基于Cre/LoxP系统的Smad2条件基因打靶小鼠的建立

Smads家族是转化生长因子TGF-b信号转导途径中一个重要的新基因家族.SMAD2属于受体激活的SMADs.Smad2基因在多种肿瘤中发生突变,是一种可能的肿瘤抑制基因. Smad2基因完全剔除导致小鼠在胚胎期6.5d死亡.为了研究Smad2在脊椎动物成体各组织器官及肿瘤发生中的可能作用,利用Cre/LoxP系统构建了Smad2条件基因打靶载体,将两个方向相同的LoxP序列置于编码SMAD2蛋白C末端功能域序列两侧的内含子中,并在组成型表达Cre重组酶的大肠杆菌中检测了LoxP位点的功能;用打靶载体电击转染小鼠胚胎干细胞,经Southern杂交筛选到3株发生正确同源重组的中靶ES细胞克隆;通过囊胚显微注射将中靶ES细胞导入受体小鼠囊胚腔,获得了ES细胞种系嵌合体;对高嵌合度小鼠与C57BL/6J的子代小鼠进行基因型鉴定,成功地获得了Smad2条件基因打靶小鼠.     

Smad5双等位基因剔除ES细胞的建立及其初步研究

Smad5是TGF-信号的细胞质内信号转导分子. Smad5的定位剔除导致小鼠胚胎期死亡. 为了进一步研究Smad5在组织器官发育中的功能, 利用同源重组技术获得了Smad5双等位基因剔除的胚胎干(ES)细胞. 首先利用Cre-LoxP系统删除了Smad5中靶ES细胞的抗性基因, 再用相同的打靶载体进行转染, 经Southern杂交筛选获得了Smad5双等位基因剔除的ES细胞. 嵌合体研究的结果表明, Smad5在心脏和神经管的正常发育中可能起重要的作用. Smad5双等位基因剔除ES细胞在裸鼠皮下可以形成畸胎瘤, 并可分化成包括神经细胞、肌肉细胞、软骨细胞、内皮细胞等在内的多种细胞, 因而Smad5双等位基因剔除的ES细胞可用于研究Smad5介导的TGF-信号在多种组织器官发育和ES细胞体外定向分化中的作用.     

成骨细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

构建了含有骨钙素基因启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA的转基因载体pOC-Cre, 以显微注射的方法将4.6 kb的转基因片段OC-Cre导入小鼠受精卵。16只子代小鼠中经PCR和Southern杂交鉴定, 有2只小鼠携带外源基因, 整合率为12.5%。为了检测OC-Cre在转基因小鼠中表达的组织特异性, 将转基因首建者小鼠与基因组上携带有LoxP位点的条件性Smad4基因敲除小鼠交配, PCR结果显示, 仅在子代纯合型小鼠骨组织基因组中扩增出了Cre介导重组后的片段。将OC-Cre转基因小鼠与ROSA26报告小鼠交配, 利用LacZ染色对双转基因阳性子代小鼠进行检测, 结果显示Cre重组酶在成骨细胞中特异性表达并介导ROSA基因座LoxP位点间的重组。所有这些结果说明：所建立的OC-Cre转基因小鼠在成骨细胞中特异性表达Cre重组酶, 并能在体内介导成骨细胞基因组上LoxP位点间的重组, 是一种理想的研制成骨细胞特异性基因敲除小鼠的工具小鼠。     

骨关节炎相关Smad3突变基因的克隆及其初步的功能分析

以前的研究结果显示Smad3错义突变(P197N→I)可能与骨关节炎发生的病理过程有关。本研究构建了带有该点突变的Smad3 cDNA的表达载体,转染Smad3基因缺失的成纤维细胞,检测细胞培养液中MMP-2的表达水平和活性变化。结果显示,转染野生型Smad3表达载体可以使Smad3基因缺失的成纤维细胞MMP-2表达活性明显降低,而转染Smad3突变体表达载体丧失对MMP-2表达活性的调节作用。本研究结果提示骨关节炎相关的Smad3突变体可能丧失对成纤维细胞表达MMP-2的抑制作用。     

条件性定点基因捕获载体的构建

基因捕获是依赖于捕获载体的随机插入产生突变而进行基因功能研究的一类重要技术。由于传统捕获载体在捕获位点上的局限性,各种新型的捕获载体正在不断地被设计并应用于基因捕获技术。以PL-451为基础质粒,结合定点的重组酶识别位点LoxP及Frt序列,突变LoxP的1个碱基的LoxP511A和LoxP511B,SA位点以及不含启动子但有poly(A)的EGFP片断,构建了能够在捕获元件两侧克隆同源臂的条件性基因捕获载体,从而为实现可调控性基因捕获奠定基础。     

