鳜鱼Mx蛋白全长cDNA的克隆和序列分析

Mx蛋白是一类由I型干扰素诱导表达的抗病毒蛋白。本研究以感染了鳜传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)的鳜鱼为材料,提取肝脏总RNA,通过逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Mx蛋白基因的核心片段序列,再应用3’和5’快速扩增cDNA末端(RACE)方法PCR扩增Mx蛋白cDNA末端,最终获得鳜鱼Mx蛋白cDNA序列(GenBank登陆号：AY392097)。序列分析表明：鳜鱼Mx蛋白cDNA含有2391bp,其中编码区长1881bp,编码627个氨基酸残基,推测蛋白质分子量大小为7．15kDa。鳜鱼Mx蛋白具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征：一个三联体GTP结合区域(GXXXSGKS/T、DXXG、T／NKXD)一个发动蛋白家族的典型结构特征序列(LPRGS／KGIVTR);以及C端高度保守的Leu拉链结构域。鳜鱼Mx蛋白全基因的获得为下一步研究鱼类Mx蛋白的抗病毒活性、作用机制,以及干扰素的检测奠定了基础。     

鸡二价金属转运蛋白1 cDNA的克隆与序列分析

鸡二价金属转运蛋白1（divalent metal transporter 1, DMT1）在动物胃肠道锰吸收过程中起重要作用.根据哺乳动物Dmt1同源蛋白氨基酸序列的保守性设计引物,应用3′RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术,扩增并克隆获得鸡小肠Dmt1 cDNA 3′端1 289bp和1 092bp的2种片段,发现其3′端翻译区和非翻译区存在差异. 根据鸡Dmt1 cDNA 3′端片段的测序结果设计引物,扩增获得1个与3′端片段部分重叠的鸡Dmt1 cDNA 5′端907 bp片段,并对其进行了克隆测序. 根据鸡小肠Dmt1 3′RACE片段和5′RACE片段序列信息进行拼接,从而获得鸡小肠Dmt1 cDNA全序列信息.结果表明,鸡小肠Dmt1 cDNA有2种形式,1种全长为1 972个核苷酸,其中5′非翻译区为104个核苷酸,编码区1 695个核苷酸,3′非翻译区为173个核苷酸,编码1个含564个氨基酸残基的蛋白质;另1种形式为1 775个核苷酸,其中5′非翻译区为104个核苷酸,编码区1 593个核苷酸,3′非翻译区为78个核苷酸,编码1个含530个氨基酸残基的蛋白质.据鸡Dmt1 cDNA推测出的2种形式蛋白质的氨基酸序列与人、大鼠和小鼠的Dmt1蛋白具有高度同源性,它们的同源性分别为82%、82%、80%,和 84%、84%、83%. 对推测氨基酸序列进行疏水性和跨膜区分析表明,Dmt1蛋白为1种跨膜整合蛋白,具有膜转运蛋白糖基化位点和底物结合位点的保守序列.     

鳜鱼Mx蛋白全长cDNA的克隆和序列分析

Mx蛋白是一类由I型干扰素诱导表达的抗病毒蛋白.本研究以感染了鳜传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)的鳜鱼为材料,提取肝脏总RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Mx蛋白基因的核心片段序列,再应用3'和5'快速扩增cDNA末端(RACE)方法PCR扩增Mx蛋白cDNA末端,最终获得鳜鱼Mx蛋白cDNA序列(GenBank登陆号AY392097).序列分析表明鳜鱼Mx蛋白cDNA含有2391bp,其中编码区长1881bp,编码627个氨基酸残基,推测蛋白质分子量大小为7.15kDa.鳜鱼Mx蛋白具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征一个三联体GTP结合区域(GXXXSGKS/T、DXXG、T/NKXD);一个发动蛋白家族的典型结构特征序列(LPRGS/KGIVTR);以及C端高度保守的Leu拉链结构域.鳜鱼Mx蛋白全基因的获得为下一步研究鱼类Mx蛋白的抗病毒活性、作用机制,以及干扰素的检测奠定了基础.     

