Studies on lytic activities of Chondrococcus coralloides (Myxobacteriales)

Summary When cells of Chondrococcus coralloides were grown on different bacteria and yeast as the only substrates, a pronounced lysis zone in the agar was observed after 3 days of incubation. Gelatine was liquified by the growing organism after 12 h. Enzyme preparations from the culture medium of Chondrococcus lysed only cells from Micrococcus lysodeikticus, at reasonable rates, and they were very active against casein and N--benzoyl-l-arginine-ethylester · HCl. The lytic activity in the culture medium decreased rapidly after the culture reached the stationary growth phase. A fifty-fold purification of the bacteriolytic activity was achieved by step-wise acetone precipitation. Chromatography of this preparation on Sephadex G-100 revealed the presence of four fractions, one proteolytic, two bacteriolytic and one fraction with both bacteriolytic and proteolytic activity. The bacteriolytic activity had a pH-optimum of pH 8, a stability optimum at pH 8 and was more stable in the alkaline region than in the acid. EDTA and Mg⁺⁺ inhibited the lysis. The proteolytic activity against N--benzoyl-l-arginine-ethylester · HCL had a pH-optimum of pH 7. The K _mof this reaction was 6.5×10^-4.

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Zusammenfassung Bei der Anzucht von Chondrococcus coralloides auf Agar, der diverse Bakterien und Hefen als das einzige Nährsubstrat enthielt, wurde nach 3 Tagen Kulturdauer ein deutlicher Lysishof sichtbar; Gelatine wurde nach 12 Std verflüssigt. Enzympräparationen aus dem Kulturmedium von Chondrococcus lysierten nur Micrococcus lysodeikticus-Zellen mit gut meßbarer Geschwindigkeit, sie waren sehr aktiv gegenüber Casein und N--Benzoyl-l-argininäthylester · HCL. Die lytische Aktivität im Kulturmedium sank sehr stark nach dem Erreichen der stationären Wachstumsphase ab. Eine 50fache Reinigung der bakteriologischen Aktivität konnte durch stufenweise erfolgende Acetonfällung erreicht werden. Eine Chromatographie dieser Präparation an Sephadex G-100 zeigte das Vorliegen von vier Fraktionen, einer proteolytischen, zweier bakteriolytischer und einer Fraktion mit bakteriolytischer und proteolytischer Aktivität. Die bakteriolytische Aktivität hatte ein pH-Optimum von pH 8, ein Stabilitätsoptimum von pH 8 und war im alkalischen Bereich stabiler als im sauren. EDTA und Mg⁺⁺ inhibierten die Lysis. Die proteolytische Aktivität gegenüber N--Benzoyl-l-argininäthylester · HCL wies ein pH-Optimum von pH 7 auf. Für diese Reaktion wurde eine K _mvon 6,5 · 10^-4 gefunden.

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Part of a Doctoral Thesis at the Fakultät für Bio- und Geowissenschaften der Universität Karlsruhe.     

Beobachtungen zum nicht-lytischen und lytischen Verhalten von Myxobakterien gegenüber anderen Mikroorganismen

Zusammenfassung In einer Rohkultur von Myxococcus rubescens wurde der sich ausbreitende Schwarm von einerAmöbenfront verfolgt und dabeivernichtet.An Phasenkontrastaufnahmen wird der Angriff von Myxobakterien —Einzell-Kulturen von Chondrococcus (Myxococus) coralloides und Nyxococcus rubescens auf Agarhängetropfen — auf zufällig als Randverunreinigung aufgetretene Eubakterienkolonien gezeigt.Die Beobachtungen sprechen gegen eine Schleimbildung der Myxobakterienzellen.Herrn Professor Dr. Alfred Kühn zum 70. Geburtstag gewidmet.     

Studies on a bacteriolytic enzyme of Archangium violaceum (Myxobacteriales)

Summary The bacteriolytic enzyme which is released by Archangium violaceum into the growth medium was purified 650-fold by precipitation with acetone, followed by fractionated precipitation with acetone and chromatography with Sephadex G200. The fractionation with gel chromatography separated three proteolytic enzymes from one with bacteriolytic activity. The bacteriolytic enzyme has a pH optimum of 6 in universal buffer, is more stable in the alkaline than in the acidic region, and has an optimal activity in 0.025M Tris-buffer at pH 7.1. The lytic activity of the enzyme against Micrococcus lysodeikticus is stimulated by low concentrations of certain bivalent cations and decreased by higher concentrations of the same reagents. The activity is inhibited by EDTA. p-Mercuribenzoic Acid and N-acetyl-glucosamine have no influence on the activity. The kinetics of the reaction follow the law of Michaelis and Menten, is of zero order reaction, and the activation energy of the rate determining step is 10.7 kcal.

