人锰超氧化物歧化酶基因剪接异构体的表达分析

对人锰超氧化物歧化酶(human manganese superoxide dismutase,hMn-SOD)基因剪接异构体进行分析,并检测异构体的表达情况。在GenBank库中检索人锰超氧化物歧化酶基因异构体及编码基因组序列,利用Vector NTI9生物软件进行核酸及蛋白序列比对;利用RT-PCR方法分析锰超氧化物歧化酶基因异构体的表达。结果显示,在GenBank库检索发现有3种人锰超氧化物歧化酶基因异构体,剪接异构的类型为可变的5′剪接位点和外显子盒,各异构体基因内含子均符合"GT-AG"规则。3种基因异构体编码两种异构体蛋白,即222个氨基酸的人锰超氧化物歧化酶蛋白以及中部缺少39个氨基酸的截短型异构蛋白。RT-PCR检测结果表明,剪接异构体hMn-SODb在HEK293T和HSC细胞中的表达比在HepG2细胞中高,未见异构体hMn-SODc的表达。     

锰超氧化物歧化酶(MnSOD)表达与活性调控及其与肿瘤的关系

线粒体锰超氧化物歧化酶(MnSOD)是细胞中主要的抗氧化酶,其在清除细胞中活性氧自由基(ROS),应对细胞氧化应激及维持细胞正常生理代谢过程中起着重要作用。锰超氧化物歧化酶(MnSOD)基因表达以及蛋白活性受到多种途径调控,并与多种疾病的发生密切相关。本文介绍了锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的生物学特性,并从锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的转录调控、表观遗传调控以及翻译后修饰等方面,对锰超氧化物歧化酶(MnSOD)基因表达及活性调控机制研究进展进行了综述。     

哺乳动物N-糖基化途径中关键酶唾液酸合酶和CMP-唾液酸合成酶基因在转基因家蚕中的表达

对昆虫的N-糖基化途径进行修饰改变是扩展昆虫蛋白表达系统应用范围的重要途径。本研究利用基于piggyBac转座子的家蚕Bombyx mori转基因技术表达昆虫所缺乏的哺乳类糖基化途径中的关键基因, 构建了可以同时表达小鼠Mus musculus唾液酸合酶和小鼠CMP-唾液酸合成酶两个基因的piggyBac表达载体, 选用家蚕肌动蛋白A3启动子控制基因的表达, 并导入3×P3启动子控制下的增强绿色荧光蛋白EGFP作为分子标记。在得到的G1代转基因家蚕中对转入的基因进行了分子水平的鉴定和分析, 为在家蚕这种模式昆虫中模拟哺乳类糖基化途径奠定了基础。     

锰超氧化物歧化酶的催化原理与酶活性调节机制

锰超氧化物歧化酶(MnSOD)催化两分子超氧自由基歧化为分子氧和过氧化氢。超氧自由基被Mn³⁺SOD氧化成分子氧的反应以扩散的方式进行。超氧自由基被Mn²⁺SOD还原为过氧化氢的反应以快循环和慢循环两条途径平行进行。在慢循环途径中,Mn²⁺SOD与超氧自由基形成产物抑制复合物,然后该复合物被质子化而缓慢释放出过氧化氢。在快循环途径中,超氧自由基直接被Mn²⁺SOD转化为产物过氧化氢,快速循环有利于酶的复活与周转。本文提出温度是调节锰超氧化物歧化酶进入慢速或者快速循环催化途径的关键因素。随着在生理温度范围内的温度升高,慢速循环成为整个催化反应的主流,因而生理范围内的温度升高反而抑制该酶的活性。锰超氧化物歧化酶的双相酶促动力学特性可以用该酶保守活性中心的温度依赖性配位模型进行合理化解释。当温度降低时,1个水分子(或者OH^-)接近Mn、甚至与Mn形成配位键,从而干扰超氧自由基与Mn形成配位键而避免形成产物抑制。因此在低温下该酶促反应主要在快循环通路中进行。最后阐述了几种化学修饰模式对...     

