中国香菇种质资源中主要真菌病毒的多重RT-PCR检测技术

【背景】病毒是食用菌生产上较重要的一类潜在隐患。我们在前期的研究中发现,中国香菇(Lentinula edodes)种质资源中最常见的病毒有2种,分别为L. edodes partitivirus 1 (LePV1)和L. edodes mycovirus HKB (LeV-HKB)病毒,这2种病毒能单一或复合感染香菇。【目的】建立香菇种质主要病毒的快速检测技术,提高香菇病毒检测效率,降低检测成本。【方法】依据香菇β-actin基因及病毒LePV1和LeV-HKB编码依赖RNA的RNA复制酶(RdRp)基因序列分别设计引物,以复合感染了这2种香菇病毒的菌丝体为材料,对影响RT-PCR反应的主要因素模板浓度、引物浓度、dNTPs浓度、退火温度和循环次数等进行优化筛选,建立同时检测LeV-HKB病毒(LeV-HKB相关病毒)和LePV1病毒的多重RT-PCR检测技术。【结果】模板浓度、退火温度和循环次数对多重RT-PCR检测结果均有较大影响,而引物浓度和dNTPs浓度对检测结果的影响较小。所建立的多重RT-PCR技术在香菇核心种质病毒检测中表现为扩增目标条带清晰分明,检测结果与单重RT-PCR检测结果一致。对两种病毒的多重RT-PCR产物进行了序列测序,结果表明扩增片段序列与目标基因序列相似性在99%以上。【结论】所建立的多重RT-PCR检测体系具有较好的特异性与适用性,为室内和田间香菇病毒早期检测、病害流行的监测提供了技术储备。     

担孢子介导传播对香菇双分体病毒LePV1群体形成的影响

【背景】LePV1为中国香菇种质资源中携带的主要病毒之一。在前期研究中,根据分子序列特征将LePV1带毒菌株群体分为两个分子类群(亚型I和亚型II),亚型I包含大部分带毒香菇菌株,而亚型II仅包含少数几个供试带毒香菇菌株,在地理上相距遥远的不同遗传背景香菇菌株中发现了同一LePV1分子类型。【目的】探究担孢子介导传播对香菇双分体病毒LePV1群体形成的影响。【方法】比较不同亚型菌株的有性担孢子后代带毒率差异,并采用单单杂交和单双杂交方式分析杂交对LePV1群体形成的影响等。【结果】亚型I中栽培菌株ZP51和野生菌株YS94的担孢子带毒率分别为70%和100%,亚型II中栽培菌株ZP28和野生菌株YS5的担孢子带毒率分别为45%和55%,暗示亚型I菌株担孢子传毒效率高于亚型II;当杂交配对的任一亲本携带LePV1时,无论是单单杂交还是单双杂交,获得的杂交子带毒率为100%。【结论】不同亚型担孢子病毒携带率的不同和杂交在香菇双分体病毒LePV1群体形成中可能发挥着重要作用;此外,LePV1不能在杂交不亲和的单核体之间传播,也不能在不亲和的单双杂交配对中进行传播;在杂交可亲和的单双杂交配对中,杂交成功的杂交子在与亲本双核体菌丝接触一段时间后,可以将病毒LePV1通过胞质传播传给亲本双核体菌丝体。该研究为明确香菇双分体病毒LePV1传播规律及LePV1群体形成机制提供了线索。     

中国香菇核心种质真菌病毒多样性检测及其携带特点分析

【背景】香菇病毒通常具有潜隐性特征,携带病毒的香菇菌株往往并不表现出明显症状,然而一旦发生常造成较大的经济损失。【目的】解析中国香菇核心种质中真菌病毒多样性特点。【方法】以56个中国香菇核心种质为试验材料,采用RT-PCR和RT-qPCR检测技术对34种香菇病毒携带情况进行检测和分析。【结果】研究结果表明,分别有14种和5种香菇病毒的目标基因在绝大多数阳性菌株中扩增出较亮和较暗的条带,RT-qPCR结果也表明阳性带毒香菇菌株中病毒目标基因的扩增结果与病毒含量呈正相关,即病毒在阳性菌株中的含量越高则病毒扩增条带越亮;被检测的34种香菇病毒中,LeFV5和LeMV1检测率为100%;21个栽培种质和35个野生种质中分别有8种和6种香菇病毒检测率为80%以上,而且其中4种病毒相同(LeDFV2、LeFV2、LeSV和LeHV2);栽培菌株和野生菌株携带病毒数分别为8-21种和9-23种,平均每个菌株携带16.4种和16.7种。【结论】香菇种质资源中普遍携带复杂的多种真菌病毒,被检测的病毒在阳性菌株中扩增亮度不同,而且存在明显遗传差异的香菇菌株中携带的一些高检测率病毒相似,暗示这些病毒在香菇进...     

