RT-PCR克隆甜菜硝酸还原酶cDNA全长序列及分析

根据GenBank中已公布的甜菜（Beta vulgaris）硝酸还原酶（nitrate reductase）基因序列（gb∣ABW05098.1∣）,设计引物,以50 mmol·L^-1 KNO₃溶液处理的甜菜幼苗为材料,从总RNA中通过RT-PCR分离得到一个硝酸还原酶基因,其cDNA长2 760 bp,包含了完整的基因编码序列,与已公布的硝酸还原酶基因序列相似性达99%。Southern杂交分析表明,硝酸还原酶基因在甜菜基因组中可能以两个拷贝或低拷贝形式存在。根据其编码的氨基酸序列,利用生物信息学预测了其亚细胞定位和蛋白质的三级结构。     

杜梨胆碱单加氧酶基因克隆及胁迫表达

为了解梨砧木—杜梨对非生物胁迫的防御机制,采用RT-PCR、RACE和长片段PCR技术从杜梨幼苗中获得1个甜菜碱合成相关的胆碱单加氧酶基因(PbCMO),运用生物信息学方法分析序列特点,并通过跨内含子引物进行半定量RT-PCR研究其在非生物胁迫下的表达情况。结果表明:(1)PbCMO基因cDNA序列编码区长1 227bp,编码由408个氨基酸组成的多肽。其对应基因组DNA序列长2 928bp,由10个外显子和9个内含子组成。其推导的多肽预测的等电点为6.19,相对分子质量为46.27kD,具备Rieske型铁硫[2Fe-2S]簇结合区域和非血红素单核态铁配位点序列,与枸杞CMO蛋白相似性最高(71%)。(2)PbCMO在幼苗根和叶中均为诱导型表达,100mmol/L氯化钠、10%(W/V)聚乙二醇、180mmol/L甘露醇或20μmol/L脱落酸处理后其表达量明显上调,表明PbCMO对盐碱、干旱、渗透胁迫和ABA均存在表达响应,可能参与杜梨应对非生物胁迫的转录调节。     

辽宁碱蓬胆碱单加氧酶基因克隆及转基因烟草的耐盐性

甜菜碱是生物体内普遍存在的一种很有效的渗透调节剂。在高等植物中,甜菜碱由胆碱经两步酶催氧化得到,即：胆碱→甜菜碱醛→甜菜碱,催化第一步反应的酶是胆碱单加氧酶（choline monooxygenase,CMO)。用RT-PCR和RACE技术从盐生植物辽宁碱蓬（Suaeda liaotungensis Kitag)中分离了CMOcDNA全序列,其中包括5′端非编码区123bp,3′端非编码区368bp。开放阅读框1329bp,编码一个由442个氨基酸构成的多肽,与菠菜,甜菜和山菠菜CMO的氨基酸序列同源性分别为77%,72%和74%。克隆了其编码区。构建了植物表达载体pBI121-CMO。根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens)介导转化烟草（Nictiana tabacumL.cv.89),获得卡那霉素抗性植株,PCR和Southern杂交均证明外源CMO基因已整合到烟草基因组中,转基因烟草的甜菜碱含量明显高于对照。转基因烟草膜的相对电导率明显低于对照,说明盐胁迫下转基因烟草的膜结构所受损伤小于对照。转基因烟草具有一定的耐盐性。能在含250mmol/LNaCl的培养基中正常生长。     

草鱼RBM cDNA克隆及序列分析

目的:克隆草鱼RNA剪切蛋白(RNA binding motif protein-RBM)基因.方法:采用RT -PCR技术从草鱼性腺总RNA中克隆RBM基因,将其插入pBS-T载体上,经菌液PCR鉴定后进行 测序并对测序结果进行生物信息分析.结果:获得草鱼RBM cDNA部分序列 ,大小为384bp,预 测编码127个氨基酸残基;RBM基因进化与物种形态进化类似;不同物种间RBM基因一级结构 保守性不高,但氨基酸序列保守性较高,且存在高度保守的氨基酸位点.结论: 成功地克隆了草鱼RBM cDNA部分序列,为获RBM cDNA全长序列及后续研究提供理论基础.     