内源性活性氧水平及锰型超氧化物歧化酶的表达与胃癌细胞分化、增殖相关

检测了不同分化的胃癌细胞株内MnSOD基因的表达及胞内活性氧限（ROS)的水平。同时通过基因转染观察上调或下调MnSOD基因表达对SGC790l胃癌细胞胞内ROS水平及增殖能力的影响。用电穿孔法将人反义和正义MnSOD cDNA真核表达载体pHβA—SOD(-)／pHβA—SOD（ )转入790l细胞,用含G418的RPMIl640培养基筛选稳定表达克隆。然后用RT-PCR鉴定MnDSOD基因的表达。同时用RT-PCR方法检测正常胃粘膜组织及MKN-28、SGC790l、BGC823、HGC-27四株高、中、低、未分化胃癌细胞株内的MnSoD的mRNA表达。利用DCFH-DA荧光染色方法检测不同分化胃癌细胞株及790l转染细胞株内的ROS水平。四唑蓝比色法(MTT)绘制MKN-28、SGC790l、BGC823、HGC-27四株不同分化胃癌细胞及正义、反义、空载MnSOD转染790l细胞的生长曲线。发现不同分化胃癌细胞内的MnSOD普遍呈低表达且与分化程度平行,不同分化胃癌细胞株胞内ROS水平随着MnSOD表达的下调逐步上升,细胞增殖加快。较之MnSOD空载790l,正义、反义MnSOD转染的790l细胞中该基因的表达出现明显上调及下调,胞内ROS水平较对照细胞也相应有显著降低和升高。正义株增殖受抑,反义株增殖加快。表明胃癌细胞内MnSOD的表达与肿瘤的分化程度呈负相关。可通过改变胞内RoS水平改变MnSOD基因的表达,从而调节胃癌细胞的生长。     

盐角草和盐芥3个超氧化物歧化酶基因的克隆和功能分析

为了探究盐生植物的耐盐机制,比较不同盐生植物超氧化物歧化酶(SOD)基因耐盐性的大小,采用RACE技术克隆了盐角草锰和铜/锌两种SOD的cDNA全长。序列分析表明,盐角草MnSOD基因(SeMSD,GenBank登录号为JQ061158)含有699bp的开放阅读框,编码一个长233个氨基酸的多肽,其预测相对分子量为25.7kD。Cu/ZnSOD基因(SeCSD,GenBank登录号为JQ061160)开放阅读框长为684bp,并编码228个氨基酸的多肽,相对分子量为23.3kD。根据已获得的这两个cDNA序列和GenBank公布的盐芥MnSOD基因序列(ThMSD,EF140719),构建了3个原核表达载体pET30a-SeMSD、pET30a-SeCSD和pET30a-ThMSD,并将它们转化大肠杆菌BL21,成功表达出了目的蛋白。通过优化IPTG的诱导浓度,在6.5%和7.5%盐度下对这3个SOD基因的耐盐能力验证结果显示,相比对照菌BL21(pET30a),转化了pET30a-SeMSD和pET30a-ThMSD载体的重组菌具有更高的耐盐性,而转化pET30a-SeCSD载体的重组菌没有表现出耐盐性的提高。     

叶绿体超氧化物歧化酶（ChlSOD）基因的构建及序列分析

构建叶绿体超氧化物歧化酶基因（ChlSOD),采用RT-PCR方法分离豌豆RUBP羧化酶小亚基导肽基因（TP）,定向克隆至pUC19测序,定向克隆烟草MnSOD成熟蛋白基因（SODm)至pUC19;采用平粘端连接法将二者在pUC19中构成嵌合基因ChlSOD,并对此基因进行序列分析,序列分析表明：TPcDNATP,12bp的Linker及615bp SODm。TP与ChlSOD基因的序列分析与国外报道序列完全吻合。     

铜锌超氧化物歧化酶(SOD)研究进展——从基因到功能

超氧化物歧化酶(SOD,EC 1.15.1.1),己经在多种组织中发现,它能将O2.-催化生成H2O2及O2.迄今为止,已经从哺乳动物体内分离出三种SOD:CuZnSOD(SOD1)、MnSOD(SOD2)TLEC-SOD(胞外超氧化物歧化酶,SOD3),各自具有不同的生化及分子特性.CuZnSOD(SOD1),是一类含有Cu及Zn原子的二聚体,存在于特定细胞的基质内,约占SOD总量的90%.在胞质及周质中,SOD以二聚体形式存在,而在线粒体及质外,则以四聚体形式存在.在保护脑、肺及其它组织的氧化应激中,CuZnSOD被认为起着保护作用.运动神经元肌萎缩侧索硬化症(ALS),据称也与同源二聚体CuZnSOD的错误折叠有关,己经报导,有多个CuZnSOD基因位点突变与ALS有关.本文将从基因的结构、表达、调节及蛋白的结构与功能等方面,对CuZnSOD进行简要论述.     

