正交设计优化落叶松ISSR-PCR反应体系

该文利用正交试验设计的方法,对落叶松ISSR-PCR反应的5因素4水平进行试验,试验结果运用MINITAB软件进行分析,建立了落叶松ISSR-PCR反应的最佳体系,即在20μl反应体系中,模板50-200 ng,0.5μmol/L的引物,1×反应缓冲液,dNTP为0.15mmol/L-0.2mmol/L,1U的TaqDNA聚合酶,Mg2 2.0mmol/L-2.5 mmol/L。并进一步进行梯度退火试验,找到了最适的落叶松ISSR退火温度为56.4℃。     

正交试验优化八角ISSR-PCR反应体系

利用正交试验设计研究Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物(UBC 886)、dNTP、Mg2+浓度5个因素对云南八角ISSR-PCR反应的影响,建立其最佳反应体系。结果表明:25μL的反应体系中5个因子的最佳水平为:Mg2+3 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L。PCR最佳反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,46℃退火45 s,72℃延伸1 min,40次循环;72℃最后延伸7 min,4℃保存。     

黑木耳ISSR-PCR反应体系的正交优化

采用正交试验设计的方法,对黑木耳ISSR-PCR(简单重复序列区间-多聚酶链反应)反应体系中的5种主要因素(Taq聚合酶,Mg2+,模板DNA,dNTP及引物)4个水平进行优化筛选,确立了适合黑木耳ISSR分析的优化反应体系(20μL),通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度。     

利用正交设计建立与优化北美驼绒藜ISSR-PCR反应体系

利用正交试验设计的方法,对北美驼绒藜ISSR-PCR反应的5因素(Taq酶、dNTP、引物、Mg²⁺和模板DNA)4水平进行试验,试验结果运用MINITAB软件进行分析,建立了适合北美驼绒藜的既稳定又谱带多的ISSR-PCR最佳反应体系,即20 μL的反应体系中含有1×buffer,1.5 U Taq酶,0.2 mmol·L^-1 dNTP,0.5 μmol·L^-1引物,2.5 mmol·L^-1 Mg²⁺和10 ng模板DNA。这一优化的ISSR-PCR反应体系的建立,为今后利用ISSR技术进行驼绒藜属植物种质资源分类、遗传图谱构建和遗传变异奠定了技术基础。     

正交设计优化北重楼ISSR-PCR体系

利用正交试验设计L₉(3⁴)的方法,最终建立了北重楼ISSR-PCR的优化反应体系,即20 μL反应体系中包含1×buffer,dNTP 175 μmol·L^-1,Primer 0.8 μmol·L^-1,Mg²⁺ 1.4 mmol·L^-1,Taq酶2.5 U及模板DNA 80 ng。适宜的扩增程序为95℃预变性5 min;94℃变性40 sec,55℃退火45 sec,72℃延伸90 sec,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。该优化体系的建立,将为北重楼及其近缘种的系统学和种质资源鉴定及遗传多样性的研究奠定基础。     

丹参ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化

利用正交试验设计的方法,从引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度4种因素3个水平,对丹参ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度、PCR反应过程中的退火温度进行梯度检测。结果表明:20μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度为1×PCR buffer、200μmol/L dNTP、1.0μmol/L引物、1.5mmol/L Mg2+和1 U Taq DNA聚合酶,最佳模板DNA浓度为20～60ng,引物UBC 835的最佳退火温度为51.7℃。     

正交设计优化缩叶藓属植物的ISSR-PCR反应体系

目的：建立缩叶藓属（Ptychomitrium）植物ISSR-PCR反应的最佳体系。方法：利用正交设计实验的方法,采用引物562,10号材料Ptychomitrium gardneri为模板对缩叶藓属植物的ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素（Mg2＋d、NTPs、引物、模板量、Taq酶量）在4个水平上进行体系优化。结果：确定了缩叶藓属（Ptychomitrium）植物ISSR-PCR反应的最佳体系（25μl）为：Mg2＋浓度为3.2mmol/L、dNTPs浓度为0.96mmol/L、引物浓度为1.04μmol/L、模板量10ng、Taq酶量1.5U。利用该体系,采用引物564在16个材料中能有效扩增。结论：这一优化体系的建立为以后缩叶藓属植物的ISSR遗传多样性的分析奠定了基础。     

正交设计优化紫萼藓科植物的ISSR-PCR反应体系

目的:建立紫萼藓科(Grimmiaceae)植物ISSR-PCR反应的最佳体系。方法:通过L16(45)正交试验,研究了dNTP浓度、镁离子浓度、模板DNA浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度这5个因素在4个水平上对ISSR-PCR的影响。结果:建立了紫萼藓科ISSR-PCR反应的最佳反应体系,其中dNTPs浓度为0.8mmol/L、Mg2+浓度为3.0mmol/L、模板为15ng、引物浓度为1.4μmol/L、Taq酶量2U,总体积为25μl。反应程序为:扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,48～52℃退火1min,72℃延伸2min,共40个循环;72℃延伸10min;4℃保存。采用引物UBC812等均能够得到有效扩增。结论:该优化体系的建立为下一步对紫萼藓进行ISSR分子标记奠定了基础。     

