杆状病毒用于哺乳动物细胞快速高效表达外源基因的研究

现已发现杆状病毒可进入某些培养的哺乳动物细胞,这提示可将杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体。对杆状病毒转移载体的改造及对哺乳动物细胞的基因转移方式进行了进一步的研究。以绿色荧光蛋白基因为报告基因,利用Bac-to-Bac系统构建了分别含有正向和反向CMV启动子表达盒的两种重组杆状病毒。可观察到CMV启动子在Sf9细胞中可启动报告基因的表达,但表达效率较低。用重组杆状病毒感染后Sf9细胞的培养上清直接与HepG2细胞作用,以流式细胞术检测基因转移效率及荧光表达强度,发现这两种病毒在相同的感染复数下对HepG2细胞具有相似的基因转移及表达效率。同时,利用流式细胞术进一步研究了直接使用重组杆状病毒感染4d后Sf9细胞的培养上清对哺乳动物细胞进行基因转移的方法。通过对HepG2细胞的实验结果显示,将带毒Sf9细胞培养上清(1.2×10⁷PFU/mL)用哺乳动物细胞培养基1倍稀释后,37℃下孵育靶细胞12h(moi=50),可达到较高的基因转移及表达效率,同时不会对细胞造成明显损伤。将重组杆状病毒与脂质体和逆转录病毒这两种系统对HepG2及CV1细胞的基因转移效率进行了比较,结果发现在同样未经浓缩等特殊处理的条件下重组杆状病毒对这两种细胞的基因转移效率是最高的。因此可以认为,经过适当改造后的Bac-to-Bac重组杆状病毒系统可作为一种对哺乳动物细胞简便高效的基因转移表达载体。     

杆状病毒对不同哺乳动物细胞基因转移及表达效率的研究

研究已证实杆状病毒可进入某些哺乳动物细胞,这提示了可将重组杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体。利用已构建的重组杆状病毒BacV-CMV-EGFPA,以含病毒的Sf9细胞培养上清同时孵育多种哺乳动物细胞,利用流式细胞术检测报告基因在不同细胞株中的转移效率及表达效率。共使用了20种哺乳动物细胞株,其中有12种人类组织细胞,7种小鼠组织细胞,1种猴组织细胞。实验结果显示携带CMV启动子的重组杆状病毒可有效进入多数哺乳动物细胞,其中对人、猴来源细胞的基因转移效率显著高于对鼠源细胞,对贴壁细胞的基因转移效率显著高于对悬浮细胞。同时,通过脂质体LipofectAMINE将携带有CMV启动子和EGFP基因的哺乳动物细胞表达质粒pCDNA3-1-EGFP分别转染部分特别是被认为杆状病毒进入能力较低的细胞株,结果显示CMV启动子在这些细胞中均可有效引导EGFP基因的表达,因此认为携带了CMV启动子的重组杆状病毒对不同哺乳动物细胞基因转移效率能基本反映出杆状病毒对不同种哺乳动物细胞的进入能力。通过综合比较携带CMV启动子的杆状病毒对不同种属及组织来源细胞的基因转移及表达效率,可看出杆状病毒对灵长类动物贴壁细胞的基因转移及表达效果是较好的,而对小鼠来源的细胞及悬浮培养细胞却并不十分理想,这表明将重组杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的基因转移工具,仍有其局限性,不一定对所有的细胞都合适,在应用时应予以充分考虑。     

杆状病毒介导外源基因在哺乳动物细胞中表达的研究进展

杆状病毒(Baculovirus)是一种以昆虫为唯一宿主的病毒, 可用做生物杀虫剂或作为表达载体在昆虫细胞中大量表达外源蛋白, 制备疫苗。研究发现, 在哺乳动物细胞中携带哺乳动物启动子的重组杆状病毒能启动下游外源基因的表达但病毒不能在哺乳动物细胞中增值, 对细胞毒性小, 转导成功的细胞可以稳定传代并有效表达外源基因, 哺乳动物细胞比昆虫细胞对蛋白质具有更好的翻译后修饰, 表达出的蛋白结构更接近天然蛋白。因此, 杆状病毒可作为一种新型的哺乳动物细胞基因转移载体, 用于表达外源基因及作为一种基因治疗载体, 具有巨大潜力, 日益受到人们的关注。本文对杆状病毒作为一种表达载体在哺乳动物细胞中表达的研究进展进行了综述。     

早期哺乳动物胚胎的遗传操作

该书分四部分:一、发育遗传学(6篇);二,内源病毒及病毒载体(5篇):三、将克隆基因导入哺乳动物的种系中(11篇);四、非哺乳动物的基因转移系统(3篇)。 此书是1984年秋在英国Banbury举行的“哺乳动物卵及早期胚胎遗传操作会议”上发表的论文集。     

