VdToxD1和VdToxD3调控大丽轮枝菌微菌核的萌发

大丽轮枝菌Verticillium dahliae是一种土传性植物病原真菌,可侵染660多种植物,引发黄萎病。微菌核是大丽轮枝菌在侵染后期形成的特殊休眠结构,可在土壤中存活14年,是黄萎病的主要初侵染来源。本研究在前期大丽轮枝菌萌发与休眠微菌核转录组分析的基础上,选择微菌核休眠状态高表达的VdToxD1和VdToxD3基因进行功能研究。结果发现,VdToxD1和VdToxD3敲除突变体菌株的微菌核萌发率分别为87.3%和86.0%,显著高于野生型菌株的64.0%;负调控微菌核萌发的转录因子VdCrz1与VdToxD1上游的-937 bp到-349 bp中的特定基序结合,与VdToxD3上游的-752 bp到-496 bp中的特定基序结合,结合位点均位于2个基因的启动子区。     

大丽轮枝菌VdSCH9基因的功能研究

大丽轮枝菌是一种土传性植物病原真菌,可侵染多种植物并引发黄萎病。目前,人们关于大丽轮枝菌的侵染和致病机制的了解还很不深入。本文通过敲除大丽轮枝菌编码丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶基因VdSCH9,阐明了其在大丽轮枝菌生长发育及致病过程中的作用。SCH9基因在酵母中的表达与cAMP-PKA途径和TOR信号通路相关,对酵母的生长、压力响应和寿命等有重要作用。大丽轮枝菌VdSCH9敲除突变体的生长速率显著下降,菌落边缘菌丝更为稀疏,菌丝分枝减少,对棉花植株为害的平均病情指数为56.6,显著低于野生型和互补突变体的平均病情指数90.5和82.8,对茄子植株为害的平均病情指数为65.9,也显著低于野生型和互补突变体的平均病情指数91.1和89.8。另外,敲除突变体对于高渗透压、氧化还原压力、细胞膜和细胞壁完整性等压力条件的敏感性增强。因此,VdSCH9对于大丽轮枝菌的生长、压力响应及致病力均有重要作用。     

大丽轮枝菌致病及微菌核形成相关基因研究进展

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)致病力强且宿主范围广,能以微菌核的形式在土壤中存活多年,当遇到合适的宿主就萌发,因此极难防控,对农业生产造成巨大危害。目前已经发现多种影响大丽轮枝菌致病力的基因,最为重要的发现为大丽轮枝菌能够形成侵入钉入侵植物,许多效应因子也是由侵入钉颈环处分泌出大丽轮枝菌并最终调控植物的免疫防御。同时,研究也表明黑色素对于形成成熟的微菌核非常关键,并且许多与微菌核形成相关的基因也与大丽轮枝菌致病相关。但目前的研究尚未完全阐明大丽轮枝菌如何导致植物萎蔫坏死以及微菌核形成的分子机理。综述了近年来有关大丽轮枝菌致病及微菌核相关基因的研究进展,以期为大丽轮枝菌致病及微菌核形成机理的进一步研究奠定理论基础。     

大丽轮枝菌（Verticillim dahliae）突变体库的构建与分析

为了更加快捷地筛选大丽轮枝菌致病关键基因,利用聚乙二醇介导的原生质体转化法构建病原菌随机插入突变体库,对部分阳性转化子的生长表型指标和致病力进行分析,筛选生长发育与致病缺陷突变体并进行靶标基因定位。结果表明,本研究共获得13 030多个阳性转化子,随机挑选5个转化子与V991野生型菌株进行比较分析,发现其中一个突变体在PDA和不同碳源培养基上的菌落直径、产孢量以及致病力均显著降低。侧翼序列测序结果结合Blast比对分析表明,该缺陷突变体中的潮霉素抗性基因表达盒定位于大丽轮枝菌3号染色体1 528 782 bp处,属于内切葡聚糖酶1基因（VDAG＿04017）。综上所述,本研究通过大丽轮枝菌插入突变体库构建、突变体生长表型指标和致病力鉴定及靶标基因定位等一系列分子生物学手段,可初步鉴定病原菌致病相关基因,为从全基因组层面深入研究大丽轮枝菌致病机制奠定了一定基础。     

