大麦条纹花叶病毒新疆株3''''端基因组的克隆及分析

我们应用多次加尾的方法,对大麦条纹花叶病毒新疆株的RNAs基因组进行克隆。在所述条件下可以合成2000～3000核苷酸长度的cDNA。通过原位杂交、转印杂交(Northern blot)证明所得克隆属于RNA_1和RNA_3组分,并包含有3′端基因组结构。对部分克隆进行了酶谱分析。     

利用交换接头技术构建大麦条纹花叶病毒新疆株RNA_2的全长cDNA克隆

本文采用双股交换接头(Crossover linker)技术对已建立的大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA_2 cDNA重组质粒pUBS_(112)进行修饰。使cDNA两端不必要的poly(dG):poly(dC)尾准确地缺失,同时补上了cDNA中相对于RNA_2 5’端区缺少的三个核苷酸TAA,并在cDNA末端插入了预定的限制酶切顺序。通过原位杂交筛选、酶切图谱分析、cDNA两端序列测定等手段,证明已获得BSMV-XJ RNA_2组分的全长cDNA克隆。     

大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA_2的cDNA克隆及5′端序列分析

分离了大麦条纹花叶病毒(BSMV)新疆株基因组的3个RNA组份。以RNA2为模板,3′端互补寡核苷酸为引物,合成了第一条cDNA链和第二条cDNA链,将ds-cDNA重组在pUC9质粒中,转化大肠杆菌细胞,获得含RNA3′端的克隆,并证明所选克隆的cDNA含有新疆株几近全长的RNA2组份。对于插入片段为3.3kbp的112号克隆进行了酶谱分析,得到了与国外典型株类似的结果;用双脱氧终止法分析了相当于RNA 2 5′端250bp的cDNA酶切片段,表明与国外典型株有十分相似的一级结构。     

新疆大麦条纹花叶病毒的研究——Ⅰ.病毒株系类型的鉴定及核酸的体外翻译

我国大麦条纹花叶病毒(BSMV)新疆分离物的RNA,在50％甲酰胺6％甲醛中,50℃处理15分钟,使RNA分子链呈真正的均一状态后,在含甲醛的琼脂糖凝胶上电泳,核酸变性电泳结果显示该病毒为三组分RNA株系,编号为RNA_1,RNA_2,RNA_3,分子量分别为1.40—1.44×10~(?),1.20—1.28×10~0,1.06—1.09×10~6。经制备凝胶电泳分离出的各RNA组分在兔网织红细胞溶胞液的无细胞体系中,RNA_1的翻译产物为120K的蛋白,RNA_2翻译产物主要为25K和一个85K蛋白,其中25K蛋白由于与天然BSMV外壳蛋白共电泳,该蛋白中没有甲硫氨酸,以及能被BSMV抗血清沉淀,而被确定为BSMV外壳蛋白。RNA_3的翻译产物为75K蛋白。     

在枯草杆菌中有启动子功能的噬菌体T5 DNA片段的克隆

用启动子探针质粒pTG 402为载体,用鸟枪射击法克隆了噬菌体T5 DNA的片段。克隆中的2％含有具启动子功能的插入片段,其中pTG 402-20含有启动功能最强的插入片段。DNA-DNA分子杂交实验结果表明,pTG 402-20的插入片段能与T5 DNA Hind Ⅲ酶切的G和B片段杂交。这个插入片段的大小约为0.84kb。     

PCR介导HaNPV罹病幼虫潜伏期cDNA文库的构建

以罹病棉铃虫幼虫为材料提取总RNA ,反转录合成cDNA第一链 ,加oligo(dG)同聚尾 ,PCR扩增合成双链cDNA ,克隆到 pGEM T质粒载体中。随机筛选文库中阳性克隆 ,经酶切分析 ,cDNA插入片段大小在 0 .3～ 1.1kb之间。文库中原代重组子数为 1.66× 10 5,重组百分比为 87.8%。重组质粒的杂交分析表明 ,文库中HaNPV基因的cDNA克隆所占比例超过 50 %。     

鱼类抗冻蛋白的研究——Ⅱ.黄盖鲽抗冻蛋白基因cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

产于我国黄海的黄盖鲽(Pseudopleuronectes yokohamae)体内含有能阻止血液冰冻的抗冻肽(Antifreeze peptide AFP)。在对该蛋白进行纯化及对其特性的一系列研究的基础上,我们合成了一段抗冻肽基因的寡核苷酸片段。以此为引物,与黄盖鲽的mRNA进行杂交,从而特异性地反转录出抗冻肽基因cDNA片段。该片段经EcoRI Linker连接法克隆至大肠杆菌(E.coli)质粒载体pUC19上。抗冻肽cDNA插入片段经杂交证实后,对其进行了酶谱分析,核酸序列测定。重组克隆还在大肠杆菌JM83中得到了表达。     

PCR介导HaNPV罹病幼虫潜伏期cDNA文库的构建

以罹病棉铃虫幼虫为材料提取总RNA,反转录合成cDNA第一链, 加oligo(dG)同聚尾,PCR扩增合成双链cDNA,克隆到pGEM-T质粒载体中.随机筛选文库中阳性克隆,经酶切分析,cDNA插入片段大小在0.3～1.1kb之间.文库中原代重组子数为1. 66×105,重组百分比为87.8%.重组质粒的杂交分析表明,文库中HaNPV基因的cDNA克隆所占比例超过50%.     