甜荞胰蛋白酶抑制剂cDNA片段的克隆及序列特征

采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等方法从甜荞中纯化出荞麦胰蛋白酶抑制剂(buckwheat trypsm inhibitor,BTI),经活性鉴定该抑制剂属丝氨酸类蛋白酶抑制剂家族。为了获得BTI的基因序列,并弄清其在体内的表达调控机制,应用RTPCR和3’-RACE等方法,直接体外扩增该抑制剂基因,首次获得总长为361bp的DNA片段(GenBank登录号为AY335158),并命名为BTI-W1。该片段包括一个183bp的开放阅读框,编码61个氨基酸。由该基因推导的氨基酸序列与已报道的荞麦胰蛋白酶抑制剂BTI-2的氨基酸序列的同源性达100％。BTI-WI基因的获得,对于深入开展荞麦胰蛋白酶抑制剂结构与功能关系的研究具有重要意义,也为荞麦植物资源的开发利用建立了前期研究基础。     

全雌系苦瓜ACC合成酶基因cDNA克隆及序列分析

以全雌系苦瓜‘X-Hei-d-d’花蕾为材料,根据已报道ACC合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,ACS)保守氨基酸序列设计简并引物,采用RT-PCR技术及序列拼接,获得了全雌系苦瓜ACS基因cDNA序列,命名为Mc-ACS4(GenBank登录号:FJ459814)。该序列包含一个1 455 bp的完整开放阅读框,编码484个氨基酸,具有7个保守区;系统进化上与普通苦瓜ACS基因首先聚类,同源性达99%,二者仅有2个氨基酸差异,推测可能与全雌系苦瓜性别分化有关。     

三个品种家鸡催乳素基因cDNA的克隆及序列分析

从粤黄鸡、毛丝乌骨鸡及伊莎蛋鸡的垂体中快速抽提总RNA,根据国外已发表的肉用仔鸡乳素基因cDNA的序列,设计并合成了能与特定载体末端互补的1对引物,经反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）方法扩增获得了特异性片段。将扩增片段与线性化质粒pBSSK连接,克隆后进行序列分析,与已报道的肉用仔鸡、矮脚鸡和火鸡催乳素基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行了比较。结果表明,不同品种间核苷酸同源性介于93．97％－99．87％之间,其中丝毛乌骨鸡与矮脚鸡间的同源性最高为99．87％。推导的相应氨基酸序列的同源性在98．25％－100％之间,也是丝毛乌骨鸡与矮脚鸡间的同源性最高,为100％。在粤黄鸡、丝毛乌骨鸡和伊莎蛋鸡中,发现前两者的催乳素前体的cDNA片段推导的 氨基酸序列中信号肽裂触位点跟肉用仔鸡,矮脚鸡及火鸡的一样,为Leu-Pro-IIe-Cys,而伊莎蛋鸡的信号肽裂解位点则不一样,为Pro-Pro-IIe-Cys。此位点的差异可能导致催乳素前体翻译加工的不同,使伊莎蛋鸡无就巢性。这3个家鸡品种与国外的肉用仔鸡、矮脚鸡催乳素氨基酸序列还在以下位置出现差异：71、141、150、175。在肉用仔鸡、丝毛乌骨鸡催乳素氨基酸序列中还发现了一个肝素结合位点175－181（L－R－R－D－S－H－K）。     

全雌系苦瓜ACC氧化酶基因cDNA克隆及序列分析

为研究1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC氧化酶,ACO)基因在苦瓜性别分化中的作用,以全雌系苦瓜‘X-Hei-d-d’花蕾为试材,采用RT-PCR和RACE技术获得了ACC氧化酶基因(Mc-ACO1)的全长cDNA序列。该序列为1 137 bp(GenBank登录号:FJ459813),其完整开放阅读框长1 005 bp,编码334个氨基酸,预测分子量为37.30 kD,肽链N端缺失ACOs家族典型的1个保守区和2个保守二价铁离子/抗坏血酸依赖型双加氧酶氨基酸残基。序列分析表明,植物ACO基因的演化与其来源植物亲缘关系的一致性较高;与其他物种相比,苦瓜Mc-ACO1不同的氨基酸序列主要表现在肽链N端;苦瓜Mc-ACO1应属于黄瓜Cs-ACO2类成员,功能可能与性别分化相关。     