大丽轮枝菌甘油-3-磷酸脱氢酶的功能分析

大丽轮枝菌可侵染棉花、马铃薯、番茄等660余种寄主植物,引致黄萎病,造成严重的经济损失。为了深入了解大丽轮枝菌的致病机制,本研究在前期棉花提取物诱导大丽轮枝菌转录组分析的基础上,选择上调差异表达的线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶基因VdGut2(VD592＿6958＿Chr4)和非差异表达的胞质甘油-3-磷酸脱氢酶基因VdGpd(VD592＿10256＿Chr2),进行了功能分析。结果表明,两个VdGut2敲除突变体菌株的产孢量较野生型菌株分别下降了32%和41%,病情指数分别下降了70%和51%,菌落生长速率也显著下降;VdGpd过表达菌株产孢量和病情指数较野生型菌株显著下降,但在甘油为唯一碳源的培养基上其菌落生长速率显著上升。因此,VdGut2促进了大丽轮枝菌分生孢子的形成、碳源的利用以及对寄主植物的致病过程,VdGpd抑制了大丽轮枝菌分生孢子的形成和对寄主植物的致病力,却促进了甘油的代谢。     

高毒力大丽轮枝菌特异片段SCF73突变株的构建及其致病力测定

[目的]初步明确高毒菌株VDG1特异片段SCF73与大丽轮枝菌致病力的关系.[方法]通过比较基因组学分析和PCR鉴定,明确大丽轮枝菌高毒菌株VDG1相对于低毒菌株VDG2的特异片段SCF73 ;构建SCF73片段敲除质粒,导入农杆菌AGL-1,应用农杆菌介导法转化大丽轮枝菌VDG1,抗性筛选和PCR扩增鉴定SCF73敲除转化子 ;利用果胶、纤维素和淀粉培养基模拟分析ΔSCF73降解细胞壁组分的能力,采用定量蘸根接种法鉴定其对感病棉种军棉1号的致病力.[结果]确定了大丽轮枝菌VDG1的特异片段SCF73,长度为27.1 kb,预测编码5个基因,推测2个基因具有水解酶功能 ;筛选获得了3个ΔSCF73突变株 ;突变株利用细胞壁组分的能力与野生型菌株VDG1相比无显著差异 ;突变株对感病棉种军棉1号的致病力显著减弱.[结论]高毒力菌株VDG1特异片段SCF73在大丽轮枝菌致病过程中具有重要作用.     

膜泡运输蛋白VdSec22参与大丽轮枝菌胞外蛋白的分泌和致病性

摘要:【目的】验证大丽轮枝菌分泌途径中一个膜泡运输蛋白VdSec22的功能,为防治棉花黄萎病提供潜在的生物靶点。【方法】利用“正负双向筛选法”的方法,构建大丽轮枝菌VdSec22蛋白编码基因缺失的突变体菌株ΔQF。通过农杆菌介导的转化,将其编码基因VdSec22重新导入ΔQF构建了功能回补菌株CΔQF。以野生型菌株为对照,检测上述菌株分泌胞外蛋白(果胶酶、纤维素酶和毒素蛋白)的能力;采用蘸根接种的方法,检测上述菌株对棉花致病性的差异。同时通过定量PCR检测内质网分子伴侣表达量的方法,推断突变体菌株ΔQF中是否发生了内质网应激反应。【结果】成功构建了基因敲除突变体ΔQF和功能回补菌株CΔQF。突变体菌株ΔQF的果胶酶、纤维素酶、毒素蛋白的分泌能力和对棉花的致病性均较野生型减弱,并且产生了内质网应激反应。重新导入VdSec22基因可弥补突变体菌株ΔQF的上述缺陷。【结论】VdSec22是大丽轮枝菌的一个重要分泌途径蛋白,在大丽轮枝菌诸多胞外致病蛋白的分泌和棉花致病性中起重要作用。VdSec22可作为防治棉花黄萎病的潜在生物靶点。     

大丽轮枝菌异核体及其后代的形态与致病力变异

以硝酸盐利用缺陷型突变（nit突变）和抗杀菌剂突变两种遗传标记,对大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae）异核体后代的形态和致病力进行研究,结果表明,菌核型菌株与菌丝型菌株经菌丝融合形成异核体后,菌丝型菌株能恢复形成微菌核,其后代单孢菌落形成微菌核的数量明显低于菌核型亲本,且遗传性状不稳定;随着转代次数的增多,微菌核形成能力的丧失较菌核型亲本菌株快。异核体后代对棉苗的致病力变化较大,一般均低于致病力强的亲本菌株,或介于两个亲本致病力之间,或与亲本致病力相近。     