同源过表达mhr2基因可提高嗜热毁丝霉纤维素酶活性

为寻找新型的与纤维素酶相关转录调控因子,以嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila ATCC42464)为研究材料,通过克隆嗜热毁丝霉mhr2基因序列,构建重组过表达载体,转化并筛选到转化子Mt O24中mhr2基因表达量比野生型菌株高204倍。蛋白浓度及酶活测定的结果显示,诱导培养72 h,转化子胞外蛋白浓度和滤纸酶活分别是野生菌的1.58和1.30倍;非诱导培养144 h,转化子胞外蛋白浓度和滤纸酶活分别是野生菌的1.87和1.49倍。实时荧光定量PCR的结果表明,转化子中主要纤维素酶基因egl1、egl3和cbh1、cbh2的表达量均有显著提高。研究初步证实了mhr2基因具有调控纤维素酶基因表达的功能。     

意大利工蜂不同发育时期抗氧化酶基因mRNA表达量的变化

超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）在清除工蜂体内自由基的过程中起着关键的作用, 其活性和基因表达量的高低与蜜蜂的寿命、 抗病力有直接的联系, 进而影响着蜂群的生产性能。本研究采用实时荧光定量PCR法研究意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica不同发育时期铜锌超氧化物歧化酶（copper zinc superoxide dismutase, CuZnSOD）、 锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase, MnSOD）及过氧化氢酶（catalase, CAT）基因mRNA表达量的变化。实验分别在幼虫、 蛹、 成虫3个阶段5个时间点（产卵后5 d的幼虫, 产卵后14 d的蛹, 出房后1 d, 12 d, 32 d的成虫）取样。结果表明, 3个抗氧化酶基因在各个发育阶段均有表达, 其中CuZnSOD和MnSOD mRNA的表达量在幼虫到蛹期和出房后12-32 d两个阶段呈下降趋势, 而都以出房后1 d时表达量最大, 蛹期表达量最小, 且显著低于其他4个时期(P<0.05)。CuZnSOD基因 mRNA的表达量在成虫阶段的下降趋势不明显, MnSOD mRNA的表达量则显著下降(P<0.05); 而CAT基因的mRNA表达量以蛹期最低, 且其表达量随蜜蜂的生长发育稳定上升, 在出房后12 d和32 d时表达量显著高于其他3个时期。这些研究结果在分子水平上揭示了抗氧化酶基因在蜜蜂不同发育时期的作用。     

裂褶菌F17锰过氧化物酶酶活力影响因素的响应面优化(英文)

锰过氧化物酶是真菌分泌的一种糖基化的含有血红素辅基的胞外蛋白,在染料降解和脱色过程中起着重要作用。本实验利用本实验室保存的的白腐真菌裂褶菌Schizophyllum sp.F17产锰过氧化物酶(MnP),研究MnP的酶学性质,并对酶活条件进行优化。实验通过超滤浓缩、DEAE-纤维素、DE52离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤等步骤,分离纯化得到电泳纯的锰过氧化物酶。该酶蛋白含量为23μg/mL,分子量大小为49.2kDa,在0.1mmol/L H2O2中半衰期为5~6min。Mn2+、H2O2以及酶的用量可以影响MnP酶促反应的效率,在单因子分析法的基础上,通过全因子中心组合设计响应面分析表明:H2O2以及H2O2与酶用量之间的交互作用对酶促反应的作用是最显著的。在优化条件下,酶对偶氮染料金橙G、刚果红显示出较强的脱色能力。     

腾冲嗜热厌氧杆菌tte0732基因的表达及生物信息学分析

腾冲嗜热厌氧杆菌tte0732(Galu)基因编码的TTE0732是温度依赖性蛋白。为研究其在热适应中的作用,应用PCR技术克隆腾冲嗜热厌氧菌tte0732基因,构建原核表达载体pET-28a::tte0732并在大肠埃希菌BL21表达TTE0732;通过qRT-PCR分析tte0732基因在50、60、75和80℃的RNA表达量;应用生物信息学软件分析Galu在嗜热菌和常温菌中编码氨基酸的基本理化性质。成功构建了原核表达载体pET-28a::tte0732并在大肠埃希菌BL21中得到高效表达,TTE0732分子质量大小为35 ku,主要以可溶性形式存在;qRT-PCR显示tte0732 mRNA在75和80℃高表达;生物信息学分析得出tte0732基因完整的ORF全长909 bp,编码302个氨基酸,其中Ile(I)、Leu(L)含量高于常温菌,编码蛋白为酸性亲水性蛋白,等电点为5.22,含有18个潜在的磷酸化位点,不存在跨膜结构、信号肽和糖基化位点。预测其蛋白质二级空间结构以α-螺旋、无规则卷曲、β-折叠为主。腾冲嗜热厌氧杆菌TTE0732蛋白是一种亲水性蛋白,在原核系统能高效表达,本研究结果对嗜热蛋白质的热稳定性机制的研究具有一定的参考。     