茶树HMG-CoA还原酶基因全长cDNA克隆及序列分析

香气是茶叶的重要品质之一,萜类物质不仅香气好,而且沸点普遍较高,是构成茶叶香气的重要物质基础,决定着茶叶的香气品质,也可作为茶叶香型划分的依据。在植物中,倍半萜、多萜醇等通过胞质中的甲瓦龙酸(MVA)途径合成。HMG-Co A还原酶(HMGR)催化HMG-Co A(3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A)生成甲瓦龙酸,是依赖MVA萜类合成途径的关键限速反应。为了有助于理解茶树萜类合成的分子遗传机制,通过RACE-PCR方法从茶树中克隆了一个编码HMG-Co A还原酶的c DNA全长序列(命名为Cs HMGR1),该序列由1 979 bp组成,包含一个1 722 bp的完整开放阅读框,编码573个氨基酸。其推定的编码蛋白与橡胶树、旱莲木、人参、荔枝、西洋参、丹参、罗汉果及龙眼的同源蛋白具有80%~82%的序列一致性。利用Cs HMGR1和其它物种HMGR同源蛋白的催化区域构建系统发育树,表明其属于真核生物I类HMGR家族。结构分析表明,Cs HMGR1含有两个跨膜区,推测其与其它真核生物同源蛋白类似地定位于内质网上;含有两个HMG-Co A结合位点、两个NADPH结合位点、四个保守的催化活性残基及一个磷酸化位点,说明磷酸化/去磷酸化很可能也是其活性调节的重要方式。表达分析表明,Cs HMGR1在"大叶龙"叶芽、母株叶芽及花芽都有较强的表达。其表达调控及生理活性对茶叶品质可能有重要影响,并在其功能解析的基础上,有可能作为茶叶品质鉴定及育种的一个依据。     

啤酒酵母AS2.1416海藻糖合成酶基因tps1的cDNA克隆及序列分析

海藻糖 (Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ,α ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ α 1,1 Ｄ ｇｌｕｃｏｐｙｒａ ｎｏｓｅ)是一种非还原性二糖 ,广泛存在于藻类、细菌、昆虫、无脊椎动物及酵母等许多生物体内。海藻糖除了作为一种储存性碳源外 ,业已被证明在许多逆境 ,诸如高温、高盐、干旱、重金属离子污染、冷冻、辐射等情况下 ,可以有效地保护生物的细胞膜、蛋白质及核酸[1～ 6] 。海藻糖合成酶为一多酶体系。在酵母细胞中 ,其合成分为两步进行。第一步 ,在 6 磷酸海藻糖合成酶 (Ｔｐｓ1)的作用下 ,由ＵＤＰ 葡萄糖和葡萄糖 6 磷酸合成海藻糖 6 磷酸 …     

辽宁碱蓬胆碱单加氧酶基因克隆及转基因烟草的耐盐性

甜菜碱是生物体内普遍存在的一种很有效的渗透调节剂.在高等植物中,甜菜碱由胆碱经两步酶催氧化得到,即:胆碱→甜菜碱醛→甜菜碱,催化第一步反应的酶是胆碱单加氧酶(choline monooxygenase,CMO).用RT-PCR和RACE技术从盐生植物辽宁碱蓬(Suaeda liaotungensis Kitag)中分离了CMO cDNA全序列,其中包括5′端非编码区123 bp, 3′端非编码区368 bp, 开放阅读框1 329 bp,编码一个由442个氨基酸构成的多肽,与菠菜、甜菜和山菠菜CMO的氨基酸序列同源性分别为77%、72% 和74%.克隆了其编码区,构建了植物表达载体pBI121-CMO,根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化烟草(Nictiana tabacum L.cv.89),获得卡那霉素抗性植株.PCR和Southern杂交均证明外源CMO基因已整合到烟草基因组中,转基因烟草的甜菜碱含量明显高于对照,转基因烟草膜的相对电导率明显低于对照,说明盐胁迫下转基因烟草的膜结构所受损伤小于对照,转基因烟草具有一定的耐盐性,能在含250 mmol/L NaCl的培养基中正常生长.     