大丽轮枝菌异核体及其后代的形态与致病力变异*

以硝酸盐利用缺陷型突变（nit突变）和抗杀菌剂突变两种遗传标记,对大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae）异核体后代的形态和致病力进行研究,结果表明,菌核型菌株与菌丝型菌株经菌丝融合形成异核体后,菌丝型菌株能恢复形成微菌核,其后代单孢菌落形成微菌核的数量明显低于菌核型亲本,且遗传性状不稳定;随着转代次数的增多,微菌核形成能力的丧失较菌核型亲本菌株快。异核体后代对棉苗的致病力变化较大,一般均低于致病力强的亲本菌株,或介于两个亲本致病力之间,或与亲本致病力相近。     

新生隐球菌RBP1基因克隆与功能分析

新生隐球菌是自然界广泛存在的具荚膜的酵母型病原真菌,能侵染人类中枢神经系统引起真菌性脑膜炎,每年导致全球大约18万人死亡。本研究在前期隐球菌交配表达谱的基础上,选择一上调表达的RNA结合蛋白基因（CNAG_04772）,进行克隆和功能分析。结果表明该基因全长2 247bp,cDNA全长1 518bp,编码505个氨基酸组成的蛋白,含有2个RNA识别基序RRM1和RRM2,命名为RBP1。基因表达模式分析表明RBP1在隐球菌酵母细胞、担子以及担孢子阶段都有表达,交配菌丝阶段不表达;亚细胞定位分析表明Rbp1蛋白定位于隐球菌的细胞核和细胞质中。与野生型菌株H99相比,敲除突变体菌株能够交配并产生双核菌丝,但丧失产生担孢子的能力,而互补菌株与野生型菌株H99间无显著差异。致病力测定结果显示,敲除突变体菌株致病性显著降低。     

罗伯茨绿僵菌中嘧啶前体合成酶基因MrThi12的功能研究

通过同源基因比对,在罗伯茨绿僵菌中找到了单拷贝的嘧啶前体合成酶基因MAA_02402,命名为MrThi12。该基因MrThi12全长1 234bp,cDNA序列全长1 029bp,编码342个氨基酸。构建同源重组载体,利用农杆菌介导的方法进行基因敲除。突变菌株在维生素B1缺乏的培养基上,生长很慢,菌丝形态异常,多分叉,完全不能产生气生菌丝和分生孢子。但是一旦有外源维生素B1时,生长状态能完全恢复,对家蚕的致死能力没有变化。     

组蛋白甲基化与去乙酰化对蛇足石杉内生真菌盘长孢状刺盘孢合成石杉碱甲的影响

以蛇足石杉Huperzia serrata内生真菌盘长孢状刺盘孢Cg01菌株为研究对象,利用PEG介导的同源重组转化体系,对Cg01组蛋白甲基化酶基因（histone methyltransferases,HMT）CgClr4和组蛋白去乙酰化酶基因（histone deacetylase,HDAC）CgClr3、CgSir2进行基因敲除与回补,并通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测了回补株中对应基因表达量以及高效液相色谱HPLC检测突变体菌株中石杉碱甲huperzine A（HupA）产量。结果显示3个基因敲除突变体菌株ΔCgClr4、ΔCgClr3、ΔCgSir2的HupA产量分别为255μg/L、270μg/L、244μg/L,与野生型菌株相比分别下降了21.3%、16.6%、24.7%。在基因回补突变体菌株ΔCgClr4/CgClr4、ΔCgClr3/CgClr3、ΔCgSir2/CgSir2中,相应回补基因表达均与野生型无显著性差异,其HupA产量分别为351.9μg/L、334.7μg/L、331μg/L,回补菌株的HupA产量回复到野生型水平。结果表明这3个基因均具有调控内生真菌盘长孢状刺盘孢Cg01合成HupA的作用,为研究蛇足石杉内生真菌中石杉碱甲的合成调控机制提供了理论基础和新的思路。     

