随机单链DNA文库SELEX筛选寡核苷酸适配子方法的建立

指数富集配基的系统进化(SELEX)技术是一种新的组合化学技术.体外构建了一个长度为81 nt、含有35个随机序列的单链DNA(ssDNA)文库,优化了ssDNA文库扩增为双链DNA (dsDNA)文库的PCR反应条件.通过对比不对称PCR和生物素-链亲和素磁珠分离方法制备ssDNA文库的效果,确定了以生物素-链亲和素磁珠分离方法制备ssDNA.由于脱氧核糖核酸的疏水性导致ssDNA文库与硝酸纤维素滤膜的结合背景过高,因此选择以微孔板为介质,分离与靶蛋白结合的适配子.经过9轮循环筛选,随机ssDNA文库与丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(C蛋白)的结合率从0.5%上升到32.5%.     

SELEX技术及近年研究进展

指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)是近20年来出现的一种新型体外筛选技术。该技术将文库技术与筛选技术相结合,从核酸文库中筛选出的一段核酸分子:配基-适配子(aptamer);适配子与抗体类似,可以与相应靶物质特异性结合。SELEX技术筛选适配子的技术有快速的进步,而适配子也被应用到医学生物学等各个方面。在HIV等病毒学研究与治疗方面,SELEX的应用也有了可观的进展,多种病毒的相关适配子被筛选出来,为病毒相关疾病的防治提供了新的方向。本文主要就近三年来的SELEX技术发展状况及在应用上的发展进行简要综述。     

应用双向热循环消减SELEX技术筛选肺癌血清核酸适配体

肺癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。现阶段,用于肺癌早期诊断的血清肿瘤标志物因其特异性与敏感性均较低,严重影响肺癌的临床诊断和治疗。本文用双向热循环消减指数富集的配基进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技术,筛选肺癌和非癌血清标志物的核酸适配体,建立肺癌的检测方法,提高诊断和治疗效率。实验用环氧基琼脂磁珠为筛选介质,以非癌混合血清、肺癌混合血清作为双向靶标。应用热循环消减SELEX技术,经19轮筛选分别获得非癌和肺癌血清的特异性核酸适配体。通过高通量测序,得到 40条非癌核酸适配体序列和 41条肺癌核酸适配体序列。从肺癌与非癌血清特异性核酸适配体序列中分别挑选出高丰度的 4条序列,合成后制成检测试剂,经临床血清验证,阳性率为 90%。该检测方法检测灵敏度高,为肺癌的早期诊断和治疗提供了新的分子识别元件。     

应用双向热循环消减SELEX技术筛选胃癌血清核酸适配体

胃癌是发病率及死亡率均较高的消化道恶性肿瘤之一,严重威胁人类的生命健康。血清肿瘤标志物的检测对提高早期胃癌的检出率,改善胃癌的治疗有重要的意义。核酸适配体以其灵敏度高、靶向性强等优势显示出了较强的临床适用性。本研究以双向热循环消减指数富集式配基系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术为支持,纳米（琼脂）磁珠材料为载体,胃癌血清及正常人血清为筛选靶标,结合高通量测序技术建立了快速高效的核酸适配体筛选方法。经过19轮双向筛选,获得高重复率的胃癌血清特异性核酸适配体序列10条及正常人血清特异性核酸适配体序列8条。将这些序列分别混合并制成检测试剂A、B,结合实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qPCR）技术,对100份临床血清样本进行特异性验证。通过比较分析,建立了快速高效的胃癌血清检测技术。结果显示,核酸适配体G AP1与N AP1的二级结构类似于抗体的“Y”型,且呈茎环状。检测试剂A、B对胃癌及正常人血清的检出率分别为92%和88%。表明本技术可以较准确地筛选得到高特异性和强亲和力的核酸适配体,体现了核酸适配体作为新型肿瘤标志物在临床检测及治疗的应用潜力。     

SELEX法体外筛选胃癌细胞适配子方法的建立

目的:建立SELEX技术筛选胃癌细胞SGC-7901适配子的方法,并初步鉴定获得的SGC-790 1细胞适配子.方法:体外合成全长88bp中间含52bp随机序列的ssDNA文库 ,通过优化PCR扩 增条件,利用地高辛-抗地高辛抗体-碱性磷酸酶系统测定亲和力,经SELEX反复筛选获得胃 癌SGC-7901细胞的特异性适配子.将最后一轮筛选产物克隆、测序并用相关软件分析适配子 序列的一级结构和二级结构.结果:经12轮SELEX筛选,ssDNA文库与SGC- 7901细胞的亲和力由0.16上升至1.14,表明特异性适配子得到逐步富集.22个克隆子测序, 有4个序列完全一致,二级结构预测茎环可能是适配子与胃癌细胞作用的结构基础.结论:成功建立了SELEX技术体外筛选胃癌细胞SGC-7901高亲和性适配子的方法.     