趋磁菌AMB-1超氧化物歧化酶Fe-SOD在大肠杆菌中的表达及生理活性研究

超氧化物歧化酶(SOD)可以减轻超阳阴离子O2-对细胞的毒害作用,提高菌体的抗氧化能力,从而改善菌株的生理状态.利用PCR技术,将趋磁菌AMB-1的超氧化物歧化酶基因esod克隆至原核表达载体pET-20b(+),并在E coli BL21(DE3)有效表达.重组菌株BL21 (DE3)/(pET-20b-fesod-histag)在0.6 mmol/L IPTG诱导浓度下进行发酵培养,在生长前期2-14 h生长速率优于对照组E.coli BL21(DE3)/(pET-20b).通过亲和层析柱纯化后,重组酶蛋白纯度达电泳均一,超氧化物歧化酶fesod活性最造作用温度为25℃,在25℃和45℃下酶热稳定较好,pH4.2-8.2之间酶活力稳定.趋磁菌AMB-1来源的Fe-SOD作为一种抗氧化酶,在大肠杆菌中的有效表达从一定程度上改善了宿主菌的生长情况.     

草鱼线粒体型超氧化物歧化酶的生化遗传特性

超氧化物歧化酶 (SOD)是一种对生物细胞保护至关重要、在进化上比较保守的酶。因此 ,超氧化物歧化酶作为分子钟或分子标记已被广泛应用于生物进化研究、群体遗传结构分析以及品系鉴定。但鱼类SOD的生物化学和遗传学特性都尚未进行过系统和深入的研究。为使这一重要的分子标记能更好地应用于鱼类遗传育种、种质资源保护以及进化研究 ,本实验采用聚丙烯酰胺梯度凝胶垂直电泳法 ,研究了草鱼线粒体型超氧化物歧化酶 (fm SOD)的同功酶形式 ,生化遗传表型、亚基组成以及金属类型。实验结果表明 ,草鱼fm SOD有三种不同的同功酶形式 ;按从正极到负极的排列分别命名为fm SOD 1 ,fm SOD 2 ,fm SOD 3。这三种不同的fm SOD在草鱼群体中可构成 3种不同的生化遗传学表型 :表型 1个体只含有迁移率最快的fm SOD 1同功酶 ;表型3个体只含有迁移率最慢的fm SOD 3同功酶 ;而表型 2个体中含有所有三种不同形式的同功酶。在野生草鱼群体中 ,存在所有三种表现型 ;而在基因纯合型的雌核发育草鱼群体中只检测到表型 1和表型 3。野生草鱼群体中三种表现型的个体数之比符合一对等位基因分离的 1∶2∶1孟德尔遗传分离比例。由这些实验结果得出以下结论 :(1 )草鱼fm SOD是由细胞核DNA上的基因所编码而不是由线粒体DNA上的基因所编码的     

MnSOD基因表达调控的研究进展

MnSOD是生物体内重要的氧自由基清除剂, 具有抗氧化和抗肿瘤作用。MnSOD基因的表达调控是一个复杂的过程, 多种转录因子、细胞信号分子和细胞信号通路参与其中。MnSOD基因的表达调控包括转录调控、转录后调控和翻译调控3个方面。转录调控是MnSOD基因表达调控的第一个层次, 在MnSOD基因表达的过程中起重要作用。它主要是通过调节与MnSOD基因转录相关的转录因子活性来实现的, 例如特异蛋白-1 (SP-1)、激活蛋白-2(AP-2)、激活蛋白-1(AP-1)、核因子-卡巴B(NF-κB)等。药物和金属离子就是通过改变这些转录因子的活性来调控MnSOD基因表达的, 另外某些基因的突变和缺失也能改变这些转录因子的活性。转录后调控主要体现在改变mRNA的稳定性或mRNA的翻译上。翻译调控则是对MnSOD多肽的编辑、修饰并与相应的金属离子结合及定位的调控。近年来发现了一种线粒体MnSOD的锰转运因子, 它对MnSOD活性的调控起重要作用。文章综述了这一研究领域的一些进展, 着重讨论了MnSOD基因的转录调控和翻译调控, 并展望了MnSOD基因表达调控的研究方向。     