肺形侧耳线粒体基因组多态性鉴定

线粒体是能量转化与ATP形成的重要场所,已有多种食用真菌的线粒体基因组被相继组装注释,但肺形侧耳的线粒体基因组鲜有报道。本研究对野生肺形侧耳X2菌株的线粒体基因组进行组装并注释,由野生菌株X2与主栽菌株JX线粒体大片段差异序列,构建分子标记来鉴别野生和主栽肺形侧耳菌株。结果显示X2的线粒体基因组为大小75 709bp的闭合环状结构,含有rRNA的大小亚基基因,25个负责携带氨基酸的tRNA基因以及14个常见蛋白编码基因,在cox1基因上含有9个内含子。内含子主要为IB型,包含LAGLIDADG_1 superfamily、GIY-YIG_Cterm superfamily保守结构域。位于菌株X2与JX内含子和基因间区上的大片段差异序列,是造成种内线粒体多态性的主要因素。根据两菌株的差异片段构建系统进化树的结果显示,内含子、rnl-trnX、trnD-atp6序列能够将两株野生菌株和其他主栽菌株区分开,可用于野生肺形侧耳种内鉴定,而且trnD-atp6效果最佳。     

尖孢镰刀菌亚麻专化型Folprp4基因参与调控菌丝生长和分生孢子发生

目的: 通过对尖孢镰刀菌中Folprp4基因的鉴定,揭示其在尖孢镰刀菌中的功能及致病相关性。方法: 基于同源重组原理,根据测定出的Folprp4基因序列,应用Split-Marker重组技术构建含有潮霉素抗性基因(hph)的基因缺失盒。将基因缺失盒经PEG介导转化到野生型原生质体中,在含有潮霉素B的TCC培养基上筛选转化子,通过PCR正负筛查获得Folprp4基因缺失突变株(ΔFolprp4)。构建含有Folprp4基因的载体pZDH1,并将其转化到敲除突变体中进行互补测验。结果: 与野生型(hm)和异位插入突变体(ecFolprp4)相比,敲除突变体菌丝生长受到严重阻碍,当野生型和异位插入突变体长满整个平板时,敲除突变体菌落呈小点状。敲除突变体的另一个显著变化是ΔFolprp4的分生孢子产量显著下降。侵染实验表明,ΔFolprp4对亚麻幼苗的毒力显著降低。互补实验表明,该互补载体的回复子(Folprp4-C)在菌落形态、生长速率、分生孢子产量和毒力方面均恢复到了野生型菌株。结论: Folprp4基因与尖孢镰刀菌的菌丝生长、分生孢子发生和致病性有关。     

兰科药用植物手参种子的真菌共生萌发

手参Gymnadenia conopsea是一种地生型兰科植物,是我国的传统中药,同时也是蒙药、藏药常用药,在西藏地区亦作食用。现代药理学研究表明手参具有非常好的药理活性,然而当前手参还不能进行人工栽培,市场需求完全依赖野生资源,因此资源短缺仍然是制约该种药用植物进一步开发利用的瓶颈。兰科植物种子萌发及早期的幼苗生长均需真菌参与,基于此,本文从手参根系中进行了真菌分离,并获得一株菌株,分子鉴定为角担菌属Ceratobasidium GS2。将GS2菌株与手参种子进行共培养,可明显促进手参种子的原球茎的形成并最终分化成幼苗。手参种子共生萌发的成功对于实现手参的种质保育、人工栽培和野生居群的生态恢复均具有重要的意义。     

Increased resistance of complex I mutants to phytosphingosine-induced programmed cell death

We have studied the effects of phytosphingosine (PHS) on cells of the filamentous fungus Neurospora crassa. Highly reduced viability, impairment of asexual spore germination, DNA condensation and fragmentation, and production of reactive oxygen species were observed in conidia treated with the drug, suggesting that PHS induces an apoptosis-like death in this fungus. Interestingly, we found that complex I mutants are more resistant to PHS treatment than the wild type strain. This effect appears to be specific because it was not observed in mutants defective in other components of the mitochondrial respiratory chain, pointing to a particular involvement of complex I in cell death. The response of the mutant strains to PHS correlated with their response to hydrogen peroxide. The fact that complex I mutants generate fewer reactive oxygen species than the wild type strain when exposed to PHS likely explains the PHS-resistant phenotype. As compared with the wild type strain, we also found that a strain containing a deletion in the gene encoding an AIF (apoptosis-inducing factor)-like protein is more resistant to PHS and H2O2. In contrast, a strain containing a deletion in a gene encoding an AMID (AIF-homologous mitochondrion-associated inducer of death)-like polypeptide is more sensitive to both drugs. These results indicate that N. crassa has the potential to be a model organism to investigate the molecular basis of programmed cell death in eukaryotic species.     

