水产动物常见病原菌的耐药性分析及中草药体外抑菌活性的检测

目的了解安徽省水产动物常见病原菌的耐药现状和耐药机制,探讨27种单味中草药和5个中草药复方配伍对耐药菌株的体外抑菌活性。方法分别采用K-B纸片琼脂扩散法和双纸片增效法检测常见病原菌的耐药性和ESBLs,同时使用平板打孔法和改良微量稀释法检测中草药的体外抑菌活性。结果4种常见病原菌的23个分离株对常用的5类抗生素均呈现不同程度的耐药性,其中铜绿假单胞菌的耐药谱最广,对14种抗生素的耐药率均为100%。供试菌中仅检出2株铜绿假单胞菌为产ESBLs株,检出率为8.69%。黄连、大黄、金银花、夏枯草、地锦草、丹皮、马齿苋和连翘8种中草药对供试耐药株均有较强的抑制活性,其中黄连、大黄和金银花的抑菌活性尤为明显,其MIC值分别介于1.96~125 g/L、7.84~125 g/L和15.68~250 g/L。5个复方配伍中以复方5的配伍效果最好,其MIC值为1.96~15.68 g/L,抑菌活性显著优于单味药;其次是复方1和复方3,其MIC值为1.96~62.72 g/L;复方2和复方4的配伍效果差,其MIC值为31.36~125 g/L。结论4种23株常见病原菌均为耐药菌株,产生ESBLs是铜绿假单胞菌高度多重耐药的主要机制之一。黄连、大黄、金银花和复方5配伍对常见病原菌耐药株具有良好的抑菌活性。     

六种中药及其复方对鳗鲡致病性气单胞菌的体外抑制作用

针对病鳗内脏中分离的5 株致病性气单胞菌, 采用琼脂稀释法测定五倍子、石榴皮、大黄、虎杖、黄芩及黄连各味中药的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC); 再根据棋盘法设计15 种双联用药方和4 种三联用药方, 同样检测各组合配方的抑菌作用。实验结果表明, 6 味中药对养殖鳗鲡5 株致病性气单胞菌均有不同程度的抗菌效果, 其中五倍子的抑菌作用最强, 其次是大黄和石榴皮, 而黄连的抑菌效果最差; 15 种双联用药方较各味中药单用的抑菌活性绝大多数出现增强, 抑菌浓度至少减低39%, FICFIC≤0.5 表现显著增强抗菌活性的协同比例占23.3%; 4 种三联用药方对5 株致病性气单胞菌均具有显著的协同抑制效应, 复方中单味中药的抑菌浓度可以降低80%以上; 而双联用HC14 对4 株致病菌出现FIC≥2 的降低彼此抗菌活性的相互拮抗现象。由此说明合理运用不同中药的联用配伍, 不仅可提高单味中药的抗菌疗效, 而且大大减少了单一中药在实际养殖生产中的给药浓度, 降低药物在环境中的残留量, 防止残留药物造成环境污染, 并且降低用药成本, 提高水产养殖业的经济和社会效益。研究为中药复方防治细菌性鱼病提供科学理论参考。       

八种菊科中草药抗霉菌及饲料霉变的研究

从我国南方霉变的粮食和饲料中分离得到黄曲霉、黑曲霉等10种霉菌并作为供试菌;采用抑菌圈及二倍稀释法研究了野菊花、艾叶等8种菊科中草药的提取物拮抗此10种供试霉菌的活性．结果表明,蒲公英、虾须草等6种中草药及8种中草药的等比混合品抗霉菌活性最强,对各种供试菌的MIC值均不超过12．5g/L,其中中草药混合品和蒲公英显示了MIC的最小值0．391g／L．对此8种中草药提取物及其混合品抗饲料霉变及黄曲霉毒素的产生做了进一步研究,发现中草药混合品的拮抗霉菌生长及黄曲霉毒素产生的效力很强,对黄曲霉毒素的抑制率可超过95%,显示了广阔的应用前景．     

大连地区海生物中致病性弧菌及气单胞菌分布的研究

本文首次报道了大连地区海产品中致病性弧菌及气单胞菌生态分布的研究结果。从152份海产品中共检出88株致病性弧菌及气单胞菌,检出率为57.9％.在检查欧氏六线鱼、太平洋鲱鱼、蓝色马鲛;蝼蛄虾;紫贻贝、杂色蛤仔和毛蚶共7种海产品中,检出9种致病性弧菌和1种气单胞菌,即溶藻弧菌、副溶血性弧菌、麦氏弧菌、少女鱼弧菌、弗尼斯弧菌、拟态弧菌、河弧菌、非01群霍乱弧菌和创伤弧菌。鱼虾类中菌株的检出率明显高于贝类。检出菌株中溶藻弧菌所占比例最高(54.5％),其次为副溶血性弧菌(27.3％)。首次从海生物中分离出嗜水气单胞菌、少女鱼弧菌等致病原因菌株.     