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Zusammenfassung Das bakteriolytische Enzym, das aus der Nährlösung von Archangium violaceum isoliert wurde, konnte durch Aceton-Fällung, fraktionierte Aceton-Fällung und Chromatographie an Sephadex G-200 650 fach gereinigt werden. Bei der Fraktionierung durch Gelchromatographie wurde gezeigt, daß 3 proteolytische Enzyme, neben dem bakteriolytisch aktiven, an die Nährlösung abgegeben werden. Das bakteriolytische Enzym hat ein pH-Optimum in Universalpuffer bei pH 6, ist im alkalischen Bereich stabiler als im sauren und hat eine optimale Aktivität in 0,025M Trispuffer pH 7,1. Die lytische Aktivität gegenüber Micrococcus lysodeikticus wurde durch geringe Konzentrationen von Erdalkali-Ionen erhöht und durch höhere Konzentrationen derselben Ionen erniedrigt. EDTA verringerte die lytische Aktivität während p-Mercuribenzoesäure und N-Acetylglucosamin ohne Einfluß auf dieselbe waren. Die Reaktionskinetik folgt dem Gesetz von Michaelis u. Menten und ist in Übereinstimmung mit einer Reaktion nullter Ordnung. Die Aktivierungsenergie des geschwindigkeitsbestimmenden Schrittes beträgt 10,7 kcal.

     

Cellular fatty acid composition ofCorallococcus coralloides

The fatty acid composition of five strains ofCorallococcus coralloides and three reference species ofMyxococcus were determined by gas-liquid chromatography. Methyl esters of fatty acid containing from 12 to 22 carbon atoms were identified. The major fatty acids present were C₁₅ and C₁₇ saturated branched chain, and both C₁₆ saturated and unsaturated straight chain acids. The C₁₇ saturated branched and straight chain acids, which were in valuable concentration in species ofMyxococcus, were not, however, detected in all strains ofC. coralloides. The application of these results in the distinction ofC. coralloides from the genusMyxococcus is discussed.     

Über ein bakteriolytisches Enzym vonArchangium violaceum (Myxobacteriales)

Zusammenfassung In der Nährlösung von Kulturen vonArchangium violaceum konnten folgende Enzymaktivitäten nachgewiesen werden: bakteriolytische, proteolytische und gegen Hefe lytische. Die Abgabe dieser Enzyme war bei den untersuchten Stämmen unterschiedlich. Drei verschiedene Typen ließen sich unterscheiden, solche die Hefe und Bakterien auflösten, solche die nur Bakterien lysierten und lytisch inaktive. Die Aktivität des bakteriolytischen Enzyms ist von der jeweiligen Wachstumsphase abhängig, beim Eintritt in das Stadium mit geringerer Wachstumsgeschwindigkeit sinkt die Aktivität. Die Enzymproduktion ist in weitem Bereich unabhängig vom pH-Wert der Nährlösung.Archangium violaceum ist in der Lage, den pH-Wert des Nährmediums in beide Richtungen bis zu pH±0,4 zu verändern.

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Studies of a bacteriolytic enzyme of Archangium violaceum (Myxobacteriales)I. Enzyme activities in vivo under different conditions

Summary Three different types of enzyme activities could be shown in the medium ofArchangium violaceum cultures: a bacteriolytic one, one which lyses yeasts and proteolytic ones. The production of these enzymes varies among the strains examined. We found three types of them: one lysing yeasts as well as bacteria, one active only against bacteria and one that was lytically inactive. The bacteriolytic activity is dependent on the phase of growth and decreases when the culture reaches the stage of slower growth. The enzyme production is within a wide range independent of the pH of the medium.Archangium violaceum is able to alter the pH of the medium in both directions up to ±0.4.

     

Extracellular Lytic Enzymes of Myxococcus virescens II. Purification of Three Bacteriolytic Enzymes and Determination of their Molecular Weights and Isoelectric Points

The bacteriolytic enzymes produced by Myxococcus virescens and previously concentrated and separated from most of the non-bacteriolytic proteins have been further separated and purified. The bacteriolytic enzyme solution was concentrated by lyo-philization. When applied to a Sephadex G-100 column, three peaks of bacteriolytic activity were eluted. Polyacrylamide gel electrophoresis showed that all the three enzyme fractions were contaminated with at least four non-bacteriolytic proteins. In the first enzyme fraction the bacteriolytic enzymes could be freed from the contaminating proteolytic activity by adsorption on a hydroxylapatite column. The bacteriolytic enzymes could then be adsorbed on a CM-cellulose column. The remaining contaminating proteins passed the column un-adsorbed while the bacteriolytic enzymes could be eluted with a gradient of 0.02–0.10 M ammonium hydrogen carbonate solution. The second enzyme fraction was adsorbed on a CM-cellulose column and then eluted with 0.03–0.15 M NH4 HCO₃. After rechromatography on a new column under the same conditions, all of the contaminating proteins had disappeared. For purification of the third enzyme fraction chro-matography on one single CM-cellulose column was sufficient. The elution of the adsorbed enzymes was performed with a gradient of 0.15–0.30 M NH₄HCO₃. The recovery of activity for each of the ion-exchange chromatography separations was at least 90%. The purity of the enzymes was tested by polyacrylamid gel electrophoresis. Each of the purified enzymes gave only one coloured band which coincided with the enzyme activity assayed in sliced gels. The molecular weights of the enzymes were determined by electrophoresis on acryl-amide gels containing sodiumdodecylsulphate. The molecular weights determined in this way (about 40,000, 30,000 and 20,000, respectively) were about 10,000 daltons higher than those obtained by gel chromatography on Sephadex G-100. This discrepancy seems to depend on interactions between the enzymes and the dextran molecules probably caused by the strongly basic nature of the enzymes or by formation of enzyme-substrate complexes.     