Involvement of recQ in the ultraviolet damage repair pathway in Deinococcus radiodurans

Deinococcus radiodurans is a bacterium which can survive extremely DNA damage. To investigate the relationship between recQ and the ultraviolet radiation (UV) damage repair pathway, we created a four mutant strain by constructing recQ knockout mutants in uvrA1, uvrA2, and uvsE backgrounds. Using the rpoB/Rif^r system, we measured the mutation frequencies and rates in wild type, recQ (MQ), uvsE uvrA1 uvrA2 (TNK006), and uvsE uvrA1 uvrA2 recQ (TQ). We then isolated Rif^r mutants of these strains and sequenced the rpoB gene. The mutation frequency of TQ was 6.4, 10.1, and 2.43 times that of wild type, MQ, and TNK006, respectively, and resulted in rates of 4.7, 6.71, and 2.15 folds higher than that of wild type, MQ, and TNK006, respectively. All the strains demonstrated specific mutational hotspots. Furthermore, the TQ strain showed a transversion bias that was different from the other three strains. The results indicate that recQ is involved in the ultraviolet damage repair pathway via the interaction between recQ and uvrA1, uvrA2, and uvsE in D. radiodurans.     

绿僵菌破坏素合成缺失株中分离鉴定pseurotin A

真菌次级代谢产物是医药活性成分的重要来源之一。就真菌基因组编码的次级代谢基因簇数量而言,由于普遍存在的基因沉默现象,常规培养中能够分离鉴定的化合物种类一般很有限。广谱杀虫的罗伯茨绿僵菌在液体培养基中的主要代谢产物为非核糖体环肽类的破坏素,本研究在对破坏素合成缺失突变株ΔdtxS1进行液体培养时获得了新的产物峰,对其中一个产物峰进行分离、纯化及结构鉴定,确定该化合物为螺环类的pseurotin A。结合在烟曲霉菌中解析的pseurotin A合成途径,推测获得了罗伯茨绿僵菌中的潜在合成基因簇,并推测了pseurotin A在绿僵菌中的合成途径。本研究首次在绿僵菌中鉴定获得pseurotin A,并揭示了在真菌中通过对主要次级代谢产物缺失的方法可以鉴定获得新型的化合物。     

透明质酸生产菌溶血素S基因缺失突变菌株的构建及其特性北大核心CSCD

【目的】马链球菌兽疫亚种是工业上生产透明质酸的主要菌种,该菌能产生引起宿主细胞溶血的链球菌溶血素S(streptolysin S,SLS)毒素,因而其产品的安全性一直是人们所担心的问题。本实验的目的就是通过基因敲除的方法构建不产SLS的透明质酸生产工程菌,同时探讨溶血素sag A基因缺失对菌株透明质酸合成和其他毒力因子的影响。【方法】利用温度敏感/自杀性质粒p JR700载体系统,构建马链球菌兽疫亚种sag A基因缺失突变株;通过PCR扩增,溶血平板和SLS含量测定等方法确定sag A基因缺失;采用分光光度、SDS-PAGE和细胞毒性试验等分析方法,对野生菌株和sag A基因缺失突变菌株透明质酸含量、透明质酸分子量、溶血素Hylc、透明质酸分解酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和菌体表面蛋白等相关毒力因子进行对比研究。【结果】获得了透明质酸产量提高30%而溶血活性极低的马链球菌兽疫亚种sag A基因缺失突变株。该突变株与野生菌株相比较,透明质酸分解酶活性增加而透明质酸相对分子量降低,此外,与毒力相关的表面蛋白含量、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性也显著降低。细胞毒性实验结果表明,野生菌株与sag A基因缺失突变菌株的培养物上清液,对细胞活性的影响存在显著差异。【结论】在马链球菌兽疫亚种中sag A不仅是表达溶血素SLS的基因,同时sag A基因对菌株透明质酸合成、透明质酸分解酶、菌体表面蛋白、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶等都具有调节作用。