慢病毒载体介导的RNA干扰

RNA干扰(RNAinterference)是指由双链RNA分子抑制同源基因的表达。慢病毒载体(lentivirusvector)则是高效的基因转导工具,能将外源序列稳定导入分裂相和非分裂相细胞。将慢病毒载体和RNA干扰结合,能在哺乳动物各类细胞中,特异性抑制同源基因的表达;也是基因功能研究和基因治疗的有力手段。     

核衣壳蛋白VP39融合TAT转导肽对杆状病毒转导哺乳动物细胞的影响

为了提高昆虫杆状病毒在哺乳动物细胞中转导基因的效率,构建了重组杆状病毒AcRed-tat和AcRed。两者都能在哺乳动物细胞内表达红色荧光蛋白作为报告基因。同时,AcRed-tat带有HIV-1Tat转导肽、病毒主要衣壳蛋白基因vp39及增强型绿色荧光蛋白(egfp)三者的融合基因,并由杆状病毒多角体启动子表达,能够在昆虫细胞中表达该Tat融合蛋白,并掺入子代病毒粒子。而AcRed作为相应的对照病毒,带有多角体启动子表达vp39和egfp的融合基因。2株病毒分别转导哺乳动物细胞后,利用流式细胞仪检测报告基因的表达水平,发现在CHO和Vero细胞中AcRed-Tat介导的报告基因表达水平明显高于AcRed,而在HEK293细胞中2株病毒介导的报告基因表达水平差异不显著。结果表明Tat转导肽可以提高杆状病毒对一部分哺乳动物细胞的转导效率,为改进杆状病毒-哺乳动物细胞转导载体提供了新的思路。     

2型重组腺相关病毒体外转导培养细胞的研究

为揭示2型重组腺相关病毒感染哺乳动物细胞的一些转导特征,构建并制备了一种携带萤火虫荧光素酶基因的重组2型腺相关病毒rAAV2-Luc,研究了该重组病毒体外转导哺乳动物细胞的量效关系;肝素对转导的拮抗作用;rAAV2的竞争抑制作用;丁酸钠对表达水平的增强作用.结果显示,在一定范围内,随着rAAV2-Luc感染细胞的感染复数(MOI即每个细胞感染的病毒基因组数)值增高,荧光素酶的表达水平也增高;但更高的MOI(＞107)反而使荧光素酶的表达水平下降.肝素可特异性阻断rAAV2介导的荧光素酶表达.携带不同基因的2种rAAV2病毒相互具有明显的竞争抑制作用.丁酸钠可显著增强rAAV2介导的荧光素酶表达水平.本研究对rAAV2载体介导的基因转移研究具有一定的指导意义.     

OTX1基因慢病毒载体的构建及过表达研究

OTX1基因是神经发育调控中关键转录因子之一。本实验构建表达OTX1基因慢病毒载体,探讨慢病毒介导OTX1基因体外过表达的可行性。将OTX1基因克隆到慢病毒穿梭质粒DUET101内,构建表达OTX1以及GFP－OTX1基因的慢病毒载体;将pDUET－OTX1、pDUET－GFP－OTX1及pDUET101（空载体对照）质粒分别与慢病毒包装质粒pCMV R8.91、pMD.G共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带OTX1基因、GFP－OTX1基因的重组慢病毒DUET－OTX1、DUET－GFP－OTX1以及仅携带GFP基因的DUET－GFP;用重组慢病毒分别转导293T细胞、SY5Y细胞、小鼠胚胎干细胞及大鼠胚胎15天皮层神经干细胞,证实慢病毒载体能够将外源基因转导入不同细胞,且转导的OTX1或GFP－OTX1在不同细胞中均仅在细胞核内表达;培养OTX1单克隆抗体细胞,浓缩抗体上清,通过Western Blot以及细胞免疫荧光法证实慢病毒介导的OTX1基因及GFP－OTX1基因转导入293T细胞后的过表达。本实验证实慢病毒载体是高效的基因转移载体;OTX1作为发育过程中至关重要的转录因子,经过重组慢病毒体外转导后均只在细胞核内表达。     

慢病毒介导的mTOR敲低肝癌细胞株HepG2的构建及初步功能检测

目的:建立高效稳定的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)小干扰RNA(siRNA)细胞导入方法,并对mTOR敲低的HepG2肝癌细胞株的功能进行初步检测。方法:构建了2条不同的人mTOR慢病毒siRNA载体pLenti-H1/mTOR siRNA,与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染HepG2细胞;经嘌呤霉素筛选2周后,收集细胞进行Western印迹,检测mTOR敲减效果及其下游基因c-myc、周期蛋白D1(cyclinD1)表达水平及4E-BP1、S6K1磷酸化水平的变化。结果:RT-PCR和Western印迹结果显示,构建的pLenti-H1/mTOR siRNA能有效抑制mTOR基因的表达,敲低了mTOR蛋白水平,且沉默mTOR后其下游基因c-myc、CyclinD1的表达水平及4E-BP1、S6K1磷酸化水平降低。结论:构建了慢病毒介导RNA干扰mTOR表达载体,为进一步研究mTOR通路奠定了实验基础。     