Extracellular Lytic Enzymes of Myxococcus virescens

The aim of the investigation was to obtain large amounts of the bacteriolytic enzymes of Myxococcus virescens and to separate these enzymes from the non-bactcriolytic protemases produced by this organism. The bacteria were grown in Casitone broth. When the bacteriolytic activity had reached its maximal value, the cells were removed from the culture medium by centrifugation. Polyethylene glycol 4000 (20 g/1) and potassium phosphate (about 210 g/1) were added to the cell-free solution. The additions resulted in the formation of two liquid phases. The bottom layer was removed, and polyethylene glycol was added to it at a final concentration of 10 g/1. Again two liquid phases formed. The two top phases thus obtained were pooled and 1.6 volumes of cold acetone were added to the mixture. The precipitate formed was dissolved in water and desalted on a Sephadex G-25 column. The desalted protein solution was applied to a carboxymethyl-cellulose column equilibrated with 0.025 M sodium phosphate buffer of pH 6.0. Most of the proteins and the proteinases but none of the bacteriolytic enzymes passed the column unadsorbed. The column was washed with 0.05 M glycine-NaOH buffer of pH 8.8, whereupon the adsorbed bacteriolytic enzymes together with small amounts of proteinases and other proteins were eluted with 0.2 M ammonium carbonate. The material not adsorbed on the CM-cellulose column contained 22 % of the proteolytic activity of the initial cell-free solution and had a 26-fold higher specific activity. The enzyme solution eluted with carbonate contained 24 and 0.3 %, respectively, of the initial bacteriolytic and proteolytic activities. The specific activity of the bacteriolytic enzyme system was about 5000-fold higher than that of the original solution.     

Der cytochemische Nachweis von Prolin-Dehydrogenasen,Acetaldehyd-Dehydrogenasen und Dihydroliponsäure-Dehydrogenase in den Zellen vonSaccharomyces cerevisiae

Summary Using the tetrazolium salt Nitro-BT, the following dehydrogenases can be demonstrated cytochemically in the cells ofSaccharomyces cerevisiae: (1)Proline dehydrogenase activity: it cannot be decided whether the formazan production is a result of L-proline: NAD(P)-2-oxidoreductase (E.C. 1.5.1.1) or of L-proline:NAD(P)-5-oxidoreductase(E.C. 1.5.1.2); (2)Aldehyde dehydrogenase activity: using the coenzymes NAD and NADP and the activators KCl and MgCl₂, different reaction pictures are obtained which led to the conclusion that aldehyde: NADP oxidoreductase (E.C. 1.2.1.4) and aldehyde: NAD(P) oxidoreductase (E.C. 1.2.1 5) can be demonstrated seperately; (3)Dihydrolipoic dehydrogenase (E.C. 1.6.4.3): an exactly controlled pH level (pH 6.0) of the complete incubation medium is an essential prerequisite for the specificity of the reaction. The formation of filamentous formazan deposits can be interpreted as the expression of the mitochondrial localization of the enzyme.Zusammenfassung In den Zellen vonSaccharomyces cerevisiae lassen sich mit Hilfe des Tetrazoliumsalzes Nitro-BT cytochemisch nachweisen: 1. eineProlin-Dehydrogenasen-Aktivität, wobei nicht entschieden werden kann, ob die Formazanbildung durch L-Prolin: NAD(P)-2-Oxydoreduktase(E.C. 1.5.1.1) oder durch L-Prolin: NAD(P)-5-Oxydoreduktase(E.C. 1.5.1.2) hervorgerufen wird; 2. eineAldehyd-Dehydrogenasen-Aktivität: durch Einsatz der Coenzyme NAD und NADP sowie der Aktivatoren KCl und MgCl₂ erhält man unterschiedliche Reaktionsbilder, so daß die Annahme gerechtfertigt erscheint, daß hiermit Aldehyd: NADP-Oxydoreduktase(E.C. 1.2.1.4) und Aldehyd: NAD(P)-Oxydoreduktase (E.C. 1.2.1.5) getrennt nachweisbar sind; 3. dieDihydroliponsäure-Dehydrogenase (NAD-H₂:Lipoamid-Oxydoreduktase, E.C. 1.6.4.3): bei diesem Enzymnachweis ist eine exakte Einstellung des pH-Wertes des Mediums auf 6,0 die Voraussetzung für die Spezifität. Die Bildung länglicher Formazanablagerungen in den meisten Zellen deutet auf die mitochondriale Lokalisation des Enzyms hin.

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Frau Prof. Dr. B.Haccius danke ich für die großzügige Unterstützung bei der Durchführung dieser Untersuchungen. Die Brotfabrik Grahamhaus Studt KG., Bad Kreuznach, stellte einen Arbeitsplatz zur Verfügung, wofür ich auch an dieser Stelle danken möchte.     

Effect of Fatty Acids on the Activity of Bacteriolytic Enzymes

The ability of fatty acids to sensitize gram-negative and gram-positive bacterial cells to the action of bacteriolytic enzymes was studied. By synergetic effects between bacteriolytic enzymes and fatty acids isolated from Myxococcus such bacteria, which were otherwise resistant to the enzymes, could be lysed. Isobranched and unbranched acids with 11–15 carbon atoms were active and could sensitize Bacillus megaterium and Aerobacter aerogenes to the action of bacteriolytic enzymes from myxobacteria and to lysozyme. The sensitizing activity of tetradecanoic acid was enhanced with increasing concentration even after the solution was saturated. Neither ethylene diaminetetraacetate (0.1 and 1 mM) nor Triton X-100 (1 0/00) could sensitize resistant bacteria to the action of bacteriolytic enzymes. However, they were active in combination and they could also increase the effect of tetradecanoic acid.     