非洲绿猴肾细胞株AGMr（HindⅢ）—1高度重复顺序的克隆及初步应用

从非洲绿猴肾细胞株分离高度重复顺序AGMr（HindⅢ）－1基因,以pUC18质粒为载体构建重组质粒pUC18／AGMr（HindⅢ）－1,转化E．coliJM83。酶切分析、SouthernBlot分析和序列分析均证明克隆成功,但所用的第165代Vero细胞株与另一非洲绿猴肾BSC－1细胞株的序列相比较,172个碱基中有6个位点突变。用该重组质粒作探针,对Vero细胞培养的狂犬疫苗作SouthernBlot分析表明,未经纯化的半成品中残余细胞DNA长度约400～5000bp。斑点杂交分析表明,杂交特异性良好,残余细胞DNA最小检出量约4pg。提示AGMr（HindⅢ）－1高度重复顺序可特异地应用于Vero细胞残余DNA检测。     

芜菁花叶病毒（TUMV）核酸cDNA的合成与克隆

从接种芜菁花叶病毒后发病芥菜(Brassica Juneaen)中提取病毒,然后提取其核酸(TuMV-RNA)。以纯化的TuMV-RNA为模板,以Oligo(dT)_(12-18)及小牛胸腺DNA水解物为引物,合成双链cDNA,双链cDNA长度约500—4300bp。将双链cDNA补齐后,钝端连接到pUC19质粒的Smal位点,转化E.coli DH,获得500多个白色克隆。菌落原位杂交及酶切分析表明,重组质粒中的插入片段大多数为芜菁花叶病毒RNA的互补DNA,长度为500—4000bp。     

变形链球菌DNA酶切片段在大肠杆菌中克隆的研究

将变链菌染色体DNA和pBR322 DNA,分别用HindⅢ酶切,再用T_4DNA连接酶连接,转化到大肠杆菌R_5受体菌中。根据插入灭活的原理,筛选Ap~r、Tc~s菌株,并经抗药性、琼脂糖凝胶电泳,酶切、核酸杂交及再转化等试验证明,已将变链菌DNA酶切片段克隆到大肠杆菌中,获得2627个克隆株,建立了基因库。为筛选变链菌保护性抗原基因,进一步研制基因工程龋齿菌苗奠定了基础。     

萘质粒ND1.860HindⅢ片段的分子克隆和限制酶图谱

萘质粒ND1.860经限制性核酸内切酶HindⅢ完全消化和部分消化所产生的限制片段,分别在大肠杆菌质粒pBR322中克隆。通过对含有ND1.860HindⅢ片段的17个重组质粒进行限制酶分析,建立了ND1.860质粒的HindⅢ、EcoRⅠ和XbaⅠ种内切酶26个切点的酶切图谱。     

重组真核质粒pCMV4-rZP3′构建及在小鼠体内的表达

选取兔透明带ZPC基因序列的部分片段（编码263－415位的氨基酸,rZP3′）作为靶抗原,构建兔ZP3′基因疫苗,研究其阻断受精的效果。提取成熟雌兔卵巢的总RNA,RT－PCR克隆兔透明带ZPC的cDNA,直接插入到克隆质粒PCRR2．1中,构建克隆质粒PCRR2．1－rZP3′,再将靶片段用HindⅢ、X-bal双酶切从克隆质粒PCRR2．1－rZP3′切下,1％的低熔点琼脂糖电泳回收,亚克隆到真核表达质粒pCMV4中,构建真核表达质粒pCMV4-rZP3′。将质粒直接注射到活体小鼠的大腿内侧肌肉中,在mRNA水平上观察到质粒能在肌肉细胞中正确表达,并且其表达可以维持12周以上。     

鹅源腺病毒基因组DNA物理图谱的构建

将鹅源腺病毒Y81G4株全基因组DNA的HindⅢ酶切片段分别插入质粒pUC18, 成功构建了全基因组DNA文库.在此基础上,将重组质粒携带的插入片段切出、回收并分别用地高辛标记后作为探针,与经限制酶BamHI、EcoRI、PstI、Eco RV消化的病毒基因组DNA进行Southern Blotting,杂交结果经比较综合后获得了该病毒基因组DNA的HindⅢ、Ba mH I、EcoR I、PstI、EcoR V限制性内切酶的物理图谱.利用已发表的含有鸡EDS76病毒AA-2 株基因组DNA右末端的重组质粒pBE42作为探针,与本病毒两末端重组质粒进行Southern Blo tting,根据同源性杂交结果确定了本病毒基因组DNA物理图谱与EDSVAA-2株相应的方向. 本病毒基础因组DNA物理图谱的精确构建,为进行基因组结构分析,筛选复制非必需区,构建禽腺病毒载体打下了基础.     

