散系数,发现GSV的扩散系数中值为7.2×10-4μm2/s,而LDCV的扩散系数中值仅为1.94×10-4μm2/s。这一结果说明GSV的活动性远大于LDCV,提示GSV的胞内转运过程涉及不同的分子机制。     

绿色荧光蛋白标记的葡萄糖转运蛋白4稳定表达细胞系的建立

目的:建立稳定表达EGFP标记的葡萄糖转运蛋白4的CHO细胞系,为研究GLUT4在CHO细胞中的转运调节机制奠定基础。方法:采用分子克隆方法构建GLUT4-EGFP的融合蛋白,在FLP-in的CHO细胞系中表达,潮霉素筛选后得到稳定的细胞系。结果:通过共聚焦显微镜的检测,证明了此稳定细胞系的阳性率达到了99%。定位研究表明大部分GLUT4以囊泡形式分布在CHO细胞胞浆内,但是质膜上也有少量的GLUT4。结论:建立了一个稳定表达GLUT4-EGFP的CHO细胞系,为进一步研究GLUT4的转运提供了一个很好的细胞模型。     

地塞米松和胰岛素调节猪脂肪细胞SOCS-3、OB、 GLUT4和PPARg 基因的表达

猪是研究糖尿病最理想的模型动物, 研究胰岛素和胰岛素抵抗是研究糖尿病的重要环节。为明确SOCS-3在胰岛素抵抗中的作用, 分别用100 nmol/L的胰岛素, 300 nmol/L的地塞米松处理原代培养的猪脂肪细胞诱导胰岛素抵抗; 利用半定量RT-PCR技术分别检测SOCS-3、OB、GLUT4和PPARg 基因表达变化。结果发现, 胰岛素增加了GLUT4、SOCS-3和PPARg 基因的表达, 对OB基因表达变化没有显著性影响; 地塞米松诱导的胰岛素抵抗状态下OB和SOCS-3基因表达水平升高, 而GLUT4和PPARγ基因表达水平显著下调。研究结果表明, GLUT4基因表达量水平的升高可能是由于PPARg的高表达引起, SOCS-3基因的不同表达水平对胰岛素信号的抑制效果不同。地塞米松诱导的胰岛素抵抗不仅表现在对葡萄糖转运的抑制, 也反映在抑制了胰岛素信号; 而SOCS-3基因可能是消除胰岛素抵抗的一个有效靶基因。     

苜蓿尺蠖核型多角体病毒囊膜蛋白ODV-E18的核定向转运研究

苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)在细胞质中合成其囊膜蛋白,但在细胞核内组装并包埋病毒粒子,这些蛋白的核定向转运机制是人们甚感兴趣的课题.以AcMNPV多角体衍生型病毒ODV(occlusion-derived virus,ODV)的一种囊膜蛋白ODV-E18为对象,通过E18与一个标记短肽Flag融合的重组病毒的构建,以免疫荧光法跟踪检测E18蛋白的转运过程及形态,并利用酵母双杂交系统法(yeast two hybrid system),通过蛋白-蛋白相互作用的研究,寻找与E18紧密结合的可能的转运蛋白.研究结果表明,E18是先以核内模结构--微泡(microvesicle)的形式存在于核内的;一个被报道具有核定向转运功能的AcMNPV囊膜蛋白-ODV-E66能与E18形成紧密的复合体,推测E-66可能在E18的核定向转运中起着运载体的作用.     

葡萄糖转运子4 转位信号转导通路的研究进展

葡萄糖是大部分细胞主要能量来源,它进入细胞的过程在生命的维持中无疑成为一个重要的步骤。而葡萄糖进入细胞是依赖于这些细胞上的葡萄糖转运子和相应的对其进行调节的因子。葡萄糖转运子4（GLUT4）在糖进入细胞维持血糖平衡中起了重要的作用。近年有关GLUT4的研究文献很多,但却总给人不系统的感觉。本文对GLUT4转位的胰岛素依赖和非胰岛素依赖的信号途径以及其远端过程及机制作一综述,同时分析了GLUT4转位的信号途径的研究中存在的问题和将来研究的方向。     