Vorkommen und Eigenschaften der Carbonsäureesterasen im Hepatopankreas und Magensaft des Flußkrebses Astacus astacus (L.) und Cambarus affinis (Say)

Zusammenfassung Es wurden die Esteraseaktivitäten in wäßrigen Mitteldarmdrüsenextrakten und in Magensaft(MS)-Sammelproben mehrerer Flußkrebse [Astacus astacus (L.) und Cambarus affinis (Say)] quantitativ bestimmt. Die höchsten Aktivitäten enthält das Astacus-Hepatopankreas (HP), das, gemessen an der Hydrolyse der optimalen Substrate, 10- bis 23mal aktiver ist als das Cambarus-HP und 171-bis 247mal aktiver als der Magensaft beider Krebsarten. Das pH-Optimum der HP-Esterase-Wirkung liegt zwischen pH 8 und 9, das der sehr gering aktiven Magensaftesterase bei pH 6,0 (für Tributyrin) bzw. 7,5–8,5 (für Phenylacetat und-butyrat). Die unter Verwendung von 21 Estersubstraten näher untersuchte Substratspezifität der Astacus-HP-Esterase ergab eine Affinität für aliphatische und Phenyl sowie Naphthyl-Ester der C₃- bis C₅-Fettsäuren. Die Esterase ist relativ thermostabil, durch E 600, NaF und Eserin stark hemmbar und zeigt keine Cholataktivierung. Durch Sephadex-Gelfiltration wird die HP-Esterase in zwei Aktivitätsgipfel aufgetrennt (K _d -Werte von Sephadex G-200: 0,083 bzw. 0,5–0,52), die die gleiche Substrat und Inhibitor-Spezifität aufweisen. Im Agargelelektropherogramm des HP sind vier Esterasezonen, im Pherogramm des MS nur eine schwache Esterasezone mit -Naphthylbutyrat als Substrat nachweisbar. Die MS-Esterase besitzt die gleiche Wanderungsgeschwindigkeit wie die am weitesten anodisch wandernde schwächste HP-Esterasebande.

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Occurrence and properties of the carboxylic esterases in hepatopancreas and gastric juice of the crayfish Astacus astacus (L.) and Cambarus affinis (Say)

Summary The esterase activities of hepatopancreas extracts and gastric juice from the crayfish Astacus astacus (L.) and Cambarus affinis (Say) were determined quantitatively. Astacus-hepatopancreas contains the highest activities. It is 10 to 23 times more active than Cambarus-hepatopancreas and 171 to 247 times more active than gastric juice of the two species. The pH-optimum of the hepatopancreas esterase action was found to be between pH 8 and 9, that of the very weak gastric juice esterase at pH 6.0 and pH 7.5 to 8.5 with tributyrin and phenyl acetate and butyrate respectively. Substrate specifity studies with 21 ester substrates showed that the Astacus-hepatopancreas esterase posseses a high affinity towards phenyl, naphthyl and aliphatic esters of C₃- to C₅-chain fatty acids. The esterase is relative thermostabil, E 600, NaF, and eserine sensitive and was not activated by cholate. By means of Sephadex gelfiltration the hepatopancreas esterase was separated in 2 fractions (K _d -values on Sephadex G-200: 0,083 and 0.5 to 0.52 respectively) with identical substrate and inhibitor specificity. About four zones of esterase activity may be detected in hepatopancreas extracts and only one weak esterase zone in gastric juice by agar-gel electrophoresis (substrate: -naphthylbutyrate). The electrophoretic mobility of the gastric juice esterase is identical with that of the fastmoving anodal and weakest esterase component of hepatopancreas.

     

A bacteriolytic enzyme from Chaetomium globosum,a marine-isolate

Summary When a marine-isolate, Chaetomium globosum was cultivated in a medium with an increased MgCl₂ content, a bacteriolytic enzyme was extracellularly produced. The enzyme was purified approximately 130-fold. It lyzed Staphylococcus aureus, Micrococcus lysodeikticus and several other Gram-positive bacteria. Optimal pH and temperature for the lysis were 8.0 and 37°C, respectively. The enzyme was heat-labile with maximum stability at neutral pH. Enzymatic activity was greatly stimulated by NaCl and CaCl₂ with maximum activity obtained in the presence of 0.1 M NaCl and 0.003 M to 0.005 M CaCl₂. The activity was stimulated by SH-compounds and was inhibited by SH-reactants.The enzyme is an N-acetylhexosaminidase.     