流行性出血热病毒R22株cDNA克隆及其特异性鉴定

用家鼠型流行性出血热病毒R22株RNA,经polyA接尾,以Oligo-dT做引物,合成cDNA。用pUC18为载体转染E.coli Mc1061,建立cDNA克隆。再经菌落杂交,选择病毒特异性的5个阳性克隆制成缺口翻译探针,与病毒RNA3个片段进行反杂交,确定RNA片段的特异性。结果表明,3个克隆为中(M)片段的cDNA,另两个分别为大(L)和小(S)片段cDNA。核苷酸序列分析证明,克隆的DNA中含病毒特异的核苷酸序列。     

用PCR扩增和克隆鸡传染性贫血病毒全基因组DNA

根据已发表的序列,分别在鸡贫血病毒(CAV)环形基因组DNA(全长2.3kb)的EcoRI位点和BamHI位点的两侧选择适当序列合成两对引物,用PCR技术,从斑点杂交检测到病毒核酸的CAV感染的MDCC-RP1细胞基因组DNA中,分别扩增出包含EcoRI和BamHI分割开的病毒基因组两部分(1.5kb和0.8kb)约1.5kb和约1.25kb的两个片段.再将其中相应序列拼接克隆进pUC18载体,获得包含CAV全基因组序列DNA片段的克隆质粒pCAV2.4.酶切分析表明,该质粒具有预期的BamHI位点、PstI位点、HindⅢ位点,而预期的EcoRI位点消失.重组质粒插入DNA片段的两端序列分析表明,质粒pCAV2.4是包含CAV全基因组序列的重组质粒,插入DNA片段序列中的EcoRI位点序列发生了一个碱基突变.     

BALB/c小鼠金属硫蛋白-1 cDNA基因在乳酸菌质粒表达载体pNZ2103上的克隆

目的用乳酸菌质粒表达载体pNZ2103克隆BALB／c小鼠金属硫蛋白（MT）-1 cDNA基因。方法设计一对含有限制酶Pst1和HindⅢ位点的引物。以质粒pET21a-MT为模板,采用PCR法扩增BALB／c小鼠MT-1cDNA。用限制性内切酶Pst1和HindⅢ将MT-1 cDNA克隆于质粒pNZ2103形成重组质粒pNZ2103-MT。将pN2103-MT转化进入大肠埃希菌DH5α。采用PCR法和Pat1、HindⅢ双酶切方法鉴定含有pNZ2103-MT的转化子。12％ SDS-PAGE鉴定pNZ2103-MT在大肠埃希菌DH5α的表达水平。结果获得含有pNZ2103-MT的DH5α转化子。结论以乳酸菌质粒表达载体pNZ2103构建的pNZ2103-MT在大肠埃希菌中表达水平较低,采用SDS-PAGE难以检测到表达水平的金属硫蛋白。     

棒杆菌启动子片段的酶谱分析及定位

用大肠杆菌启动子探测质粒pSDS I (Ap^r,Tc^s)从钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)6282染色体的HindⅢ酶切片段中,克隆到两个具有启动功能的DNA片段,分别将两个重组质粒命名为pSDB5和pSDB21。含有这两个质粒的菌株均可以在含300μg/ml Tc的平板上生长。通过酶切分析,pSDB5的插入片段为1.6kb,pSDB21的插入片段为3.4kb,并分别作出了它们的限制性酶切图谱。对pSDB21利用其EcoR Ⅰ和BglⅡ位点,通过亚克隆删除了与启动功能无关片段,构建成pSDB210和pSDB211,从而使启动子定位于约0.1kb的BglⅡ/HindⅢ外源片段上。分子杂交实验证明所得到的这两个具有启动功能的DNA片段确实来源于钝齿棒杆菌6282的染色体DNA。     

具有原核基因启动子活性的蓖麻蚕染色体DNA片段

利用大肠杆菌启动子克隆载体pHE5,研究了蓖麻蚕染色体的Hind Ⅲ酶解片段在大肠杆菌中作为四环素抗性基因启动子的功能作用。蓖麻蚕染色体的Hind Ⅲ片段与pHE5重组,在大约10~6个重组子中获得953株启动子重组体。测定了这些含有重组质粒的菌株抗四环素能力,其中有4株在平板上抗四环素水平超过225微克/毫升。对其中pARP201的插入片段进行了限制性图谱分析和启动子活性区域的缺失定位,证明了pARP-DB(由pARP201衍生而来)中的约0.5kb的外源插入片段具有完整的原核启动子功能。我们分析了这段DNA的部分核苷酸顺序,发现它与原核基因启动子极其相似。     

脊髓灰质炎病毒中Ⅰ9株基因组克隆及其部分结构分析

以脊髓灰质炎病毒RNA为模板,反转录合成了长链ds-cDNA。将合成的脊灰病毒中I9株ds—cDNA片段重组到质粒pAT153上,获得了约占脊灰病毒中I9基因组95％以上的cDNA克隆。对克隆的中I9cDNA部分片段作了限制性内切酶图谱分析和部分核酸的序列分析,发现脊灰病毒中I9部分核酸顺序有所改变。