香菇dsRNA病毒LeV的RT-PCR检测

香菇病毒HKB(Lentinula edodes mycovirus HKB,LeV)是一种具有潜隐性特点的真菌病毒,广泛存在于香菇菌株中。为了快速、准确地检测出LeV,根据LeV病毒基因组序列(AB.429556.2)的信息,设计合成一对引物,对25个香菇菌株进行RTPCR检测,在20个香菇菌株中分别扩增出LeV病毒基因组特有的条带,在5个香菇菌株中未能扩增出条带。通过对25个香菇菌株进行dsRNA提取检测,结果也表明不存在扩增片段的菌株提取不到dsRNA,存在扩增片段的菌株能够提取得到dsRNA。因此建立的RT-PCR方法可以快速检测到香菇dsRNA病毒LeV,能够对香菇的质量检测提供技术支持。     

利用InDel标记分析中国香菇菌株的遗传多样性与群体结构

通过对5个香菇菌株重测序,以香菇L808-1菌株的全基因组序列为参考基因组,分析了这些菌株中插入/缺失（InDel）标记位点在香菇基因组10条染色体上的分布,并筛选了插入/缺失碱基数≥15的位点,合成了449对InDel标记引物。经过PCR和电泳检测,其中237对引物条带清晰。最终筛选出107个PIC≥0.3的标记作为核心InDel标记对来自国内的44份香菇菌株进行遗传多样性分析。聚类分析显示栽培菌株和野生菌株各自聚为一支,所选香菇菌株间存在明显的群体分层。群体结构分析显示香菇种质资源可分为4个亚群,主成分分析显示香菇菌株之间的位置及距离与聚类分析和群体结构分析结果相符。香菇InDel分子标记的开发与应用,为香菇核心种质的构建和种质资源育种引用提供了基础。     

SSR标记在毛木耳种质资源遗传多样性研究中的应用

本研究利用基于毛木耳全基因组开发的SSR标记对27份毛木耳菌株（野生14株、栽培13株）的遗传多样性进行分析。首先随机选取3个菌株（2个野生菌株、1个栽培菌株）的DNA为模板,从144对SSR引物中筛选出扩增条带清晰、稳定性强、多态性丰富的引物24对。24对SSR引物共检测到116个多态性SSR片段,每对引物的多态性片段有3-7个,引物平均检测效率为4.83个,Shannon’s遗传多样性指数范围是0.866-1.885,多态性位点比率100%。供试菌株遗传相似系数范围是0.618-0.971,说明毛木耳种质资源具有丰富的遗传多样性。野生菌株与栽培菌株间平均遗传相似系数分别为0.746、0.779,说明毛木耳野生菌株遗传多样性更为丰富。经聚类分析,在遗传相似系数为0.680时,可将供试菌株分为无色（白色）类群Ⅰ和有色（浅黄色到红褐色）类群Ⅱ。遗传相似系数为0.704时,可将供试菌株中栽培菌株和野生菌株明显区分（14株野生菌株均在类群Ⅱ-2中,13株栽培菌株分别在类群Ⅰ和Ⅱ-1中）。本研究表明基于全基因组的SSR标记能从分子水平上揭示各菌株间的遗传差异,丰富毛木耳遗传多样性的研究手段,并为进一步进行毛木耳的品种选育、遗传学研究等提供有力手段。     

桦褐孔菌野生分离菌株的比较与栽培选育

通过菌丝形态比较、ISSR分析鉴定及人工驯化栽培选育,对1株野生分离菌株和4株保藏菌株进行比较。结果显示:5个菌株在菌丝形态和长势上差异显著,1号菌株(野生分离)菌丝洁白,长速最快;ISSR扩增图谱谱带差异明显,1号菌株与5号菌株在遗传相似水平85%时聚为1类,其他菌株各自聚为独立1类。驯化栽培试验结果表明:1号菌株出核较快,菌核大,产量高,较其他菌株产量差异显著。被试菌株为各自独立菌株,1号菌株经驯化适宜高产栽培,是重要珍稀野生种质资源。本研究可为野生桦褐孔菌菌株种质资源收集和为实现大规模栽培育种提供亲本资源。     