恩诺沙星对4种水产致病弧菌的抑杀菌效应

采用二倍稀释法测定恩诺沙星对溶藻弧菌、最小弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌4种12株菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),结果表明:恩诺沙星对12株弧菌的MIC为0.1?0.8 mg/L,MBC为0.4?3.2 mg/L。在此基础上,从每种菌中选取一株对恩诺沙星较为敏感的菌株,研究恩诺沙星不同药物浓度(1 MIC、2 MIC、4 MIC)对4种弧菌的杀菌动力学和抗菌后效应(PAE),结果显示:各浓度恩诺沙星对溶藻弧菌X040625-R菌株均有较强的杀菌作用,而对哈维氏弧菌M071202-H、创伤弧菌Q050723-C、最小弧菌H010911-Z等3菌株却表现出了低浓度抑菌、高浓度缓慢杀菌的作用。恩诺沙星的抗菌后效应PAE与药物浓度及细菌与药物的接触时间成正相关,恩诺沙星对溶藻弧菌X040625-R的PAE最长,对哈维氏弧菌M071202-H的PAE最短。     

拟态弧菌金属蛋白酶基因PrtV缺失株的构建及生物学特性分析

【背景】研究发现PrtV基因编码含多囊肾病(polycystic kidney disease)结构域的金属蛋白酶,其在多种细菌的致病过程中具有重要作用。拟态弧菌是一种感染多种水生动物的重要病原菌,PrtV基因在拟态弧菌致病中的作用尚不清楚。【目的】探究PrtV基因对拟态弧菌致病相关生物学特性的影响。【方法】采用自然转化的方法构建拟态弧菌PrtV基因缺失株(ΔPrtV),同时通过基因与质粒重组后电转化导入缺失株构建回补株(ΔPrtV/pPrtV),对突变株的生长特性、生化特征、生物被膜形成、自聚集能力、胞外产物卵磷脂酶和蛋白酶活性,以及致病性和细胞毒性等进行分析。【结果】与野生株相比,缺失株的生长特性、生物被膜形成、自聚集能力和卵磷脂酶活性无变化,但分解尿素、甘氨酸、香豆酸盐、鸟氨酸和赖氨酸的理化特性改变;胞外产物蛋白酶活性显著降低(P<0.05),细胞毒性显著下降(P<0.05),对杂交鲇的致病力下降10倍。【结论】PrtV基因与拟态弧菌的细胞毒性及致病性等多种生物学特性有关。该结果为进一步解析拟态弧菌PrtV基因功能及其致病机制提供了依据。     

草鱼抗菌肽Hepcidin过表达对拟态弧菌生长和NF-κB通路的影响

【背景】拟态弧菌(Vibrio mimicus)是一种严重危害水产养殖业的病原菌,可引起鱼类弧菌病,目前使用抗生素防治该病存在较多弊端。【目的】在细胞水平探讨过表达草鱼抗菌肽Hepcidin (CiHep)对拟态弧菌生长和NF-κB通路的影响。【方法】构建重组真核表达质粒pEGFP-N1-Cihep和pcDNA3.1(+)-Cihep。将pEGFP-N1-Cihep转染草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idellakidney,CIK),通过免疫荧光法和Western blotting检测转染后不同时间融合蛋白EGFP-CiHep的表达情况。进一步检测转染pcDNA3.1(+)-Cihep后的CIK细胞培养上清液对拟态弧菌生长的影响,以及转染细胞内NF-κB通路激活关键基因和下游免疫相关基因的转录水平。【结果】融合蛋白EGFP-CiHep在CIK细胞内能够良好表达,且以转染后48 h的表达量最高;转染后的细胞培养上清液能够显著抑制拟态弧菌生长;过表达CiHep可显著改变NF-κB通路激活关键基因和下游免疫相关基因的转录水平。【结论】 CiHep具有抑制拟态弧菌生长和激活NF-κB通路的作用。研究结果为鱼源Hepcidin的开发应用提供了理论依据,有望实现从激活NF-κB通路正向调控抗菌肽表达的新角度防治鱼类拟态弧菌病。     

致病性弧菌主要毒力相关因子的研究进展

弧菌(Vibrio)是一种革兰氏阴性短杆菌,其广泛分布于自然界,以水中最多.弧菌是引起人类、水生动物细菌性疾病的重要病原之一.弧菌的致病性与各个毒力基因的协同作用密切相关.弧菌的毒力因子主要可分为粘附素、内毒素、外毒素等.本文主要对致病性较强的毒力因子粘附素和外毒素进行阐述,以期为弧菌致病机理的研究及弧菌病的防治提供参考和借鉴.     