插入到细胞膜上的葡萄糖转运子4可不暴露其被光化学法标记的活性位点

胰岛素刺激骨胳肌产生磷脂酰肌醇3, 4, 5三磷酸(PI(3,4,5)P₃), 它是促进葡萄糖转运子4(GLUT4)与细胞膜融合的必要条件. 向肌肉细胞内导入PI(3,4,5)P₃可以模拟胰岛素刺激GLUT4与细胞膜融合的作用, 但不足以增加细胞摄取葡萄糖的量. 本研究目的是探讨PI(3,4,5)P₃与胰岛素作用不同的机制. 在骨骼肌细胞株(L6-GLUT4myc)中, 应用免疫反应方法检测细胞膜片上与特异性抗体反应的GLUT4的胞浆区羧基末端表位和胞外区myc表位的可用性; 使用不能渗透到细胞内的甘露糖-生物素衍生物Bio-LC-ATB-BMPA, 结合亲和光化学标记法检测GLUT4胞外区的活性位点. 相对于基础组, 100 nmol/L胰岛素和10 mmol/L PI(3,4,5)P₃分别使与myc结合的抗体量增加1.64倍和1.58倍. 胰岛素还使细胞膜上GLUT4的光化学标记量和细胞膜片上与羧基末端表位结合的抗体量分别增加了2.47倍和2.04倍, 而PI(3,4,5)P₃则无此作用. 在胰岛素作用下, 细胞膜片上与羧基末端表位结合的抗体量大于与myc表位结合的抗体量(分别为2.04和1.64倍). 结果表明: (i) 尽管PI(3,4,5)P₃能使GLUT4与细胞膜融合, 但不能使GLUT4胞外区的活性位点暴露; (ii) GLUT4胞外区活性位点的可用性与胞浆区羧基末端的可用性相关; (iii) 除了能刺激GLUT4与细胞膜融合, 胰岛素还使封闭GLUT4羧基末端的蛋白脱离. 推论胞浆内某种蛋白封闭羧基末端, 同样阻止甘露糖-生物素衍生物对GLUT4活性位点的标记, 并可能妨碍GLUT4转运葡萄糖.     

地塞米松和胰岛素调节猪脂肪细胞SOCS-3、OB、GLUT4和PPARγ基因的表达

猪是研究糖尿病最理想的模型动物,研究胰岛素和胰岛素抵抗是研究糖尿病的重要环节。为明确SOCS-3在胰岛素抵抗中的作用,分别用100nmol／L的胰岛素,300nmol／L的地基米松处理原代培养的猪脂肪细胞诱导胰岛素抵抗;利用半定量RT-PCR技术分别检测SOCS-3、OB、GLUT4和PPARγ基因表达变化。结果发现,胰岛素增加了GLUT4、SOCS-3和PPARγ基因的表达,对OB基因表达变化没有显著性影响;地塞米松诱导的胰岛素抵抗状态下OB和SOCS-3基因表达水平升高,而GLUT4和PPARγ基因表达水平显著下调。研究结果表明,GLUT4基因表达量水平的升高可能是由于PPARγ的高表达引起,SOCS-3基因的不同表达水平对胰岛素信号的抑制效果不同。地塞米松诱导的胰岛素抵抗不仅表现在对葡萄糖转运的抑制,也反映在抑制了胰岛素信号;而SOCS-3基因可能是消除胰岛素抵抗的一个有效靶基因。     

量子点标记活细胞内GLUT4 蛋白的研究

目的:研究量子点标记活细胞内GLUT4蛋白的方法,用于长时程观察活细胞内GLUT4的转运过程。方法:使用在GLUT4蛋白膜外区构建了myc位点的L6-GLUT4myc细胞系,用胰岛素刺激L6细胞内的GLUT4myc转运到细胞膜上,通过抗体抗原反应先后将一抗9E10和偶联二抗IgG的量子点与特异性位点结合。结果:通过量子点标记固定细胞内GLUT4的实验,证明了标记方法的特异性和灵敏性。量子点能够标记细胞膜表面的GLUT4蛋白并伴随GLUT4的胞吞进入细胞。适当调整实验温度,用量子点标记细胞膜上的GLUT4并且在实验过程结束后将标记了量子点的GLUT4保持在细胞膜表面,能够观察活细胞内GLUT4蛋白内化和胞内循环的过程。结论:发展了量子点标记活细胞内GLUT4的方法,为进一步研究活细胞内GLUT4的转运过程打下了基础。