香菇栽培周期与产量的关系

缩短香菇栽培周期并增加子实体产量,是香菇栽培中的一个重要研究课题。从1980年开始,我们用废纸做材料进行研究,现报道如下。材料与方法1.供试菌株:香菇(Lentinus edodes)7402由上海市农科院食用菌所提供。2.材料:没有印油的废纸。木屑、甘蔗渣为对照。     

一种含有单链RNA的香菇球状病毒

从生长不正常的香菇(Lentinus edodes(Berk.)Sing)菌株中分离到一种等轴对称含单链RNA的病毒颗粒。病毒颗粒在电镜下直径为33～34nm,在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中病毒外壳蛋白分子量为22000道尔顿。病毒核酸径DNase1和SI酶解试验及热变性紫外吸收曲线试验证明为单链RNA,在1.5％的琼脂糖凝胶电泳中,病毒核酸呈现一条带,分子量为2.38×10~6道尔顿。     

核桃炭疽菌携带病毒种类鉴定及多样性分析

炭疽菌是核桃主要病害核桃炭疽病的病原,目前对核桃炭疽菌携带的病毒种类及病毒基因组序列信息了解较少。利用宏病毒组测序技术,对分离自我国3个不同省份的25株核桃炭疽菌所携带的病毒基因序列进行发掘、鉴定和分类。经同源比对分析,获得22种病毒基因组序列,其中19种为新病毒。在22种病毒中,有21种为正单链RNA病毒,1种为dsRNA病毒。正单链RNA分别隶属于裸露病毒科（Narnaviridae）、线粒体病毒科（Mitoviridae）和葡萄孢欧尔密病毒科（Botourmiaviridae）,而dsRNA属于Alternaviridae病毒科。RT-PCR验证结果表明22种病毒都能在核桃炭疽菌株中被检测到,且25株炭疽菌的病毒携带率为100%,每个菌株都至少被1-11种病毒侵染。研究结果丰富了炭疽菌属所携带的病毒基因组信息,为后续深入分析炭疽菌真菌病毒的多样性和分子特性奠定基础。     

设施化专用香菇种质资源挖掘

以香菇L808菌株基因组序列为参照,开发了300份插入/缺失(InDel)标记。通过5个菌株的初筛,选出均匀分布于基因组的82份多态标记对42份香菇种质资源进行遗传背景分析。同时在设施化栽培条件下考察了种质资源的生育期、菌棒转色、菌棒硬度、现蕾期和产量等表型。结果表明：供试香菇种质资源的遗传多样性丰富,栽培菌株与野生菌株的遗传距离较远,遗传相似性系数平均值为0.51。群体结构分析将种质资源分为6个亚群,与基于遗传距离的系统聚类结果较为一致。亚群间菌株具有较远的亲缘关系,遗传分化指数平均值为0.290,适合用于杂交育种。表型结果显示,设施化栽培条件下的种质资源农艺性状分化程度高,亚群间菌株的生育期、现蕾期和产量均有显著差异。种质资源多样性分析结果为香菇杂交育种工作奠定了基础。     

利用地域野生资源创制地方适栽的优质香菇新品种

香菇是我国深受欢迎的食药用菌,产量居食用菌产业之首。为拓宽栽培香菇菌株的遗传背景,解决现有主栽香菇菌株种性退化的问题,本研究以香菇‘808’菌株与3个香菇野生资源、3个栽培菌株（辽抚4号、BY1和荷香）开展单-双杂交育种,开发适合当地栽培环境的主栽品种。研究结果显示：在270对单-双杂交组合中,通过锁状联合观察和与亲本的拮抗试验,鉴定出89个杂交子,进一步通过栽培试验筛选出10个性状相对优良的候选菌株;最终通过农艺性状对比试验,筛选出ZJXG 5和ZJXG 8两个优良杂交菌株,这两个菌株均以当地长白山野生资源S1和本地主栽菌株BY1为双核杂交亲本选育而来,表现出超亲显著、菇形圆整、颜色呈浅褐色的特性,前4潮生物学效率在86%-88%之间。本研究结果揭示,在香菇杂交育种中,当亲本菌株来源地域与杂交后代菌株筛选地域相近时,单双杂交亲和率、杂交菌株的出菇率和丰产性指标较高,这提示我们,利用当地野生香菇资源更有利于创制适合当地自然环境的地方品种。     