酸奶中保加利亚乳杆菌的抗药性实验研究

测定了10种常用抗菌药物对市售酸奶中分离的57株保加利亚乳杆菌的MIC,结果显示泰能、克林霉素、林可霉素、头孢唑啉和红霉素对乳杆菌的抗菌活性最强,MIC90值为0.25～2.0mg/L,敏感率为96.5%～86.0%。其次是阿莫西林、复方新诺明、青霉素,其MIC90值为2.0～4.0mg/L,敏感率为84.3%～78.9%。庆大霉素、氯霉素其MIC90值为4.0～16.0mg/L,敏感率为63.2%～59.7%。可见,酸奶中的保加利亚乳杆菌存在抗药性,其抗药性基因是否具转移性有待于进一步研究。     

黄芩醇提物对副溶血性弧菌抑制机制的研究

从4种常见中药中筛选出对副溶血性弧菌有较好抑制作用的中药,并对其抑制机制进行研究。采用牛津杯法及液体倍比稀释法研究了中药醇提取物对副溶血性弧菌的敏感性;通过生长曲线和杀菌曲线、电镜观察以及SDS-PAGE等方法探讨黄芩醇提物的抑菌作用及机理。结果显示,4种中药醇提物对副溶血性弧菌表现出不同的抑菌活性,其中黄芩醇提物对副溶血性弧菌的抑制作用最强,抑菌圈为22.00±1.00 mm,MIC和MBC均为3.91 mg/m L。经MIC浓度处理后,细菌经过较长一段时间的延迟期,也能进入正常的对数期和稳定期;菌体表面变粗糙,出现裂解,菌液的蛋白含量明显升高,但是菌体的可溶性蛋白变化较小。结果表明,黄芩醇提物对副溶血性弧菌有很强的抑制效果,其作用是破坏细胞膜的完整性导致菌体裂解死亡。     

Improvement of innate immune responses and defense activity in mitten crab (Eriocheir sinensis) by oral administration of β-glucan

The beta-glucan (BG), extracted from Saccharomyces cerevisiae cell wall, was orally administrated to the mitten crab (Eriocheir sinensis) at 0, 1, 5 and 10 g BG/kg diet for 28 days, followed by a challenge with Vibrio mimicus by intramuscular injection. Growth, phenoloxidase, superoxide dismutase, acid phosphatase and alkaline phosphatase activity were monitored after 14 and 28 days. The results showed an immunomodulatory effect and protection against V. mimicus by dietary supplementation of BG. The recommended concentration is 5 g BG/kg diet.     

Catecholamine-induced stimulation of growth in Vibrio species

AIMS: To evaluate the effect of norepinephrine (NE) and related compounds on the growth of bacteria, we have examined the effect of the neuroendocrine hormone NE and related compounds on the growth of Vibrio parahaemolyticus and other human-pathogenic Vibrio species (Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, and Vibrio mimicus). METHODS AND RESULTS: The effects on bacterial growth were examined using the serum-based medium and viable cells were counted using agar plates. We have shown that NE and its related compounds stimulate growth of V. parahaemolyticus in serum-based medium. This NE-induced growth stimulation was dependent upon the presence of transferrin. NE also stimulated growth of V. mimicus, but not V. cholerae and V. vulnificus. CONCLUSIONS: These results suggest that the Vibrio species differ in their ability to respond to NE. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: It is possible that NE and related compounds modulate the pathogenicity of V. parahaemolyticus and V. mimicus.     

海水养殖真鲷最小弧菌外毒素的免疫学特性初步研究

按常规方法免疫健康家兔进行外毒素抗体的制备。将制备的兔抗血清与等体积的外毒素混合,37℃下作用1h后,观察毒素的溶血性及细胞毒性,取免疫前家兔血清(零号血清)作阴性对照,用毒素作阳性对照。结果表明,兔抗毒素血清能中和毒素,抑制毒素对人血细胞的溶血性及对Vero细胞的细胞毒性,中和毒素的兔抗毒素血清最高稀释度为1∶256,毒素对照显示出溶血性及细胞毒性。毒素与一定浓度的嗜水气单胞菌HEC毒素抗血清、霍乱肠毒素抗血清在37℃下分别作用1 h后,观察其溶血性及细胞毒性。结果表明,这2种抗血清都不能中和毒素,毒素与这2种抗血清作用后,仍然保持其溶血性及细胞毒性。用浓度为0.2%的福尔马林对浓度为5mg/mL的外毒素进行灭活处理,得到的灭活疫苗为毒素苗。一定稀释度的毒素苗,在初次免疫真鲷2周后利用病原菌对免疫组及对照组的实验鱼进行人工攻毒感染,毒素苗的免疫保护率可达80%,强化免疫后,免疫保护率有所提高。注射免疫的免疫保护率比浸泡免疫的高。     