栝楼ISSR-PCR反应体系的建立和优化

用改良SDS法提取栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim)叶片DNA为模板,通过单因素试验研究模板、引物、Taq DNA聚合酶和dNTPs等4因素各7个水平对栝楼ISSR-PCR扩增结果的影响,并通过正交试验对各因子的浓度进行优化,首次建立了栝楼ISSR-PCR分析的最适反应体系:20 μL的反应体系中,1×buffer,模板含量为50 ng,引物的浓度为0.5 μmol/L,Taq DNA聚合酶的用量为0.8 U,dNTPs的浓度为200 μmol/L.随机选取10条引物验证体系稳定性,并对190条ISSR引物初筛,得到条带清晰、多态性好的引物126条.经验证,本实验所建立的栝楼ISSR-PCR反应体系具有稳定可靠、可重复性好、多态性较强等特点,能够较好的应用于栝楼的ISSR分子生物学分析.     

利用正交设计法对叉叶苏铁ISSR-PCR反应体系的优化研究

比较CTAB法和SDS法提取叉叶苏铁（Cycas micholitzii）的总DNA,发现CTAB法是提取叉叶苏铁总DNA的较好方法;对叉叶苏铁ISSR-PCR反应体系中的4个主要因素dNTPs,Taq DNA聚合酶,引物及Mg²⁺进行最优条件筛选;采用单因素法探讨DNA模板量、退火温度和循环次数的最佳反应条件,建立了适合于叉叶苏铁的最佳ISSR-PCR反应体系 （20 μL体系）： 1×Buffer,75 ng DNA模板,dNTPs 250 μmol·L^-1, Taq酶1.0U,引物0.2 μmol·L^-1,Mg2+ 2.5mmol·L^-1,反应程序为：94℃预变性5 min,94℃变性1 min,52℃退火1 min,72℃延伸2 min,循环40次,72℃延伸10 min,4℃保存。本研究结果为苏铁纲植物的分子生物学和分子系统学研究提供理论参考。     

小苍兰种质遗传多样性的ISSR分析

利用ISSR(Inter Simple Sequence Repeat)分子标记对12份小苍兰(Freesia refracta)种质进行了遗传多样性分析研究。从34条ISSR引物中筛选出了12条适宜的引物。这12条引物中每条引物可扩增出5~11条DNA片段,共扩增了96个条带,其中多态性片段62条,平均每条引物可产生5.2条多态性片段,多态性条带比率(PPB)为64.6%。经NTSYS-pc分析,12份小苍兰种质间的遗传距离(GD)的变化范围为0.123~0.907,平均为0.442。根据Nei’s相似系数建立了UPGMA聚类图,在相似系数为0.56时,可将紫色花系的小苍兰种质与其它种质分开,形成两个组。结果表明,ISSR分子标记可有效地分析小苍兰种质资源的遗传多样性和亲缘关系,为小苍兰的杂交育种和新品种保护提供理论基础。     

小苍兰花色色素成分及稳定性分析

以小苍兰(Freesia refracta)16个不同花色品种及后代为试验材料,对花瓣色素用特征显色反应和紫外-可见光谱扫描,分析其色素的成分和花色素苷的稳定性.结果表明,小苍兰花色的色素属于类黄酮化合物,含黄酮和花色素苷类物质,可能含有异黄酮,不含黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、查耳酮和橙酮,其中黄色系品种及后代还含有类胡萝卜素.避光下小苍兰花色素苷的稳定性要强于光照;温度对花瓣色素的稳定性有一定的影响.     

四数獐牙菜ISSR-PCR反应体系的正交优化

采用正交试验与单因素设计相结合的方法,对四数獐牙菜ISSR-PCR反应体系中的4种主要因素(Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP及引物)进行优化筛选,PCR结果用统计软件SPSS16.0分析。结果显示,Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP这3因素的不同水平对PCR反应结果都有显著影响,其中Mg2+的浓度影响最大。筛选出各反应因素的最佳水平,建立四数獐牙菜ISSR-PCR反应的最佳体系(25μL)为3.0 mmol/L Mg2+,250μmol/L dNTP,0.6μmol/L引物,1UTaqDNA聚合酶,40 ngDNA,2.5μL10×buffer。这一体系的建立为今后利用ISSR技术进行四数獐牙菜遗传多样性分析以及物种保护奠定了技术基础。     

杂交油菜ISSR-PCR反应体系的建立和优化

利用正交试验设计的方法,对影响ISSR-PCR反应的Mg²⁺、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶4个因素进行优化试验,以期建立其最佳反应条件。并在此基础上,对DNA模板浓度和ISSR PCR反应程序中的退火温度进行梯度筛选。结果表明：杂交油菜20 μL ISSR-PCR最佳反应体系包括1.50 mmol·L^-1 Mg²⁺、0.125 mmol·L^-1 dNTP、2.00 μmol·L^-1 primer、0.50 U Taq DNA聚合酶、2.5 μL 10×buffer和40 ng DNA模板;引物UBC891适宜的退火温度为54.2℃。该体系在青杂3号及其父本不同个体中能够扩增出条带清晰、稳定性好的条带。ISSR-PCR反应体系的建立为利用分子标记技术研究杂交油菜品种纯度和真实性鉴定奠定了良好基础。