一步3’RACE快速构建鸡MnSOD全长cDNA克隆Rapid

本研究尝试将触减 PCR与3’ cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术进行结合,仅用一条特异性引物和一条通用引物,成功地实现了从3’末端cDNA库对鸡含锰超氧化物歧化酶（manganese-containing superoxide dismutase,MnSOD）全长cDNA的一步3’RACE快速构建。与常规使用的末端PCR或亚克隆方法相比,该法具有快速、省时、经济和特异性好的优点。Abstract: RACE(rapid amplification of cDNA ends) is a popular technique to rapidly obtain the full-length cDNA. After obtaining the 3’cDNA and 5’cDNA fragments with a overlapped region by 3’RACE and 5’RACE, the full-length cDNA could be generated by end-to-end PCR or subcloning. In this study, 3’RACE combined with touch-down PCR was successfully used for the rapid construction of full-length MnSOD cDNA of chickens. Compared with the conventional end-to-end PCR or subcloning, this method, called one-step 3’RACE, is fast, economical and highly specific. It especially fits the rapid construction of full-length cDNA by RACE method.     

鸡下丘脑cDNA文库的构建及部分克隆ESTs序列初步分析

以鸡下丘脑为实验材料,以λgt10为载体,构建了鸡下丘脑cDNA文库。结果表明,文库的滴度为3.8×10     

香蕉果实expansin cDNA克隆及序列分析

华南农业大学广东省果蔬保鲜重点实验室陆旺金博士对香蕉果实expansin cDNA做了研究,他提取成熟香蕉果肉的RNA并分离mRNA,以mRNA反转录合成cDNA,以该cDNA为模板,设计expansin的简并引物,进行RT-PCR圹增,利用退火温度为50℃得到扩增产物纯化后与pGEM-T-Ea-Sy载体连接转化大肠杆菌,任意桃选2个阳性克隆,进行序列分析,结果得到2个序列相同的expansin的cDNA基因片段,命名为MA-EXP3,以示与登录的香蕉MA—EXP1和MA—EXP2相区别。MA—EXP3中存在expansin基因的保守区域即8个半胱氨酸残基和3个色氨酸残基,它编码为177个氨基酸与MA—EXP1的核苷酸同源性为74．2％,与氨基酸的同源性为86．4％。     

鲑鱼泌乳素cDNA的分子克隆和序列分析

从太平洋切奴克鲑鱼的垂体制备cDNA文库。按照鲑鱼泌乳素的部分蛋白质序列所提供的信息合成寡聚脱氧核苷酸探针。用探针筛查泌乳素基因,识别出一个阳性克隆PRL-10。该克隆的硷基序列已被测出。PRL-10的总长为1.1kb,编码了含有211个氨基酸组成的泌乳素前体,其中包括了编码23个氨基酸的信号肽序列和编码188个氨基酸的成熟泌乳素序列。     

豚鼠生长激素受体cDNA的克隆

报道了豚鼠肝生长激素受体（ＧＨＲ）的ｃＲＮＡ克隆和编码区序列。它由１８９９ｂｐ组成,编码６１０个氨基酸。此外,还报道豚鼠ＧＨＲ的结构特征和同源性比较的结果。     

大鼠脑谷氨酸脱羧酶基因的cDNA克隆及序列分析

胰岛β－细胞自身抗原蛋白之一是脑中谷氨酸脱羧酶（Ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ,ＧＡＤ,ＥＣ４．１．１．１５）同源物,以双链ｃＤＮＡ为模权,用ＰＣＲ方法快速克隆了Ｗｉｓｔａｒ大鼠脑ＧＡＤ基因的ｃＤＮＡ将此包括编码５９３个氨基酸的全长ＤＮＡ片段重组入ｐＵＣ质粒并用双脱的氧末端终止法测定了全部序列,证明其全长为１７７９ｂｐ,经比较发现Ｗｉｓｔａｒ大鼠脑与Ｒｕｓｓｅｌｌ报导的大鼠脑Ｇ     