反转录病毒基因转移载体

80年代初期,以反转录病毒作载体进行基因转移的技术迅速发展起来。以反转录病毒作载体进行基因转移具有以下几个方面的特点:宿主细胞范围广;病毒感染滴度高;病毒感染宿主细胞后,细胞不发生病变,可以稳定地表达外源基因;基因转移效率高,病毒基因往往以低拷贝整合,易于外源基因表达的研究;反转录病毒较小,易于操作,容纳的外源基因较大(10kb左右);基因转移后不发生重排;经特殊构建的反转录病毒载体,不易产生感染性病毒粒子,比较安全。为了构建一个基因转移效率高、宿主范围广、安全的反转录病毒基因转     

表达猪瘟病毒E2蛋白的BacMam病毒的构建及其免疫原性分析

含具有哺乳动物细胞活性的启动子的重组杆状病毒(BacMam病毒)可有效转导多种哺乳动物细胞,并被广泛用于开发新型非复制型载体疫苗．将水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)基因插入多角体启动子下游,得到经修饰的杆状病毒转移载体,将对虾白斑综合症病毒(WSSV)ie1启动子控制下的猪瘟病毒E2基因表达盒插入此载体中,构建了BacMam病毒BacMam/G-ie1-E2,以其感染Sf9细胞和转导HeLa细胞,通过间接免疫荧光试验和Western blot分析检测E蛋白的表达,同时用BacMam病毒直接免疫小鼠,用检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法检测免疫小鼠血清抗体,用基于CFSE和WST-8的淋巴细胞增殖试验评价其细胞免疫应答．结果显示,BacMam/G-ie1-E2能同时在昆虫细胞和哺乳动物细胞中高效表达E2蛋白,免疫小鼠能诱导产生针对猪瘟病毒的特异性抗体,免疫小鼠脾细胞经猪瘟病毒刺激后能诱导特异性的淋巴细胞增殖．这表明,由BacMam病毒介导的基因转移有望用于开发针对猪瘟病毒的非复制型载体疫苗．     

小鼠TRAF6特异性shRNA慢病毒质粒的构建及活性

目的:构建小鼠TRAF6基因特异性shRNA慢病毒质粒.方法:设计、合成小鼠TRAF6基因特异性shRNA核苷酸,将其链接入pENTR/U6载体,基因测序;通过LR克隆酶将pENTR/U6中的TRAF6特异性shRNA核苷酸插入CS -RfA -EG慢病毒载体,KpnⅠ限制酶切分析;通过慢病毒将TRAF6基因特异性shRNA慢病毒质粒导入MEF13细胞中,FACS分析质粒导入率,同时利用Western blot技术检测MEF13细胞中TRAF6的表达以及磷酸化IκBα的表达.以LacZ基因特异性shRNA慢病毒质粒为对照.结果:构建的小鼠TRAF6基因特异性shRNA慢病毒质粒与设计相符;MEF13细胞中慢病毒质粒的导入率为95％以上;与对照组比较,TRAF6基因特异性shRNA可长期、完全抑制MEF13细胞中TRAF6的表达及TRAF6介导的IκBα的磷酸化.结论:成功构建小鼠TRAF6基因特异性shRNA慢病毒质粒.     

基因转移研究进展

基因治疗已经广泛应用于遗传病,肿瘤等疾病治疗临床试验,基因转移方法是基因治疗研究的基础和关键,脂质体介导的基因转移是物理化学方法中的最佳选择;反转录病毒介导的基因转移系统较为成熟,临床运用最广泛;腺病毒、腺病毒相关病毒基因转移系统也已进入临床试验,单纯疱疹病毒,痘苗病毒,细小病毒以及哺乳动物细胞人工染色体的基因转移系统也在研究之中。     

基因转移研究进展

基因治疗已经广泛应用于遗传病,肿瘤等疾病治疗临床试验,基因转移方法是基因治疗研究的基础和关键,脂质体介导的基因转移是物理化学方法中的最佳选择;反转录病毒介导的基因转移系统较为成熟,临床运用最广泛;腺病毒,腺病毒相关病毒基因转移系统也已进入临床试验,单纯疱疹病毒,痘苗病毒,细小病毒以及哺乳动物细胞人工染色体的基因转移系统也在研究之中。     