DNA重组酶Cre介导载体间基因的重组转移

DNA重组酶Cre可以识别LoxP位点,使含有LoxP位点的DNA分子发生重组:2个同向LoxP之间的DNA片段被删除,2个环状DNA分子被整合为一个大分子.基于Cre酶的这些作用特性,构建了一套载体间基因的重组转移体系,在Cre酶的作用下,gfp基因被从基因供体pTLG上切除下来,然后转移到基因受体pET-LoxP上,从而快速、简便地完成了gfp基因高效表达载体pET-gfp的构建.gfp基因在大肠杆菌BL21(DE3)中被诱导表达,使菌落产生了可视的绿色荧光.通过对荧光菌落的计数分析,比较了环状基因供体pTLG和线性基因供体pTLG对有效重组率的影响.使繁琐的传统载体构建变为简单的酶促反应,极大地简化了载体构建步骤,为Cre酶在基因克隆和亚克隆中的应用提供了很好的研究基础.     

消化道细胞表达Cre重组酶转基因小鼠的功能鉴定

目的:检测白蛋白启动子介导的Cre重组酶转基因小鼠Alb-Cre-2中Cre重组酶的组织分布及其在体内介导基因重组的作用。方法:将Alb-Cre小鼠与Smad4条件基因打靶小鼠交配,利用PCR对Cre重组酶介导重组的组织特异性进行检测;然后,将Alb-Cre-2转基因小鼠与ROSA26报告小鼠交配,利用LacZ染色对双转基因阳性子代小鼠进行检测。结果:PCR结果显示心、肺、胰、脑及消化道中Cre重组酶介导的Smad4基因发生重组;LacZ染色进一步表明Cre重组酶在肝细胞、胃壁细胞、空肠潘氏细胞、回肠杯状细胞、大肠杯状细胞、大肠柱状细胞及空泡细胞中特异性表达,并介导ROSA位点LoxP序列间的重组。结论:Alb-Cre-2转基因小鼠在消化道中具有一定的组织特异性,只在胃壁细胞、空肠潘氏细胞、回肠杯状细胞、大肠杯状细胞,大肠柱状细胞及空泡细胞等细胞类型中特异性表达,并能在体内成功地介导这些消化道上皮细胞基因组上LoxP位点间的重组,是一种研制在消化道特定细胞中特异性基因剔除小鼠的良好工具小鼠。     

靶向Smad4基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的:构建编码Smad4mRNA的shRNA真核表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法:根据GenBank提供的人Smad4基因的mRNA序列构建2个shRNA质粒表达栽体和1个阴性对照质粒表达载体,并通过基因测序进行鉴定.经鉴定后转染体外培养人成纤维细胞,western-blot检测Smad4蛋白水平抑制表达效果.结果:构建质粒表达载体测序结果显示,插入片段测序结果与合成的shRNA序列一致;靶向Smad4基因shRNA质粒表达栽体对所转染的人成纤维细胞中Smad4蛋白水平表达均有抑制作用,其中shRNA1最为明显.结论:成功构建了靶向Smad4基因shRNA质粒表达栽体,其中抑制Smad4基因表达效果最为明显的是shRNA1,为进一步研究Srnad4基因的RNA干扰奠定了基础.     

双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定

利用DNA同源重组方法(基因打靶)对动物基因组进行修饰是转基因研究的重要手段之一。为了构建一个高效的通用型基因打靶载体,本研究以pBS246质粒为骨架,在两个LoxP序列之间插入正筛选标记新霉素磷酸转移酶(neo)基因和绿色荧光蛋白(EGFP)基因;在两个LoxP序列外侧分别插入两组携带"8碱基"酶切位点的多克隆位点序列(MCS-1和MCS-2)和负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因,构建成通用型基因打靶载体pGT-V1,并且在C2C12细胞中验证了载体中各个元件的功能。该载体具有如下特点:1)在载体中引入绿色荧光标记,可以实时监控载体的转染效率,而转染效率的提高为高效基因打靶提供了保证;2)在两个LoxP位点间插入绿色荧光标记,可以直观监测打靶后遗留的筛选标记的去除情况,并且可以通过流式细胞仪或免疫磁珠法,将最终去除了筛选标记的阳性细胞(即丢失绿色荧光的细胞)分选出来,降低筛选标记在中靶细胞中可能产生的负面影响;3)采用"8碱基"酶切位点的MCS序列,便于DNA大片段的连接和重组,极大提高了该载体的通用性。总之,该载体优化了基因打靶的技术手段,为有效开展基因打靶和转基因动物研究提供了新平台。     