三个品种家鸡催乳素基因cDNA的克隆及序列分析

从粤黄鸡、毛丝乌骨鸡及伊莎蛋鸡的垂体中快速抽提总RNA,根据国外已发表的肉用仔鸡乳素基因cDNA的序列,设计并合成了能与特定载体末端互补的1对引物,经反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）方法扩增获得了特异性片段。将扩增片段与线性化质粒pBSSK连接,克隆后进行序列分析,与已报道的肉用仔鸡、矮脚鸡和火鸡催乳素基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行了比较。结果表明,不同品种间核苷酸同源性介于93．97％－99．87％之间,其中丝毛乌骨鸡与矮脚鸡间的同源性最高为99．87％。推导的相应氨基酸序列的同源性在98．25％－100％之间,也是丝毛乌骨鸡与矮脚鸡间的同源性最高,为100％。在粤黄鸡、丝毛乌骨鸡和伊莎蛋鸡中,发现前两者的催乳素前体的cDNA片段推导的 氨基酸序列中信号肽裂触位点跟肉用仔鸡,矮脚鸡及火鸡的一样,为Leu-Pro-IIe-Cys,而伊莎蛋鸡的信号肽裂解位点则不一样,为Pro-Pro-IIe-Cys。此位点的差异可能导致催乳素前体翻译加工的不同,使伊莎蛋鸡无就巢性。这3个家鸡品种与国外的肉用仔鸡、矮脚鸡催乳素氨基酸序列还在以下位置出现差异：71、141、150、175。在肉用仔鸡、丝毛乌骨鸡催乳素氨基酸序列中还发现了一个肝素结合位点175－181（L－R－R－D－S－H－K）。     

Isolation and Nucleotide Sequence of Rat Cu/Zn Superoxide Dismutase cDNA Clones

Superoxide dismutase (SOD: EC 1.15.1.1) catalyzes the dismutation of oxygen radicals and is thought to protect cells against free radical damage. We have isolated and sequenced cDNA clones of the rat Cu/Zn SOD, and have used these clones to map the rat genomic sequences coding for this enzyme. Rat Cu/Zn SOD is coded for by a single copy gene which is transcribed into an mRNA species of approximately 800 bases. Comparison of the nucleotide sequences of rat and human SOD cDNAs shows that they are homologous over 83% of the coding sequences and that in the 3′-untranslated region the extent of homology drops to 66%. The predicted rat SOD amino acid sequence is very similar to that of other eukaryotic SODs, showing 70% homology with the SODs of other mammals. Sequence conservation is particularly high in domains believed to be of functional importance.     

蜡样杆菌（Bacillus cereus）M22 Mn-SOD cDNA片断的克隆

分析不同种细菌Mn SOD氨基酸序列的保守区域 ,设计一对简并引物进行RT PCR扩增 ,产物经T A载体连接转化大肠杆菌JM 1 0 9,筛选阳性克隆、测序并进行同源性分析 ,得到 4 36bpMn SODcDNA片段。根据此片段设计 5′端特异性引物 ,然后进行 5′RACE扩增 ,获得Mn SOD 5′端 387bpcDNA片断。将 2段序列进行拼接获得 5 94bpcDNA片断 ,编码 1 72个氨基酸。对推定氨基酸序列进行BLAST分析 ,结果表明其与炭疽芽孢杆菌 (Bacillusanthracis)同源性为 95 % ,且Gly77,Aly78,Phe86,Gln1 50 和Asp1 51 在已报道的Mn SOD中均存在 ,构成Mn SOD的活性中心。表明该序列为蜡样芽孢杆菌Mn SOD的cDNA序列     

三角帆蚌金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

采用RACE技术,获得了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)金属硫蛋白基因的全长cDNA序列.该序列全长467 bp,由长92 bp的5'UTR(untranslated region),159 bp的3'UTR,和216 bp的开放阅读框(openreading frame,ORF)组成.共编码71个氨基酸,分子量大约为7.1 ku,理论等电点为7.24.该蛋白序列中半胱氨酸含量最丰富(29.6%),其次是甘氨酸(14.1%),存在软体动物金属硫蛋白的特征序列CKCXXXCXCX,且C-末端的氨基酸序列也符合软体动物金属硫蛋白标签序列C-X-C-X(3)-C-T-G-X(3)-C-X-C-X(3)-C-X-C-K.蛋白序列特征分析表明,该序列与其他贝类的金属硫蛋白基因具有很高的相似性,具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族的成员.     