结核分枝杆菌38kD蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的分泌性表达

目的:构建含结核分枝杆菌38kD蛋白基因的真核表达载体并转染HEK293T细胞,高效表达分泌性38kD蛋白。方法:设计合成的结核分枝杆菌38kD基因被克隆到T载体,然后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.0,经酶切鉴定正确后,PEI转染法导入293T细胞,换不含血清的DMEM培养基培养3 d后收集细胞及上清,采用Western印迹检测38kD蛋白的表达。结果:酶切结果显示,获得正确的含38kD基因的重组表达载体;Western印迹结果显示表达载体导入293T细胞中后能在细胞及上清中检测到38kD蛋白表达。结论:构建了含重组结核分枝杆菌38kD蛋白基因的真核表达载体pcDNA3.0-38kD,该载体可在哺乳动物细胞HEK293T中高效分泌性表达38kD蛋白,为结核病诊断试剂盒研发奠定了基础。     

埃博拉病毒截短型糖蛋白GPdmucin的表达与纯化

目的:确定黏蛋白区缺失的埃博拉病毒包膜糖蛋白(GPdmucin)的最佳表达系统,并获得纯化的GPdmucin。方法:从埃博拉病毒的包膜糖蛋白(GP)全长基因上扩增GPdmucin序列,构建至pET32a、pFast Bac1和pcDNA3.4三种不同表达系统的质粒中,分别在原核、昆虫和哺乳动物表达系统中进行表达,并用特异抗体鉴定表达情况。结果:原核系统表达的GPdmucin不稳定,活性差;在昆虫表达系统中,GPdmucin在细胞内以不溶形式表达;利用Expi293瞬时蛋白表达系统,GPdmucin在哺乳动物细胞中可溶性表达,Ni柱亲和层析获得的目的蛋白纯度达90%以上,且与特异抗体具有很好的结合活性。结论:获得哺乳动物细胞表达系统表达的GPdmucin蛋白,将用于GPcl的制备、GP抗体筛选、疫苗效果评价及病毒致病机理的研究。     

DDX20基因对胃癌细胞迁移能力的调控作用

目的:基于细胞划痕实验研究DDX20基因对胃癌细胞迁移能力的调控作用。方法:首先采用实时定量PCR检测人胃黏膜细胞GES,胃癌细胞MGC803、SGC7901和MKN74中DDX20基因的表达水平,确定DDX20基因高表达和低表达细胞株;进而针对DDX20基因设计并包装过表达及干扰慢病毒,基于实时定量PCR和Western印迹筛选稳定转染细胞株;基于稳定转染细胞株进行细胞划痕实验并采集图片。结果:与正常的胃黏膜细胞GES相比,DDX20基因在MGC803胃癌细胞中表达水平最高,在MKN74胃癌细胞中表达水平次之,在SGC7901胃癌细胞中表达水平最低。转染DDX20过表达慢病毒后,DDX20基因及蛋白表达水平显著增加;转染DDX20干扰慢病毒,特别是sh-RNA-02干扰慢病毒后,DDX20基因及蛋白表达水平显著降低。过表达DDX20基因能显著促进胃癌细胞的迁移,抑制DDX20基因的表达可显著降低胃癌细胞的迁移。结论:DDX20基因是一个肿瘤转移相关基因,通过抑制该基因的表达能有效降低细胞的迁移,为胃癌的临床治疗提供了一个潜在靶点,具有一定的临床应用价值。     

生物弹技术在禾谷类植物基因转移中的应用

近年来植物基因转移,遗传转化技术取得了很大的进展,但将外源基因导入禾谷类植物细胞,获得转基因单株的成功事例很少,这主要是因禾谷类植物细胞的特殊性和现有基因转移技术固有的缺陷所致。由Sanford等发明的生物弹基因转移技术可克服上述不足,成功地将外源基因导入细胞。本文综述了该技术的发明、作用、特点及在禾谷类植物基因转移中的应用,并分析了该技术的优缺点,认为生物弹基因转移技术可望成为实验室常规的基因转移技术。     

杆状病毒介导的哺乳动物细胞基因转移及其影响因素

杆状病毒作为优良的哺乳动物细胞基因转移载体已在基因治疗、疫苗开发、药物筛选以及基因调控研究等方面发挥巨大作用。但杆状病毒对哺乳动物细胞的嗜性不够广泛、转导效率和转基因表达水平偏低,以及表达持续时间短暂等问题制约其进一步发展,因此如何突破这个制约的瓶颈成为学者们新的关注焦点。针对以上问题,围绕杆状病毒介导哺乳动物细胞基因转移的各种影响因素进行综述。