小鼠Smad6基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

构建小鼠Smad6基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,有效沉默骨髓树突状细胞（BMDC）的Smad6基因表达,为构建骨髓致耐受DC用于哮喘等自身免疫疾病的研究。设计小鼠Smad6 shRNA序列,合成、退火,得到双链DNA,与经酶切后的Psih1-H1-copGFP shRNA Vector载体连接产生LV-shSmad6慢病毒载体,并测序鉴定。转染293TN细胞,包装产生慢病毒,测定滴度。感染小鼠骨髓树突细胞,检测Smad6基因的表达状况成功构建Smad6 shRNA的慢病毒载体LV-shSmad6。包装慢病毒,并显著抑制Smad6 mRNA水平及蛋白水平的表达。成功构建出小鼠Smad6基因shR-NA慢病毒载体,为后期研究Smad6基因在哮喘发病机制及新治疗方法提供了稳定的转染细胞载体。     

Recent advances in the study of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and pathogenesis

It has now been over twenty years since a novel herpesviral genome was identified in Kaposi's sarcoma biopsies. Since then, the cumulative research effort by molecular biologists, virologists, clinicians, and epidemiologists alike has led to the extensive characterization of this tumor virus, Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus(KSHV; also known as human herpesvirus 8(HHV-8)), and its associated diseases. Here we review the current knowledge of KSHV biology and pathogenesis, with a particular emphasis on new and exciting advances in the field of epigenetics. We also discuss the development and practicality of various cell culture and animal model systems to study KSHV replication and pathogenesis.     

The structure, reproduction and taxonomy of Vidalia and Osmundaria (Rhodophyta, Rhodomelaceae)

Comprises species occurring mostly in subtidal habitats in tropical, subtropical and warm-temperate areas of the world. An analysis of the type species, V. spiralis (Sonder) Lamouroux ex J. Agardh, a species from Australia, establishes basic characters for distinguishing species in the genus. These characters are (1) branching patterns of thalli, (2) flat blades that may be spiralled on their axis, (3) width of the blade, (4) primary or secondary derivation of sterile and fertile branchlets and (5) position of sterile and fertile branchlets on the thalli. Application of the latter two characters provides an important basic method for separation of species into three major groups. Osmundaria , a genus known only in southern Australia, was studied in relation to Vidalia , and its separation from the Vidalia assemblage is not accepted. Species of Vidalia therefore are transferred to the older genus name, Osmundaria. Two new species, Osmundaria papenfussii and Osmundaria oliveae are described from Natal. Confusion in the usage of the epithet, Vidalia fimbriala Brown ex Turner has been clarified, and Vidalia gregaria Falkenberg, described as an epiphyte on Osmundaria pro/ifera Lamouroux, is revealed to be young branches of the host, Osmundaria prolifera.     

New or rare chromosome counts in Artemisia L. (Asteraceae, Anthemideae) and related genera from Kazakhstan

Fifteen chromosome counts of six Artemisia taxa and one species of each of the genera Brachanthemum, Hippolytia, Kaschgaria, Lepidolopsis and Turaniphytum are reported from Kazakhstan. Three of them are new reports, two are not consistent with previous counts and the remainder are confirmations of very scarce (one to four) earlier records. All the populations studied have the same basic chromosome number, x = 9, with ploidy levels ranging from 2x to 6x. Some correlations between ploidy level, morphological characters and distribution are noted.     

肝癌中HBV和HCV基因和抗原的分布及意义

采用原位分子杂交方法检测HCV RNA及HBV X基因;采用免疫组织化学方法研究HCV核心抗原,非结构区C33c抗原及HBxAg在肝细胞肝癌中的定位及分布.结果表明(1)HCV RNA、HBV X基因在肝细胞肝癌组织检出率分别为40%(55/136)和82%(112/136).HCV RNA定位于癌细胞的胞浆内,阳性细胞呈散在、灶状及弥漫分布三种形式;HBV X基因在肝癌细胞中的分布呈胞浆型、核型及核浆型,阳性细胞也呈上述三种分布形式;(2)HCV C33c抗原、核心抗原在肝细胞肝癌中的阳性率为81%(133/164)及86%(141/164).C33c抗原定位于癌细胞及肝细胞的胞浆内;核心抗原既定位于癌细胞核中,又可定位于胞浆中.C33c抗原阳性细胞以灶状分布为主;而核心抗原阳性细     

Selection with two alleles and complete dominance

For a plant selection model with frequency-independent viabilities, fertilities and selfing rates, it is shown that apart from global fixation, for certain parameter combinations a protected polymorphism and facultative fixation (either allele may become fixed according to initial frequencies) may both occur. Facultative fixation requires different selling rates for the dominant and recessive type. Protection of the polymorphism requires resource allocation for male and female function. In this connection the problem of purely genetically caused population extinction is discussed.
For general frequency dependence and regular segregation, the chances for establishment of a completely recessive gene are compared to those of a completely dominant gene. It is proven that the process of establishment of the recessive gene, despite a fitness advantage, may be considerably endangered by drift effects if random mating prevails. The recessive gene may reach the same effectivity in establishment as a dominant gene, only if the recessive homozygote mates exclusively with its own type during the period of establishment.