基于质构仪质地多面分析法对香菇质地评价

香菇Lentinula edodes质地是影响其食味品质和货架期的一系列重要品质指标.本研究首次基于质构仪质地多面分析法(TPA),结合传统感官评级对ZX6(浙香6号)和Lsm9两个香菇亲本及其2个杂交菌株(L1*11和L4*6)子实体的不同部位(菌柄P1、菌盖顶部P2、菌盖中心P3和菌盖侧边P4)的7个质地指标和2个...     

硝普钠对香菇多糖代谢及关键酶基因表达的影响

香菇多糖是香菇中特有的生物活性成分。硝普钠在调控食用菌生长方面具有重要影响,但其对香菇生长及多糖合成的影响尚不清楚。本文以香菇新808为研究材料,通过添加不同浓度硝普钠作为外源一氧化氮对新808菌丝的生物量、生长速率、香菇多糖含量、香菇多糖代谢关键酶活性及其表达调控基因相对表达量进行综合研究。结果表明：硝普钠浓度为100 μmol/L可显著提高香菇菌丝生物量,与对照组相比增加了1.61倍;生长速率与对照组无显著差异;香菇菌丝的香菇多糖含量显著提高,为对照组的3.71倍;漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶活性显著提高,分别为对照组的1.73倍、2.23倍和1.55倍;与多糖合成有关的辅助模块酶基因LENED_010207、碳水化合物结合模块基因LENED_012941和多糖裂解酶基因LENED_004566基因相对表达量有所上调,其中LENED_010207基因上调最明显,而多糖合成关键酶基因UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)、葡萄糖磷酸变位酶基因(PGM)与葡萄糖磷酸异构酶基因(PGI)相对表达量均显著下调。在100 μmol/L浓度硝普钠处理下,香菇生物量、多糖含量、多糖代谢关键酶活性及部分多糖合成关键酶的基因相对表达量均显著高于对照组,表明添加适宜浓度的硝普纳能有效地促进香菇多糖的合成,提高香菇多糖的含量。本文为进一步探索香菇多糖的代谢通路提供了理论依据,为选育高多糖含量的香菇新品种提供了新思路,对改进香菇栽培技术有一定的参考意义。     

生长素及其类似物增强香菇耐高温性的研究

高温胁迫影响香菇的品质和产量。以香菇Lentinula edodes热敏感菌株YS3357为试验材料,研究了外源生长素及其类似物对香菇菌丝体高温胁迫下氧化损伤的缓解效应。结果表明,外源添加IAA、NAA和2,4-D能够显著提高热敏感菌株YS3357的耐热能力。外源生长素类物质在一定程度上可以抑制超氧阴离子（O ^2-）产生,降低脂氧合酶（LOX）活性和硫代巴比妥酸反应物（TBARS）含量,提高超氧化物歧化酶（SOD）活性,可能与缓解香菇菌丝体由于高温胁迫所引起的氧化损伤有关。本研究重点探讨外源添加生长素及其类似物对热胁迫下香菇热敏感菌株YS3357菌丝生长、生理特性及抗氧化胁迫能力的影响,为进一步阐明食用菌抗高温胁迫机制奠定了一定的理论基础。     

利用加权基因共表达网络分析方法挖掘香菇发育不同阶段的关键基因

香菇是世界产量第二大食用菌,栽培历史悠久。在木屑袋料栽培模式下,香菇发育可以分为菌丝生长期（G）、菌丝褐化期（B）、原基形成期（P）以及出菇期（FB）4个阶段。褐化期和原基形成期是香菇从营养生长期到生殖生长两个关键发育阶段,对香菇子实体产量和质量至关重要。本研究以3种不同栽培材料为重复,对香菇发育的前3个阶段进行了转录组分析。主成分分析和相似性分析表明,基因随着发育进程的推进,不同栽培基质样本的基因表达特征相似。以菌丝生长阶段的转录本为参照,通过基因差异表达分析,获得与菌丝褐化成熟和原基形成相关的基因,并对这些基因进行GO和KEGG功能富集分析;其次,对9个转录本数据进行加权基因共表达网络分析（WGCNA）,分别获得了与菌丝生长、褐化阶段及原基形成各阶段高度相关的黑色、蓝色及黄色基因模块,并利用网络节点分析获得了与菌丝褐化成熟和原基形成得到7个关键基因;最后,结合差异基因和基因模块分析,得到了菌丝生长阶段的17个重要基因、褐化阶段的167个重要基因以及原基形成阶段的67个重要基因。通过多分析手段结合为筛选候选基因提供了更为高效的方法。     