双向热循环消减-SELEX方法筛选肝癌血清核酸适配体

肝癌位于我国肿瘤死亡率第2位,生存率较低。目前用于肝癌早期诊断的临床检查及血清肿瘤标志物检测的特异性与敏感性均较低,不能满足肝癌早期诊断和治疗的需要。核酸适配体与靶标分子结合的灵敏度高、特异性强,有巨大的临床诊断和治疗应用前景。本文利用双向热循环消减指数富集的配基系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX）技术,分别以肝癌血清和健康人血清为靶标,经过19轮筛选,获得了肝癌血清特异性核酸适配体序列1 000余条,以及健康人血清特异性核酸适配体序列1 000余条,并从中各挑取了1条高丰度适配体序列,分别命名为Tc1和Tn1。采取了50例肝癌病人血清和50例健康人血清,对适配体Tc1和Tn1与靶标血清的结合特异性进行了检测。结果显示,Tc1和Tn1对两种靶标血清的检出率分别为92%和94%。说明Tc1可特异性与肝癌血清结合,Tn1可特异性与健康人血清结合。肝癌血清特异性核酸适配体的筛选获得,将为建立基于核酸适配体的肝癌血清检测新方法奠定基础。     

SELEX技术及Aptamer研究的新进展

综述了近几年指数富集的配体系统进化(SELEX)技术的改良与寡核苷酸配基(aptamer)研究应用方面的新进展.Aptamer是指利用SELEX(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)技术,从随机寡核苷酸文库中筛选获得的能够与靶分子特异结合的短单链寡核苷酸配基,通常具有纳摩尔到皮摩尔的亲和力.高通量筛选的技术特点与aptamer精确识别、易体外合成与修饰等特性,使得aptamer在分析化学与生物医药研究方面具有广阔的应用前景.     

全细菌SELEX法筛选粪肠球菌特异性适配体

肠球菌（Enterococcus）是内源性和外源性医院感染的第二大病原菌,检出率仅次于大肠杆菌,从分子水平上发展靶标的高亲和力分子探针对肠球菌的识别和检测具有非常重要的意义。本研究以粪肠球菌为靶标,运用全细菌指数富集的配体系统进化技术（whole-bacteria systematic evolution of ligands by exponential enrichment, whole-bacteria SELEX）,从全长为79个核苷酸包含35个随机碱基序列的单链DNA文库中筛选与靶标高亲和力、高特异性结合的适配体,利用荧光分析法监控筛选过程中不同轮次所得次级文库与粪肠球菌的结合力,经12轮筛选和克隆测序,获得了39条适配体序列。进一步对筛选得到的适配体进行序列比对、二级结构分析、流式细胞分析、解离常数（Kd）测定及特异性验证,最终获得一条与粪肠球菌能特异性结合的适配体Apt 21,其Kd值为549.2 ± 147.4 nmol/L。该适配体可作为粪肠球菌检测的识别元件,为建立基于适配体的新型粪肠球菌检测方法奠定了基础。     

细胞特异性核酸适配体筛选新策略的研究进展

核酸适配体(aptamer)是在体外采用指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)从人工合成的随机寡核苷酸文库中筛选得到的一段寡核苷酸序列(RNA或DNA),能折叠成特定的三维空间结构同靶物质进行高特异性与高亲和性的结合。近年来,以全细胞为靶标筛选(cell-SELEX)获得的核酸适配体在疾病相关的领域有很大的应用潜力,尤其在细胞分子的识别、生物标志物的发现等方面,但cell-SELEX的过程复杂、难度大及获得的核酸适配体性能不佳等问题仍然制约着细胞特异性核酸适配体的进一步发展,如何高效地筛选获得核酸适配体是其应用的关键。本文总结了目前在cell-SELEX技术基础上发展起来的新方法、新策略及核酸适配体在肿瘤研究中的应用,望为相关科研人员的研究提供参考。     

SELEX技术在胰腺癌分子诊断及靶向治疗中应用的研究进展

胰腺癌由于起病隐匿,早期诊断率较低,临床治疗效果差,是目前预后最差的恶性肿瘤之一。目前,临床上尚缺乏有效的非创伤早期筛查胰腺癌的手段,因而胰腺癌的早期诊断和治疗显得尤为重要。近年来,指数富集配基的系统进化(SELEX)技术以其在其他疾病中所表现的应用价值为疾病的诊治提供了一个新的途径。对于缺乏有效确诊手段,发病隐匿且病死率高的胰腺癌而言,SELEX技术基于胰腺癌发病的分子机制,可以筛选出特异结合于胰腺癌分子靶标的适配体,对筛选所得适配体进一步化学修饰,可以实现分子水平成像及靶向治疗,进而达到胰腺癌早期诊治的目的,具有重要的临床意义。本文就SELEX技术在胰腺癌分子诊断及靶向治疗中的应用研究进展进行了综述。     