Die Aktivität der Polyphenoloxydase als Erbmerkmal und ihre Beziehung zur genetisch bedingten Krankheitsdisposition beim Tabak

Zusammenfassung Der Charakter der Polyphenoloxydase-Aktivität als Erbmerkmal wurde aus folgenden Tatsachen geschlossen: Der Unterschied in der Aktivität dieses Fermentes zwischen 2 Sorten blieb über die ganze Vegetationszeit erhalten und wiederholte sich in ihren Nachkommen. In der F₁ zeigte sich deutliche Dominanz der geringeren Aktivität.Es besteht kein Zusammenhang zwischen Polyphenoloxydase-Aktivität und Anfälligkeit fürPeronospora tabacina, denn beim Vergleich je einerPeronospora-resistenten und einer anfälligen Sorte war einmal die anfällige und einmal die resistente die fermentaktivere. Die Unterschiede in der Aktivität der Polyphenoloxydase ließen also kein Prinzip erkennen.Zwischen der Polyphenoloxydase-Aktivität und der Y-Virus-Anfälligkeit dagegen konnte ein deutlicher Zusammenhang festgestellt werden. Die Unterschiede in der Aktivität der Polyphenoloxydase je einer Y-Virus-resistenten und einer anfälligen Sorte verhielten sich gleichsinnig: Die resistenten hatten eine höhere Polyphenoloxydase-Aktivität als die anfälligen Sorten.Die Frage nach der Art des Zusammenhangs zwischen Y-Virus-Disposition und Polyphenoloxydase-Aktivität wurde diskutiert: Es kann kein ursächlicher sein in der Weise, daß Y-Virus-Anfälligkeit von der Polyphenoloxydase-Aktivität abhänge, sondern er muß nach den vorliegenden Versuchsergebnissen als indirekter gedeutet werden derart, daß beide Erbmerkmale, Y-Virus-Anfälligkeit und Polyphenoloxydase-Aktivität von einer gemeinsamen, gengesteuerten dritten Größe abhängen. Die Polyphenoloxydase-Aktivität wird damit als bloßes Anzeichen der physiologischen Aktivität der betreffenden Sorte betrachtet, ohne selbst einen direkten Einfluß auf die Krankheitsdisposition zu haben.

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Summary consequent on the following facts polyphenoloxidase activity proved to be a hereditary quality: The difference of activity between two varieties endured during the whole vegetation time and replicated in their descendants. In F₁ generation dominance of lower activity appeared.There is no relation between polyphenoloxidase activity and susceptibility toPeronospora tabacina, for comparing everyPeronospora susceptible variety with a resistent one, no regularity could be observed: Once the susceptible variety and another time the resistant possessed the higher enzyme activity.Between polyphenoloxidase activity and Y Virus disposition a clear relation became evident: The resistant varieties possessed a higher activity of this enzyme than the susceptible ones.The question is discussed how to explain this relation between polyphenoloxidase activity and Y Virus disposition. It can not be a causal one in this way that Y Virus susceptibility should depend on polyphenoloxidase activity. Relation must be an indirect one in this way that both hereditary qualities: Y Virus and oxidase activity depend on the same third gene-dependant but unknown quantity. Thus polyphenoloxidase activity is considered to act only as an indicator of physiological processes in the plant without itself having a direct influence on the disposition to Y Virus disease.

     

Spectrophotometric detection of bacteriolytic activity of diluted lysostaphin solutions

Turbidimetric method with spectrophotometric detection of changes in density of test bacteriaS. aureus strain SA 812 for determination of bacteriolytic activity of lysostaphin was employed. Results of two evaluations are compared: (1) calculation of the relative value of turbidity decrease on the basis of the difference of absolute values ofA ₅₄₀ at the beginning of reaction and after the incubation period, (2) following of time changes inA ₅₄₀ by monitoring the course of reaction directly in the constant-temperature cuvette of the spectrophotometer at 37°C. Both arrangements yielded identical results, within the significance level of 0.05. With concentrated samples both methods yield reliable results; with diluted samples the accuracy of the “absolute” method decreases together with decreasing lysostaphin concentration much faster than with the “registration” method. The registration method makes it possible to detect even minute amounts of the lytic enzyme and thus to distinguish the values of activity in dilute samples even when data obtained by means of the “absolute” method cannot be considered as reliable. A unit of bacteriolytic activity can be expressed from the kinetic curve as an amount of enzyme preparation causing ΔA ₅₄₀/min=0.01.     

Stoffwechselleistung und Enzymaktivität bei Chlamydobotrys (Volvocales)

Zusammenfassung In Versuchen mit Chlamydobotrys, dessen Stoffwechsel vor allem von der Photoassimilation von Acetat abhängt, konnte gezeigt werden, daß Änderungen der Leistung bei der Photoassimilation von Acetat und dessen oxydativem Dunkel-Stoffwechsel von ähnlichen Änderungen der Aktivität gewisser Enzyme begleitet sind. Während des optimalen Wachstums des Organismus auf Acetat ist die Fähigkeit zur Photoassimilation von CO₂ sehr gering, was mit einer niedrigen Aldolaseaktivität einhergeht. Nach Übertragung der Algen auf ein acetatfreies Medium nehmen Photoassimilation von CO₂ und Aldolaseaktivität zu. Eine maximale Aldolaseaktivität konnte nur erzielt werden, wenn eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) die Synthese von aktivem Enzymprotein ermöglicht.

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Summary In experiments with Chlamydobotrys, the metabolism of which depends mainly on the photoassimilation of acetate, changes in the metabolic activity for the photoassimilation of acetate and its oxidative dark-metabolism could be shown to be accompanied by similar changes in the activity of certain enzymes. During optimal growth of the organism on acetate the ability for photoassimilation of CO₂ is extremely weak which is corresponded by low aldolase-activity. After transferance of the algae to an acetatefree medium the photoassimilation of CO₂ and the aldolase-activity rise. Maximum aldolase-activity could only be obtained, if a nitrogen-source (NH₄Cl) makes possible a synthesis of active enzyme-protein.