同源过表达BglR对嗜热毁丝霉β-葡萄糖苷酶活性的影响

目的:克隆嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila ATCC42464)bglr基因,构建Mtbglr过表达载体,研究同源过表达bglr对嗜热毁丝霉β-葡萄糖苷酶活性及总纤维素酶活性的影响。方法:利用SLIC技术构建Mtbglr过表达载体;使用MtPpdc启动子及MtTpdc终止子将该基因进行同源过表达;利用原生质体转化、实时荧光定量PCR和酶活测定等技术实现bglr基因在嗜热毁丝霉中表达及酶活水平的鉴定。结果:成功构建Mtbglr过表达载体,并转化嗜热毁丝霉,结果表明,诱导培养条件下,转化子Mt8菌株的β-葡萄糖苷酶活性和胞外蛋白质浓度分别是WT菌株的1.7倍和1.9倍。结论:bglr基因对嗜热毁丝霉β-葡萄糖苷酶活性具有增强作用,为嗜热真菌β-葡萄糖苷酶基因调控奠定了理论基础。     

节杆菌A.pascens DMDC12锰超氧化物歧化酶基因的克隆和表达

利用PCR技术对自行筛选的高度耐盐节杆菌Arthrobacter pascensDMDC12中的超氧化物歧化酶基因进行克隆,获得了节杆菌A.pascensDMDC12的SOD新基因(GenBank收录号为DQ779150)。将该基因与原核表达质粒载体pET-22b( )连接,构建重组质粒pET-sodAP,将质粒转化至表达宿主菌E.coliBL21(DE3),构建基因工程菌BL21/pET-sodAP。用异丙基硫代--βD-半乳糖苷(IPTG)诱导重组SOD蛋白表达,用酶活和SDS-PAGE分析表达产物,表达产物的相对分子质量为2.4×104,与sodAP推测的长度相同。表达目的蛋白占菌体可溶性蛋白的23%,比酶活达915.07 IU.mg-1,是对照菌株的8.73倍,具有较高的表达。本研究为进一步进行重组Mn-SOD的研究和应用奠定了基础。     

人锰超氧化物歧化酶cDNA的克隆、测序及表达

用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以人肝细胞总RNA为模板, 扩增了人锰超氧化物歧化酶(hMnSOD)的cDNA片段, 将此cDNA克隆到载体pGEM-T中.对重组质粒进行限制酶切分析和序列测定, 确定为含hMnSODcDNA的重组质粒将该hMnSODcDNA重组到表达载体pBV220内, 重组质粒在大肠杆菌DH5-α中表达hMnSOD, 表达产物占菌体总蛋白的14%, 具有持异性SOD酶活性.     

外源超氧化物歧化酶基因MnSOD在玉米中的过量表达及抗逆性的提高

为研究过量表达的超氧化物歧化酶基因MnSOD对玉米抗逆性的作用,构建了小麦来源MnSOD基因的单子叶植物高效表达载体,用基因枪法转化优良玉米自交系胚性愈伤组织。经潮霉素梯度浓度培养基筛选,从阳性愈伤组织再生获得9个正常结实的植株。其中5株经PCR和Southern印迹检测表现为阳性,表明外源基因己整合到玉米基因组中。提取SOD酶液,非变性聚肉烯酰胺浓度梯度凝胶电泳分离,用H2O2 5mmol／L抑制FeSOD和CU／ZnSOD活性,氯化硝基四氮唑蓝染色检测MnSOD酶活性。Southern印迹呈阳性的5个植株,MnSOD酶活性均高于未转基因的对照。甲基紫精氧化损伤处理后,用电解质渗漏率法测定阳性株系的叶片渗透液的电导率。结果表明,转基因株系的抗氧化损伤能力显著高于对照。     

人铜锌超氧化物歧化酶在大肠杆菌中的融合表达与纯化

目的:在大肠杆菌中表达并纯化人铜锌超氧化物歧化酶(HuSOD1)。方法:合成HuSOD1编码基因,PCR扩增后连入pMAL-p5x质粒构建融合表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,IPTG诱导表达,NBT法测定HuSOD1酶活,利用麦芽糖结合蛋白亲和层析柱纯化MBP-HuSOD1融合蛋白,经因子Ⅹa酶切及分子筛柱层析纯化HuSOD1蛋白。结果:构建了pMAL-p5x-HuSOD1表达载体,在大肠杆菌中实现了高表达,目的蛋白占全菌蛋白的30%,其中可溶性表达占63%,具有超氧化物歧化酶活性;通过亲和层析纯化得到纯度大于95%的融合蛋白MBP-HuSOD1,经因子Ⅹa酶切后纯化得到纯度约90%的HuSOD1蛋白。结论:在大肠杆菌中表达并纯化获得有活性的MBP-HuSOD1,经进一步酶切、纯化后得到HuSOD1。