蒙古牛BMPR-IB基因部分cDNA的克隆和序列分析

BMPR-IB基因主要在哺乳动物卵巢中表达,对卵泡的发育和分化起重要作用。该研究从影响卵巢生长发育和调控的BMPR-IB基因出发,以牛卵巢的RNA为模板,按照不同物种BMPR-IB基因的相似性设计特异引物,运用RT-PCR技术扩增并获得了特异片段,该片段经PCR、酶切和测序验证,证实所克隆序列为牛BMPR-IB序列,包含有953bp组成的部分cDNA序列,同源性分析结果表明,牛BMPR-IB基因序列与绵羊、山羊、人、猪、小鼠的BMPR-IB基因分别为98%、97%、92%、93%、88%的同源性。这为克隆其他物种的BMPR-IB基因提供了依据,同时牛骨形态发生蛋白的测序为更好地理解牛的生殖机理提供帮助。     

光叶楮肌动蛋白基因片段的克隆及其序列分析

目的:克隆构树Actin基因,为在分子生物学中研究外源基因在构树中的表达提供内参,为克隆和分析桑科其它植物的actin基因提供参考。方法:根据GenBank中一桑科植物桑树Actin基因的EST序列,设计引物,提取构树叶片总RNA,通过RT-PCR克隆目标片段。结果:获得一段大小为238bp的基因片段,经测序、同源性比较,这条片段的EST序列与桑树Actin基因、巴旦杏Actin基因的核苷酸同源性分别为96%、92%;氨基酸序列的同源性则分别为100%、98.73%。结论:通过实验结果分析表明获得了构树actin基因EST序列。     

大熊猫核糖体蛋白S11亚基基因(RPS11)cDNA的克隆及序列分析

RPS11是核糖体小亚基40S的组成部分,由RPS11基因所编码,属于核糖体蛋白S17p家族,主要存在于真核生物中.为了解大熊猫核糖体蛋白亚基RPS11基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基RPS11 基因的异同,本研究根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白S11亚基基因(RPS11)的相关信息设计引物,运用RT-PCR 技术从大熊猫的肌肉组织总RNA中成功克隆了核糖体蛋白亚基RPS11基因,并进行了测序和序列分析.结果表明:大熊猫RPS11亚基基因的开放阅读框(ORF)长为477 bp,编码158 个氨基酸的蛋白质,该蛋白的相对分子量为18.4275 kDa,pI为10.96.拓扑预测显示该蛋白含有14个功能位点:即2 个N-糖基化位点,6个蛋白激酶C磷酸化位点,4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点和1个核糖体蛋白S17 signature位点.进一步分析发现,大熊猫RPS11基因与已报道的部分哺乳动物的表达序列及其编码的氨基酸序列都具有很高的相似性.本研究结果为丰富和完善哺乳动物RPS11基因资源库提供了基础资料.     

新疆盐生植物的钙调蛋白基因克隆与序列分析

采用RT-PCR扩增的方法,从新疆盐生植物花花柴(Karelinia caspica)、盐爪爪(Kalidium foliadum)和盐桦(Betula halophila)中分别克隆获得了450bp的cDNA片段.基因测序和序列同源性分析的结果表明,所克隆的基因片段均包含了钙调蛋白基因完整的读码框架.新疆花花柴钙调蛋白基因与盐爪爪钙调蛋白基因同源性达86%,盐爪爪与盐桦同源性达86.77%,花花柴与盐桦同源性达85.11%.新疆盐生植物钙调蛋白基因与其它已发表的植物钙调蛋白基因同源性均在80%以上,显示植物钙调蛋白基因具有高度保守性.     

新疆3种藜科盐生植物NHX基因的克隆与序列分析比较

从新疆野生植物盐角草(Salicornia europaea)、盐爪爪(Kalidium foliatum)和盐穗木(Halostachys caspica)中分别克隆了约1.7kb的NHX基因cDNA片段,此片段均包含了NHX完整基因,三者之间有较高的同源性,盐角草NHX基因与盐爪爪NHX基因同源性达92.81%,盐角草与盐穗木同源性达92.19%,盐爪爪与盐穗木同源性达97.66%.它们与其它几种藜科盐生植物如滨藜、碱蓬、灰绿藜的NHX基因同源性也很高,达到80%以上,与拟南芥同源性也达到86%.此基因在植物尤其是藜科盐生植物中高度保守,其编码的功能性蛋白可能在影响植物耐盐中起作用.     