     

Eigenschaften der NAD-spezifischen Hydrogenase aus Hydrogenomonas H 16

Zusammenfassung Aus zellfreiem Extrakt von Hydrogenomonas H 16 wurde die lösliche Hydrogenase 45 fach bis zu einer spezifischen Aktivität von 36500 E/g Protein angereichert. Das Enzym katalysiert die Reduktion von NAD mit molekularem Wasserstoff. Ein Cofaktorbedürfnis konnte nicht festgestellt werden. Der Einfluß von NADH, ATP, Bicarbonat und Magnesium auf die hydrogenasekatalysierte NAD-Reduktion war unerheblich. Das angereicherte Enzym ist flavin- und pyridinnucleotidfrei und reagiert mit NAD, nicht mit O₂, NADP, FMN, FAD oder Methylenblau. Die drei letztgenannten Wasserstoff-Acceptoren werden lediglich in Gegenwart katalytischer Mengen NAD reduziert. Die lag-Phase der Reduktion von NAD läßt sich durch Vorinkubation des Enzyms mit NADH oder Wasserstoff, nicht jedoch mit NAD eliminieren. Die Hemmung der Hydrogenasereaktion durch Sauerstoff ist gering. Reduzierende Agenzien wie Mercaptoäthanol oder Sulfid setzten die Reaktionsrate herab.Die Michaeliskonstante der löslichen Hydrogenase für molekularen Wasserstoff beträgt K _m ^H2 =1,9·10^–4 M. Die NAD-Konzentration, bei der halbmaximale Aktivität erreicht wird, beträgt [NAD]_{0,5 (V)}=1,3·10^–4 M. Das pH-Optimum wird in 0,05 M Kaliumphosphat-Puffer bei pH 8,5 und in 0,05 M Tris-HCl-Puffer bei pH 7,9 erreicht. Unter den angegebenen Bedingungen lag das Temperatur-Optimum bei 36°C. Die Aktivierungsenergie der löslichen Hydrogenase wurde als 10,4 kcal/mol ermittelt.

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Properties of the NAD-Specific Hydrogenase from Hydrogenomonas H 16

Summary A soluble hydrogenase from cell-free extracts of Hydrogenomonas H 16 has been purified 45-fold up to a specific activity of 36,500 units per g protein. The enzyme catalyzes the reduction of NAD with molecular hydrogen. It does not require cofactors. The NAD-reduction catalyzed by this enzyme is influenced to only a small extent by the presence of NADH, ATP, bicarbonate or magnesium ions. The enzyme is free from flavins and pyridine nucleotides, reacts only with NAD and not with oxygen, NADP, FMN, FAD or methylene blue. FMN, FAD and methylene blue are reduced only in the presence of catalytic amounts of NAD. The lag-phase of the reduction of NAD can be eliminated by preincubating the enzyme in the presence of NADH or molecular hydrogen; NAD is ineffective. The inhibition of the hydrogenase reaction by oxygen is negligible. Reducing agents such as mercaptoethanol or sulfide decreased the reaction rate.The Michaelis constant of the soluble hydrogenase for molecular hydrogen is K _m ^H2 =1.9·10^–4 M. Half maximal activity is attained at a NAD-concentration of [NAD]_{0.5 (V)}=1.3·10^–4 M. The pH-optimum is 8.5 in 0.05 M potassium phosphate buffer and 7.9 in 0.05 M Tris-HCl-buffer; reaction rates were maximal at 36°C under the conditions employed. The activation energy was calculated to be 10.4 kcal/mol.

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Abkürzungen E Enzymeinheit (mole Substrat/min) - E _x Extinktionsänderung bei der Wellenlänge x nm - Ext._x Extinktion bei der Wellenlänge x nm - KP Kaliumphosphat (KH₂PO₄-K₂HPO₄-Gemisch) - MB Methylenblau - NAD Nicotinamid-adenin-dinucleotid - NADH reduziertes - NAD; TEAE Triäthylaminoäthyl - Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan     

Enzyme des Fettsäureabbaus in den Organen des Flußkrebses Orconectes limosus Rafinesque

Zusammenfassung In den Organen des Flußkrebses wurden drei Enzyme der Fettsäureoxydation festgestellt: Crotonase (E.C.: 4.2.1.17), Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase (HAD. E.C.: 1.1.1.35) und Ketoacyl-thiolase (KAT, E.C.: 2.1.3.9).Eigenschaften der HAD und KAT bei unseren Testbedingungen werden geschildert. Im großen und ganzen ähneln die Enzyme in ihren Eigenschaften den Wirbeltierenzymen. Im Gegensatz zu den Wirbeltierenzymen zeigt die HAD des Flußkrebses auch mit NADPH₂ Aktivität (50–75% der Aktivität mit NADH₂). Mit 10^–3 und 2·10^–3 M o-Phenanthrolin wird nur die Aktivität gegen NADPH₂, nicht die gegen NADH₂, gehemmt.Bei unseren Präparationsbedingungen befinden sich 80–90% der Gesamtaktivität der HAD und KAT im 20000 g-Überstand.Hohe spezifische Aktivitäten der HAD und KAT findet man in Herz, Antennendrüse und Darm, niedrige vor allem im Schwanzmuskel.HAD und KAT sind auch in den Organen des Flußkrebses proportionskonstante Enzyme. Durch Quotienten aus Aktivitäten von Schlüsselenzymen des Fettsäureabbaus, der Glykolyse und des Citratcyclus wurden die Organe hinsichtlich ihres energieliefernden Stoffwechsels charakterisiert.