用SELEX技术筛选环孢霉素A适体

目的：运用指数富集的配体系统进化（SELEX）技术筛选并鉴定环孢霉素A（CsA）特异性适体。方法：合成全长78个核苷酸中间含35个随机序列的随机单链DNA（ssDNA）文库,通过SELEX方法,以CsA为靶标、磁珠为筛选介质,利用生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶系统检测每轮ssDNA文库与CsA的亲和力,筛选针对CsA的适体,将最后一轮筛选产物克隆测序,并运用相关软件进行一级结构和二级结构分析。结果：经过10轮筛选,ssDNA文库与CsA的亲和力呈上升趋势,随机挑选的19个克隆适体根据一级结构的同源性可分为5个家族,二级结构预测以茎环（发夹）为主。结论：通过改良SELEX方法筛选得到了CsA特异性的适体。     

SELEX技术筛选纤维蛋白适配子的研究

目的:用纤维蛋白作为靶物质对ss DNA随机序列文库进行筛选,旨在获得高亲和力的纤维蛋白适配子。方法:在体外人工合成长度为99个核苷酸的ss DNA随机序列文库,文库中间区域为63个核苷酸的随机序列,两端为18个核苷酸的固定的引物序列;然后以羧基磁珠为介质包被纤维蛋白,利用指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)对ss DNA随机序列文库进行反复筛选,当结合率不再提高时对筛选出的适配子进行连接、转化及测序分析。结果:羧基磁珠成功地包被了纤维蛋白,包被效率为87.65%,经15轮逐步递增压力的筛选,获得了纤维蛋白适配子群,经测序分析比对发现适配子有很好的多样性。结论:应用SELEX技术初步筛选出了亲和力较高的纤维蛋白适配子群,为下一步的鉴定及功能研究奠定了良好基础。     

筛选环孢霉素A适体的SELEX技术的建立

体外合成一个全长78个核苷酸,中间含35个随机序列的随机单链寡核苷酸序列(ssDNA)文库,运用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术,以环孢霉素A(CsA)为靶目标,以磁珠作为筛选介质,利用生物素 链酶抗生物素 辣根过氧化物酶系统,检测每轮ssDNA文库与CsA的亲和力,筛选并鉴定CsA特异性的适体.经过11轮的筛选,ssDNA文库与CsA的亲和力呈上升趋势.将第10轮筛选产物克隆测序并运用相关软件进行一级结构和二级结构分析.随机挑选的19个克隆适体,根据一级结构的同源性可分为5个家族,二级结构预测以茎环(发夹)为主,这可能是适体与CsA作用的部位. CsA特异性的适体将用于酶联法、免疫荧光法等对CsA进行检测.     

Selection of aptamers against KMP-11 using colloidal gold during the SELEX process

SELEX procedure is a methodology in which single stranded oligonucleotides are selected from a wide variety of sequences based on their interaction with a target molecule. We have designed a novel SELEX methodology using colloidal gold to select high affinity single stranded DNA aptamers against Leishmania infantum KMP-11. Kinetoplastid membrane protein-11 (KMP-11) is a major component of the cell membrane of kinetoplastid parasites. Although its function is not known, the fact that KMP-11 is a cytoskeleton-associated protein suggests that it may be involved in mobility or in some other aspects of the flagellar structure. We have isolated a single stranded DNA aptamer population that binds specifically to L. infantum KMP-11. This population has been characterized in a series of in vitro experiments suggesting that it may be used as a powerful tool to further investigate the role of KMP-11 during Leishmania development and/or as a diagnostic tool in Leishmania infection.     

SELEX技术筛选变形链球菌UA159适配子可行性的研究

目的:研究SELEX技术用于筛选口腔致龋菌适配子的可行性。方法:化学合成长度为35mer的随机ssDNA文库,利用SE-LEX技术,分别以变形链球菌UA159(以下简称变链UA159)、乳杆菌和离心管作为靶物质,筛选适配子,不对称PCR扩增筛选产物,所得适配子进行克隆、测序,分析其二级结构,并对其二级结构进行了初步分析。结果:显示各个靶物质的筛选产物在第二轮筛选时就已经表现出具有特征性的二级结构。结论:SELEX技术可以用于口腔致龋菌适配子的筛选。     

The Screening of RNA Aptamers Specific for Carbonic Anhydrase I Using the Systematic Evolution of Ligands by an Exponential Enrichment Method (SELEX)

Carbonic anhydrases (CA) or carbonate dehydratases are a family of enzymes that catalyze the rapid interconversion of carbon dioxide and water to bicarbonate. CA I is the most abundant protein in the cytosol and has been reported to the partially associated with a number of fatal diseases. A newly established Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) method referred to as Protein-SELEX was used to select RNA aptamers against the human erythrocyte CA I (CA I) protein. After five rounds of selection and counter selection the specific binding of the 6th cycle in vitro transcribed RNA library to CA I was detected by an Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Three Specific sequences were identified as binding candidates after cloning and sequence analysis and one of the selected CA I specific RNA aptamers, CAapt1, was used to confirm specific binding and the Kd values were determined using an EMSA. The CAapt1 RNA aptamer showed no affinity towards any other protein and in comparison to the “0” cycle library, a significant enrichment was obtained. This methodology permitted us to successfully investigate the ssRNA aptamer CAapt1 for CA I protein.