大熊猫生长激素受体(GHR)cDNA的克隆与序列分析

根据已报道的若干物种GHR 基因cDNA 序列设计引物, 利用RT- PCR 技术首次从大熊猫肝脏组织总RNA中扩增出GHR 基因编码区全长cDNA 序列, 克隆于pGEM®-T 载体后进行测序和序列分析。结果表明,大熊猫GHR 的ORF为1 917 bp , 编码638 个氨基酸的前体蛋白, 由18 个氨基酸的信号肽和620 个氨基酸的成熟肽组成,与人、狗、猪GHR 结构相似, 大熊猫GHR 成熟肽由246 个氨基酸的胞外区、24 个氨基酸的跨膜区和350 个氨基酸的胞内区组成, 并具GHR 的特征性结构。序列相似性比较显示, 大熊猫GHR 与哺乳类GHR 具有69 %～93 %的高序列相似性, 与爬行类和鸟类的序列相似性也达到60 % , 而与鱼类的序列相似性较低, 仅为30 %左右。与其它哺乳动物GHR 相比, 大熊猫GHR 在氨基酸序列上也存在明显的特异性。     

大熊猫LSM3 cDNA序列的克隆及序列分析

运用RT-PCR技术首次从大熊猫Ailuropoda melanoleuca的肌肉组织总RNA中成功克隆了LSM3的表达序列,并对其进行了测序及初步分析.结果 表明:大熊猫LSM3基因的表达序列含有一个完整的开放阅读框,长度为306 bp,编码102个氨基酸的蛋白质,分子量为11.845 kDa,pI为4.58,含有1个蛋白激酶C磷酸化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点和1个细胞附着序列.进一步分析发现,大熊猫LSM3基因的表达序列与已报道的部分哺乳动物具有很高的相似性,其编码的氨基酸序列与其他哺乳动物完全一致.     

鹅PPAR基因全长cDNA的克隆和序列分析

PPAR基因是近年发现的与脂类代谢有重要关联的核受体基因。本项研究参考鸡、人类、啮齿类等动物的PPAR基因序列,用RT-PCR方法首次获得了鹅PPARα和PPARγ基因的cDNA序列,2个基因CDS长度分别为1407bp和1428bp。鹅与鸡、人、鼠等5种动物PPARα基因、PPARγ基因CDS序列同源性分别为87.43%、92.00%,氨基酸序列同源性分别为93.38%、96.95%。进一步对包括鹅在内的17个物种PPAR基因的CDS序列进行同源性比较结果显示,PPAR基因不同亚型的同源性相对较低,为66.18%;PPAR基因相同亚型的同源性很高,PPARα、PPARγ和PPARβ（PPARδ）的同源性分别为84.80%、86.23%和 87.36%。这些研究结果反应了PPAR基因在进化过程中是保守的,并且不同的亚型在基因组成和功能上有一定的差异,它将有利于对PPAR基因与鹅生长及脂类代谢关系的进一步研究。Abstract:The peroxisome proliferator activated receptor (PPAR) belongs to a large family of nuclear receptors. This study was designed to clone and sequence analysis of cDNA encoding PPAR from goose .The RT-PCR method was developed to clone the cDNA, and the lengths of cDNA encoding PPARαand PPARγwere1407bp and 1428bp respectively. The cDNAs of the two genes were cloned and sequenced for the first time. The identities of CDS of PPARαand PPARγgene were 87.43% and 92.00% by homologous comparison among goose and other five species, and that were 93.38% and 96.95% in amino acid sequences. The further analysis among seventeen species including goose showed that the identities of PPAR genes were low(66.18%) among different sub-type (α、γ、β) of PPAR genes and that was high for the same sub-type of PPAR genes: PPARα、PPARγ and PPARβ（or PPARδ） were 84.80%、86.23% and 87.36% respectively. The results showed that these two genes are conservative in the process of evolution and has important physiological function for the growth and development of birds and mammals. The results of the present study will benefit the further study of relationship between PPAR genes and the growth and development, especially in fat metabolism of goose.