细菌外毒素序列中特有模体的识别及其基因本体注释分析

【目的】识别细菌外毒素序列中特有模体,进一步理解外毒素的致病机制。【方法】构建非致病性细菌蛋白质数据库,利用InterProScan对数据库中非致病菌蛋白质序列以及收集的经实验确认的89条细菌外毒素蛋白质序列进行模体搜索。【结果】在89条细菌外毒素序列中,分析得到了39个细菌外毒素特有模体。【结论】得到的外毒素特有模体与外毒素功能密切相关,为在致病性细菌基因组内搜索外毒素序列奠定了基础;同时通过对外毒素特有模体的基因本体(Gene ontology,GO)注释分析,进一步阐明了细菌外毒素的致病机制。     

椰汁体外抑菌效应的研究

目的研究椰汁对常见致病菌的体外抑菌效应。方法采用纸片扩散法（K－B法）、试管稀释法（MIC法）、吸光度值测定法和生长曲线法来观察椰汁对常见致病菌的体外抑菌效应。结果椰汁对4种常见致病菌的生长均表现出抑制效应,尤其对伤寒沙门菌的抑制作用最强。结论椰汁对常见致病菌表现出一定的抑菌效应。     

The ability of two different Vibrio spp. bacteriophages to infect Vibrio harveyi, Vibrio cholerae and Vibrio mimicus

AIMS: To determine the host range of the Vibrio harveyi myovirus-like bacteriophage (VHML) and the cholera toxin conversion bacteriophage (CTX Phi) within a range of Vibrio cholerae and V. mimicus and V. harveyi, V. cholerae and V. mimicus isolates respectively. METHODS AND RESULTS: Three V. harveyi, eight V. cholerae and five V. mimicus isolates were incubated with VHML and CTX Phi. Polymerase chain reaction (PCR) was used to determine the presence of VHML and CTX Phi in infected isolates. We demonstrated that it was possible to infect one isolate of V. cholerae (isolate ACM #2773/ATCC #14035) with VHML. This isolate successfully incorporated VHML into its genome as evident by positive PCR amplification of the sequence coding part of the tail sheath of VHML. Attempts to infect all other V. cholerae and V. mimicus isolates with VHML were unsuccessful. Attempts to infect V. cholerae non-01, V. harveyi and V. mimicus isolates with CTX Phi were unsuccessful. CONCLUSIONS: Bacteriophage infection is limited by bacteriophage-exclusion systems operating within bacterial strains and these systems appear to be highly selective. One system may allow the co-existence of one bacteriophage while excluding another. VHML appears to have a narrow host range which may be related to a common receptor protein in such strains. The lack of the vibrio pathogenicity island bacteriophage (VPI Phi) in the isolates used in this study may explain why infections with CTX Phi were unsuccessful. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: The current study has demonstrated that Vibrio spp. bacteriophages may infect other Vibrio spp.     

苦瓜总皂甙对金黄色葡萄球菌抑制作用的研究

研究苦瓜总皂甙的抑菌作用及抑菌条件。以苦瓜正丁醇浸提物为原料,研究其对金黄色葡萄球菌的抑菌作用。试验结果表明,苦瓜总皂甙对金黄色葡萄球菌的抑制作用明显,最低抑菌浓度为30 mg/mL;抑菌最适pH值范围5~8;苦瓜总皂甙的热稳定性好,在121℃处理10 min仍具有较好的抑菌活性。金黄色葡萄球菌生长曲线表明,对数生长期的金黄色葡萄球菌对苦瓜总皂甙较敏感,而对接近稳定期的菌体抑制作用较弱。     

海金沙提取物体外抑菌性能研究

用M／C和纸片法考查了海金沙提取物对藤黄球菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌的抑菌性能。结果表明：海金沙对4种受试菌株都有抑菌活性;37℃时,醇提物对乙型溶血性链球菌的抑菌效果最好,最大抑菌圈为8．5mm;42℃时,对藤黄球菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑菌效果最好,最大抑菌圈分别为21、13．2和6．5mm。pH值为7．6时,海金沙醇提物在对藤黄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和乙型溶血性链球菌的最大抑菌圈分别为9．1、8．2、9mm和11．3mm。海金沙水提物和醇提物对藤黄球菌、乙型溶血性链球菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌质量分数分别为25％、12．5％、12．5％、25％和3．12％、1．56％、6．25％、3．12％．