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Enzymes of fatty acid oxidation in the organs of the crayfish orconectes limosus Rafinesque

Summary Three enzymes of fatty acid oxidation have been detected in the organs of the crayfish: Crotonase (E.C.: 4.2.1.17),Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase (HAD, E.C.: 1.1.1.35) and Ketoacyl-thiolase (KAT, E.C.: 2. 1. 3. 9.).The properties of HAD and KAT have been investigated at the conditions of our tests. In general the enzymes of the crayfish resemble to those of vertebrates. In contrary to the HAD of vertebrates the HAD of the crayfish shows activity not only with NADH₂ but also with NADPH₂ (50–75% of the activity with NADH₂). The activity with NADPH₂ is inhibited by 10^–3 and 2·10^–3 M o-phenanthroline, the activity with NADH₂ is not.In our preparations 80–90% of the total activity was localized in the 20 000 g — supernatant.High specific activities of HAD and KAT are found in the heart, antennal gland and the intestine, low predominantly in the abdominal muscle.As in vertebrates and insects HAD and KAT in the different organs have constant proportions in their activities. The organs of the crayfish are characterized with regard to their energy supply by help of quotients of the activities of keyenzymes of fatty acid oxidation, glykolysis and citrate cycle.

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Fräulein C. Kretschmer, Herrn H. Förstel und meiner Frau danke ich für zuverlässige Mitarbeit.     

Versuche zur Charakterisierung der larvalen Blutproteine normaler und letaler Genotypen vonDrosophila mittels Papier-Elektrophorese

Zusammenfassung Die Papier-Elektrophorese der larvalen Blutproteine von normalen und letalen Genotypen vonDrosophila melanogaster undDrosophila hydei läßt stets zwei verschieden rasch wandernde Proteinfraktionen erkennen; diese zeigen bei der quantitativen Auswertung beträchtliche Unterschiede. Der isoelektrische Punkt der beiden Fraktionen liegt beip _H 6,7 und beip _H 7,0.Um die Koagulation der Hämolymphe in vitro zu charakterisieren, wird deren Zeit- und Temperaturabhängigkeit gemessen. Im beobachteten Temperaturintervall von 2 bis 58° C verläuft die Koagulation endotherm; sie bleibt unbeeinflußt durch Zusätze von Heparin und Monochloressigsäure.Wir verdanken die Mitarbeit von Frau Dr. E. Gloor und Frl. Dr. Brunold sowie die technische Mithilfe von Frl. R. Salzmann.     

Vorkommen und Eigenschaften der proteolytischen Enzyme des Magensaftes und der Mitteldarmdrüse des Flußkrebses Astacus astacus (L.) und Cambarus affinis (Say)

Zusammenfassung Es wird die Proteinasewirkung des Magensaftes und des Hepatopankreas vom Flußkrebs (Astacus astacus L. und Cambarus affinis Say) mittels 5 spezifischer Trypsin- und 6 spezifischer Chymotrypsinsubstrate quantitativ bestimmt und seine kinetischen Eigenschaften eingehend untersucht. Magensaft enthält eine hochaktive Trypsinwirkung, die eine besonders hohe Affinität zu Toluolsulfonylargininmethylester (TAME) besitzt. Chymotrypsinaktivität findet sich im Magensaft nur in Spuren (1,1% der Benzoylargininäthylester (BAÄE)- bzw. 0,13% der TAME-Spaltung; Substrat: Acetyltyrosinäthylester). Auf Grund der mit Pankreastrypsin gut übereinstimmenden K _M-Werte, pH-Optima, Temperaturcharakteristica, der 100% igen Inhibierung durch TLCK und K _d-Werte (auf Sephadex G-100 bestimmt) wird die Krebsmagensaftproteinase als ein trypsinähnliches Enzym (Magensafttrypsin) angesehen. Unterschiede zum Rindertrypsin bestehen in seiner Säurelabilität und Alkalistabilität, seiner relativen Unempfindlichkeit gegenüber Sojabohnentrypsininhibitor (gemessen an der TAME- oder BAÄE-Hydrolyse) und 2- bis 3mal stärkeren Hemmbarkeit durch Trasylol (Bayer), sowie seiner großen Zeitstabilität und schwachen Hemmbarkeit durch Ca⁺⁺. Gelfiltration des Magensaftes auf Sephadex G-100 oder G-75 ermöglicht vollständige Abtrennung der Arylamidase-, jedoch nicht der Carboxypeptidase-Wirkung vom Magensafttrypsin, das hierbei um das dreifache angereichert wird. Im Gegensatz zum Magensaft finden sich im Hepatopankreas nur Trypsinspuren (0,26% der Magensaft-TAME-ase). Die besonders im Hepatopankreas nachgewiesene Tyrosinäthylesterspaltung (33mal höher als im Magensaft) wird auf die ebenfalls im alkalischen Bereich optimal wirksame Carbonsäureesterasewirkung zurückgeführt.