RNAi法分析香菇邻氨基苯甲酸合酶基因功能

邻氨基苯甲酸合酶（TrpE）是生物体内一种重要的逆境诱导蛋白,其在逆境条件下的响应保证了生物体生存相关产物的正常代谢。本文以香菇Lentinula edodes栽培菌株S606为试验材料,以LeTrpE功能结构保守区域395bp的反向互补片段为干扰片段,构建LetrpE基因双向启动子RNAi载体;采用根癌农杆菌介导转化法侵染香菇菌丝,通过PCR方法检测DNA插入片段,获得11个阳性转化子;实时荧光定量PCR分析结果表明,2个转化子LetrpE基因表达量较野生型菌株下调了2-3倍,确认其为LetrpE基因RNAi转化子;菌丝体在40℃高温处理24h后,检查到吲哚-3-乙酸合成途径中基因LeTam-1在野生菌株S606表达量上调,而在2个RNAi转化子中表达量下调;RNAi转化子菌丝体在25℃下不能恢复生长,而野生型菌丝体可以恢复生长。研究表明,香菇LetrpE基因的功能与耐热性有关。     

香菇菌丝后熟转色的转录组分析

香菇是世界第二大栽培食用菌,其菌丝后熟转色是其特有的栽培过程,并对其产量和品质至关重要。为了进一步了解香菇后熟转色形成的机制,本研究利用Illumina二代高通量测序平台,对初始未转色菌丝(LE118)、光照下转色菌丝(LE313C)、黑暗下未转色菌丝(LE313W)进行转录组测序,以香菇单核体W1-26基因组为参考基因组进行转录组有参分析,共鉴定出2 215个差异表达基因,LE313C比LE118、LE313C比LE313W、LE313W比LE118中分别有1 216、1 507、1 054个基因差异表达。GO富集分析表明,差异表达基因显著富集碳水化合物代谢过程、氧化还原酶活性、水解酶活性、过氧化物酶活性等。KEGG分析发现芳香族化合物的降解在LE313C比LE313W中被显著富集。在LE313C比LE118即香菇菌丝后熟转色发育过程中,筛选出关键差异表达基因包括糖苷酶、疏水蛋白、P450、漆酶、谷氨酸脱氢酶等,表明这些差异基因在香菇菌丝的后熟转色中可能行使重要的生物功能。本研究为进一步研究香菇菌丝后熟及转色形成的机理提供了重要依据。     

不同光质光照对香菇子实体农艺性状与质构品质的影响

香菇Lentinula edodes是世界第一大食药用真菌,随着香菇工厂化生产逐渐规模化、周年化、标准化,香菇工厂对环境集约化及智能化控制的要求也越来越高。光照是香菇生长发育过程中重要的环境因素,本研究将转色后的香菇菌棒分别置于红光（R）、绿光（G）、蓝光（B）、红绿光（RG）、红蓝光（RB）、绿蓝光（GB）、红绿蓝光（RGB）7种光线下照射培养,以黑暗处理（CK）的香菇菌棒作为对照,探究不同光质光照对香菇子实体农艺性状与质构品质的影响。结果表明：红绿蓝光照射下单个菌棒蕾数最多,为24.33个,黑暗处理下蕾数最少,16.17个;蓝光和红绿蓝光照射下子实体产量较高,达到228.12g/棒和220.82g/棒;红光条件下子实体产量最低,为173.53g/棒。不同光质光照对香菇子实体的形态特征有影响,红光和黑暗环境会影响子实体菌盖和菌柄的颜色,使其颜色偏淡,色彩饱和度增加,并且促使菌柄的生长。绿光和蓝光照射下子实体农艺性状和质构品质好。本研究表明蓝光可以作为香菇工厂化生产出菇阶段的首选光质。