蒙古冰草PLD基因cDNA克隆及生物信息学分析

以蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)叶片为材料.根据已报道的醉酒毒麦PLD基因片段设计特异引物,通过RT-PCR和RACE技术,获得蒙古冰草PLD基因的全长cDNA(GenBank登录号为EU333811).该基因cDNA全长2 966 bp,包含2 439 bp的完整开放读码框,编码813个氨基酸.BlastP搜索结果显示,该基因推测的氨基酸序列与已克隆的醉酒毒麦、玉米、水稻PLD基因氨基酸序列的一致性为80%～89%.利用生物信息学软件在线分析其序列结构、氨基酸组成及编码氨基酸的性质和结构,结果表明:该基因编码的蛋白为可溶性蛋白,其相对分子量为92 079.2 Da,理论等电点为5.24,无跨膜域、无信号肽;其二级结构主要以无规卷曲为主;三级结构显示紧靠N端处为C2域,在中间和靠近C端处存在PLD的标志序列,即HKD基序.系统进化树显示,蒙古冰草PLD与醉酒毒麦的亲缘关系最近.     

中国野葡萄新基因cDNA全长的克隆及序列分析

根据对中国野生葡萄华东葡萄株系白河-35-1在白粉病诱导下构建的cDNA文库中获得的1条EST序列设计特异引物,以总RNA逆转录产物为模板,进行SMART-RACE扩增。结合生物信息学方法对所获的序列进行开放阅读框、序列同源性分析,并预测了蛋白质的理化性质、信号肽、酶与非酶分析、亚细胞定位以及蛋白质二级结构。结果表明,获得的中国野生葡萄新基因的全长序列为854 bp,其开放阅读框为585 bp,5′非编码区为107 bp,3′非编码区为162 bp;同源性比对表明该新基因推导的氨基酸序列与拟南芥RNA结合蛋白和水稻推定的半乳糖基转移酶的同源性分别为55%和63%,第8~82位氨基酸序列与RNA识别基序相类似,是一个典型的结构功能域;推导该基因表达产物为相对分子质量为21 801.27、等电点为6.86的不稳定蛋白,定位于细胞核,不包含信号肽,二级结构主要是无规则卷曲。     

中国人白细胞介素-12 cDNA基因的克隆及序列分析与比较

为研究中国人ＩＬ－１２的基因特征,采用逆转录巢式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎＰＣＲ）从中国人脐带血单核细胞中分别克隆了Ｐ３５、Ｐ４０两亚基ｃＤＮＡ基因,包括完整的前体蛋白编码序列,其中Ｐ３５ ｃＤＮＡ编码２１９个氨基酸的多肽,Ｐ４０ ｃＤＮＡ编码３２８个氨基酸的多肽,与国外序列（ＮＫＳＦ、ＣＬＭＦ）比较结果发现：所克隆序列Ｐ３５同ＮＫＳＦ相比,第４４ａａ密友子由ＧＴＣ（Ｖａｌ）→ＧＴＧ（Ｖａｌ）,但未改     

中国人HIV辅助受体CXCR4基因的克隆及序列测定

为了获得ＨＩＶ辅助受体ＣＸＣＲ４基因,进一步探索艾滋病（ＡＩＤＳ）的诊断、防治方法,采用逆转录巢式聚合酶链式反应（ＲＴ－ｎＰＣＲ）从中国人外周血淋巴细胞中克隆了ＣＸＣＲ４　ｃＤＮＡ基因,得到了预期的１　１００ｂｐ左右的片段。将ＰＣＲ产物与Ｔ载体连接,并进行了酶切反应鉴定,获得与Ｔ载体正向连接的克隆。测序结果表明：克隆的片段含有一个开放性阅读框架,编码３５２个氨基酸残基。搜索ＧｅｎＢａｎｋ,目标片段与Ｍ９９２９３、ＸＭ０５１２２３、ＸＭ０５１２２４、　ＸＭ０５１２２５有很高的同源性,比较结果显示：克隆的片段包括完整的编码序列,含两个碱基的差异。     

人乳铁蛋白cDNA的克隆及序列分析

从北京正常人乳腺组织中提取总RNA,用RT-PCR的方法扩增人乳铁蛋白(hLF)的cDNA,将其克隆到pGEM-T载体上并进行DNA序列测定。结果表明,所克隆的hLF cDNA序列全长为2136bp,其DNA序列与GenBank中另外5个hLF cDNA序列相比,有2个碱基与这5个序列不同：1740位这5个序列是G,本文序列是C;1756位这5个序列是T,本文序列是C。其中1740位碱基的变化导致了第580位氨基酸由Glu变为Asp。