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Occurrence and properties of proteolytic enzymes in the gastric juice and hepatopancreas of the crayfishes Astacus astacus (L.) and Cambarus affinis (Say)II. Endopeptidases

Summary The proteinase action of the gastric juice and hepatopancreas of the crayfish (Astacus astacus L. and Cambarus affinis Say) was quantitatively determined by means of 5 specific trypsin substrates and 6 specific chymotrypsin substrates; furthermore the kinetic properties of this enzyme were determined exactly. Gastric juice contains a high activity towards p-toluenesulfonyl-l-arginine methyl ester (TAME). In contrast, chymotrypsin activity (substrate: N-acetyl-l-tyrosine ethyl ester) was very weakly (1,1% of the N-benzoyl-l-arginine ethyl ester (BAEE)- and 0,13% of the TAME-splitting activity). The gastric juice proteinase was considered as a trypsin-like enzyme (gastric juice trypsin) because of its good accordance with pancreas trypsin with respect of K _M-values, pH optima, temperature characteristics, completely inhibition by TLCK, and K _d-values (determined on sephadex G-100). Differences to bovine trypsin exist in its acid lability and alkali stability, its relative insensitiveness to soy bean trypsin inhibitor (measured with TAME or BAEE as substrates), its 2 to 3 times stronger inhibition by Trasylol (Bayer), and its remarquable time-stability. The enzyme was slightly inhibited by Ca⁺⁺. Gelfiltration on Sephadex G-100 or G-75 of the gastric juice results in a complete separation of the arylamidase activity from the trypsin activity. By this procedure trypsin was 3 fold purified. No resolution between carboxypeptidase and trypsin was achieved. In contrast to gastric juice the hepatopancreas contains only traces of trypsin activity (0,26% of gastric juice TAME-ase). The tyrosine ethyl ester splitting activity occurs predominantly in hepatopancreas (33 times more active as in gastric juice). This activity was referred to the carboxylic acid esterase which is also optimal active in the alkaline region.

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Für die Durchführung der kolorimetrischen Bestimmungen möchte ich der med.-techn. Assistentin Frl. Johanna Hahn meinen herzlichsten Dank aussprechen.     

Diffusible fruiting factor in Myxococcus coralloides and Myxococcus fulvus

Myxococcus coralloides ATCC 25202 and Myxococcus fulvus ATCC 23093 produced an extracellular diffusible factor during fruiting body formation. This factor acted to shorten the lag time before the appearance of aggregates and to increase the number of aggregates for both species. The factor from M. coralloides presented a more selective activity on the aggregation of this species.     

Genetics of resistance to organophosphorus compounds and low ali-esterase activity in the housefly

The relation between low ali-esterase activity and organophosphate resistance was studied in a malathion and a diazinon resistant strain of houseflies by a system of repeated back-crosses with a susceptible strain. In the malathion resistant strain G, low ali-esterase activity and resistance are dependent on one and the same autosomal gene. In the diazinon resistant strain F one gene is responsible for the low esterase activity and part of the resistance, whereas at least one other resistance factor is present not affecting the esterase activity. Two subcolonies were obtained, one which is called F_a with only the gene for low ali-esterase activity, the other, called F_b, without this gene but with another resistance factor. Since Nguy and Busvine found a single gene to be responsible for resistance in three other strains, a total of five strains has now been found to have an important gene for low esterase activity and resistance to phosphate compounds. These genes, which differ in the degree or specificity of the resistance they confer to the strains, are probably all alleles. It is concluded that physiologically closely related defence mechanisms must be responsible for these different kinds of resistance.

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Zusamenfassung Der Zusammenhang zwischen niedriger Aliesterase-Aktivität und Phosphorester-Resistenz wurde in einem gegen Malathion und einem gegen Diazinon resistenten Stamm von Musca domestica mit Hilfe eines Systems wiederholter Rückkreuzungen mit einem normalsensiblen Stamm studiert. In dem Malathion-resistenten Stamm sind niedrige Aliesterase-Aktivität und Resistenz von ein und demselben autosomalen Gen abhängig. In dem Diazinon-resistenten Stamm F ist ein Gen für niedrige Esterase-Aktivität und einen Teil der Resistenz verantwortlich, während mindestens ein weiterer Faktor für Resistenz ohne Einfluß auf die Esterase-Aktivität vorhanden ist. Zwei Stämme wurden gezüchtet: einer, F_a genannt, nur mit dem Gen für niedrige Esterase-Aktivität, und der andere, F_b ohne dieses Gen, aber mit einem anderen Resistenzfaktor.Da Nguy und Busvine in drei Stämmen je ein einziges für die Resistenz verantwortliches Gen gefunden haben, sind nun insgesamt fünf Stämme mit einem wichtigen Gen für niedrige Esterase-Aktivität und Phosphorester-Resistenz beschrieben worden. Diese Gene, die sich nach dem Grade und der Spezifität der Resistenz, die sie bewirken, unterscheiden, sind wahrscheinlich alle Allele. Es wird daraus geschlossen, daß für diese verschiedenen Arten von Resistenz physiologisch nahe verwandte Abwehr-Mechanismen verantwortlich sein müssen.